海南白沙縣青松鄉(xiāng)人工栽培益智種質(zhì)資源的調(diào)查與分析△

李永輝，王勇，田建平，高炳淼，張俊清*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學院 藥學院，海南 ?？?571199)

·中藥農(nóng)業(yè)·

海南白沙縣青松鄉(xiāng)人工栽培益智種質(zhì)資源的調(diào)查與分析△

李永輝1，2，王勇1，2，田建平2，高炳淼2，張俊清1，2*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學院 藥學院，海南 海口 571199)

目的對海南白沙縣青松鄉(xiāng)栽培的益智種質(zhì)資源進行調(diào)查，對3個主要益智種質(zhì)資源的外觀形態(tài)和次生代謝產(chǎn)物含量進行評價，為益智優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源選育提供基礎。方法測量益智不同種質(zhì)資源葉片的長度和寬度，稱量益智不同種質(zhì)資源的果實粒重，用LC-MSMS分析不同種質(zhì)資源果實中次生代謝產(chǎn)物的含量。結果不同益智質(zhì)資源的葉片長寬度、果實粒重和次生代謝產(chǎn)物含量間具有明顯差異，以圓果益智的質(zhì)量最佳。結論益智不同種質(zhì)資源的外觀形態(tài)和次生代謝產(chǎn)物含量差異較大，圓果益智為優(yōu)質(zhì)品種，建議推廣種植。

益智，種質(zhì)資源，形態(tài)，次生代謝產(chǎn)物

益智AlpiniaoxyphyllaMiq.為姜科多年生草本植物，以果實入藥，別名益智子、智仁及摘艼子，為歷版《中華人民共和國藥典》所收載[1]。具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾之功效[2]。

益智在我國有著悠久的栽培歷史，晉代《南方草木狀》[3]曰：“出交趾合浦。建安八年，交州刺史張津嘗以益智粽餉魏武帝”。北宋《本草圖經(jīng)》[5]記載“益智子，生昆侖國。今嶺南州郡往往有之”?！稏|坡雜記》記載“海南產(chǎn)益智，花實皆作長穗而分三節(jié)，其實熟否，以侯歲之豐歉”，由此可見自晉代以來益智主產(chǎn)于我國兩廣地區(qū)。隨著社會發(fā)展和氣候的變化，益智的適宜生存環(huán)境越來越縮減，目前在海南的瓊中、白沙、保亭等海拔400m以上的山區(qū)有大量栽培，全國90%的藥用益智產(chǎn)自海南省。野生益智零散分布于海南省山區(qū)，存在較多居群，其葉、果實等原植物外形差異較大，生物多樣性復雜[3-4]。在益智的人工栽培種植和優(yōu)選過程中，益智的原植物外形逐漸向一致性轉化。當?shù)厮庌r(nóng)根據(jù)益智不同種質(zhì)資源的生長期青果形態(tài)，分別命名為圓果益智、橢圓果益智和小果益智，其中圓果益智的青果呈近圓形，果實較大；橢圓果益智的青果呈橢圓形或紡錘形，果實大小居于其它兩種益智之中；小果益智青果果實最小，不同益智種質(zhì)資源的青果外形見圖1。

注：A.圓果益智、B.橢圓果益智、C.小果益智圖1 三種不同益智栽培種質(zhì)資源的果實外觀圖

作者在益智的栽培種植技術研究過程中，發(fā)現(xiàn)3種不同的益智種質(zhì)資源除外形相差較大外，其果重、產(chǎn)量和化學成分含量也存在顯著差異。益智中主要功效成分倍半萜、二苯基庚烷和黃酮[5-6]的含量在3個種質(zhì)資源之間也有較大差異。為了進一步研究益智不同種質(zhì)資源之間的質(zhì)量差異，尋找優(yōu)勢種質(zhì)資源，本課題對3種益智種質(zhì)資源的形態(tài)學和化學成分的差異進行了研究，以期為益智的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源尋求提供基礎。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點

本研究共設4個調(diào)查地點，分別是：青松鄉(xiāng)打炳村、牙打村、南雅村和打賀村，采樣地點海拔高度為380～450 m的丘陵地帶，經(jīng)度位于109°14′～109°18′之間，緯度位于19°10′～19°40′之間，屬熱帶季風氣候，年均降水量1725 mm，土壤類型為山地黃壤，益智多間種于5～10年生的橡膠林下。

1.2 調(diào)查方法

結合益智種植栽培情況選擇5～7年生益智，咨詢當?shù)氐乃庌r(nóng)確定調(diào)查點。由于益智間種于橡膠林下，在調(diào)查中，隨機選擇1行做為樣方，每個樣方包含6株益智，每個調(diào)查點選擇20～40個樣方進行調(diào)查。通過咨詢藥農(nóng)確定益智生長年限，測量益智株高、葉片形態(tài)等。

1.3 樣品采集

分析用益智樣品分別采集于青松鄉(xiāng)不同自然村的益智種植基地，均為五年生長期益智，每個栽培的種質(zhì)資源分別采集植物樣品和果實樣品各6份，所有樣品經(jīng)海南醫(yī)學院李友賓研究員鑒定，其基源為姜科山姜屬益智AlpiniaoxyphyllaMiq.。

1.4 形態(tài)比較

分別選取3個不同種質(zhì)資源的益智葉片各10批，用直尺測量葉片的長度、寬度并計算長寬比。選取3個不同種質(zhì)資源的益智種子各10批，每批20粒，干燥后稱重，計算粒重。

1.5 次生代謝產(chǎn)物分析

1.5.1 材料與試劑 益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素均為自制，采用HPLC峰面積歸一化法計算，純度均大于98%；圓柚酮購于西亞化學試劑有限公司，批號M5614。甲醇為色譜純，購于天地公司。其它試劑為分析純。

島津LC-20AD超快液相色譜洗脫：二元泵，在線真空脫氣系統(tǒng)，自動進樣器，柱溫箱。配ABI-4000plus串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測儀。

1.5.2 色譜方法 Waters Xbrige BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相為A(甲醇含0.1%甲酸)-B(水含0.1%甲酸)梯度洗脫：0～10 min，10%B～100%B；流速0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量5 μL。質(zhì)譜檢測條件參照文獻[7]方法，具體參數(shù)見表1。

表1 化合物的質(zhì)譜檢測條件

1.5.3 對照品溶液配制 取圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素和白楊素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

1.5.4 供試品溶液的制備 參照文獻[7]方法，精密稱定干燥至恒重的樣品粉末(過4號篩) 0.5 g，每個樣品平行做3份，置具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定重量，回流提取30 min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取適量用0.45 μm濾膜過濾，即得。

1.5.5 標準曲線的繪制 精密吸取圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素和白楊素對照品溶液，加甲醇制成5.0～1000 ng·mL-1的對照品混合溶液，按照2.1項下色譜方法進行測定。分別以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得5個次生代謝產(chǎn)物的線性回歸方程，見表2。

表2 五個次生代謝產(chǎn)物的標準曲線

1.5.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品工作液5 μL，連續(xù)進樣5次，5個次生代謝產(chǎn)物峰面積的RSD在0.52%和1.53%之間。

1.5.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取益智圓果粉末(樣品2) 6份，按“2.5.4”項方法制備供試品溶液，按“2.5.2”項下條件進行測定，RSD分別在2.6%和3.7%之間。

1.5.8 重復性試驗 精密稱取益智圓果粉末(樣品2) 6份，按“2.5.4”項方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h按“2.5.2”項下條件進行測定，5種次生代謝產(chǎn)物的含量平均值分別為2.24、0.72、0.073、0.025、0.013 mg·g-1。RSD分別在1.2%和4.3%。

1.5.9 加樣回收試驗 稱取已知含量(圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素素) 的益智圓果粉末6 份，每份約0.25 g，分別精密加入圓柚酮、益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素的對照品0.56、0.18、0.018、0.005 8、0.003 2 mg，按照“2.5.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果上述5個分析物的平均回收率分別為：102.6%、101.5%、98.9%、96.4%、94.2%；RSD 分別為1.3%、2.1%、0.89%、2.6%、1.6%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 不同種質(zhì)資源益智葉的形態(tài)學比較

用直尺測量益智葉片的長度和寬度并計算長寬比，觀察統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3。根據(jù)表3可知，不同種質(zhì)資源益智葉的長度在26.5～36.5 cm，寬度3.0～ 6.5 cm之間。三種益智種質(zhì)資源的葉長相差較小，其中圓果益智的長度在33～36cm之間，橢圓果益智的葉長在30～34 cm之間，小果益智的葉長在26～30 cm之間。三種益智栽培品種的葉寬有較大差異(P<0.05)，其中圓果益智的寬度在6.0～6.5 cm之間，橢圓果益智的寬度在4.0～4.5 cm之間，小果益智的葉寬在3.0～3.5 cm之間。

表3 不同益智栽培品種的葉片形態(tài)比較

注：#與圓果益智比較P<0.01，*與橢圓過益智比較P<0.05。

注：A.圓果益智、B.橢圓果益智、C.小果益智圖2 不同種質(zhì)資源益智的葉片典型形態(tài)圖

2.2 不同種質(zhì)資源益智果實的形態(tài)比較

用游標卡尺測量益智果實的粒徑和長度并計算長徑比，用分析天平稱量益智的粒重，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表4。由表4可以看出，不同益智種質(zhì)資源果實的粒徑、長度和粒重有較大差異(P<0.05)。其中圓果益智的粒徑在8.2～11.0 mm之間、長度在15.1～22.0 mm之間，且粒重也最大；橢圓果益智的粒徑在6.9～8.2 mm之間，長度在15.8～18.2 mm之間，粒重居于其它兩種益智果重之間；小果益智的粒徑最小，僅為4.0～7.1 mm，長度在8.1～17.1 mm之間，粒重也最小。

表4 不同益智種質(zhì)資源的果實形態(tài)比較

注：#與圓果益智比較P<0.01，*與橢圓過益智比較P<0.05。

注：A.圓果益智；B.橢圓果益智；C.小果益智圖3 不同種質(zhì)資源益智果實形態(tài)圖

2.3 不同益智種質(zhì)資源中次生代謝產(chǎn)物的含量測定

取3種不同種質(zhì)資源的益智藥材粉末，按“2.5.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.2”項條件下，進樣分析，測定各分析物的峰面積。以外標法計算5個分析物在藥材中的含量。結果見表5。

由表5可以看出，3種益智種質(zhì)資源的次生代謝產(chǎn)物含量差異較大，其中圓果益智中圓柚酮含量最高，小果益智中益智酮甲、楊芽黃素、伊砂黃素含量較高，橢圓果益智中白楊素含量較高。

表5 不同益智種質(zhì)資源的次生代謝產(chǎn)物含量

3 討論

益智為多年生草本植物，在白沙縣青松鄉(xiāng)主要采取公司+基地+農(nóng)戶的推廣種植方式，作者在青松鄉(xiāng)的走訪調(diào)查中發(fā)現(xiàn)益智的種質(zhì)資源對益智的品質(zhì)影響起主要作用，因此優(yōu)選益智優(yōu)質(zhì)種源是保證藥材品質(zhì)的重要因素。通過本項研究，作者向白沙縣農(nóng)業(yè)部門建議重點推廣種植圓果益智，酌情推廣橢圓果益智，逐步淘汰小果益智。

在對3種益智栽培種質(zhì)資源的研究過程中，本人參照文獻方法[8-10]對3個種質(zhì)資源的ITS2序列進行了研究。結果顯示，不同種質(zhì)資源雖然外觀形態(tài)差異較大，但3者的ITS2基因序列完全相同，提示該3個種質(zhì)資源間的基因差異較小。

根據(jù)作者的前期研究結果[11]，圓柚酮主要分布于益智果實的種仁中，二苯基庚烷和黃酮主要分布于益智種皮中的差異性分布規(guī)律，同時結合益智去殼使用的傳統(tǒng)用法，益智種仁中的主要成分圓柚酮應為益智質(zhì)量評價主要參考指標。圓果益智中的圓柚酮含量最高，基本可以確定為質(zhì)量最優(yōu)品種，進行大面積推廣。

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InvestigationandAnalysisofDifferentApliniaoxyphyllaCultivarsinQingsongofBaishaCounty

LI Yonghui1，2，WANG Yong2，TIAN Jianping2，GAO Bingmiao2，ZHANG Junqing1*

(1.HainanProvincialKeyLaboratoryofR&DonTropicPlants，Haikou571199，China；2.SchoolofPharmacy，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To compare the morphological difference of threeApliniaoxyphyllaMiq.cultivars，analyze the contents of secondary metabolites in three cultivars and then find the best cultivars.Methodsthe length and width of leaf and fruit were measured，the fruit mass was weighed，and the contents of secondary metabolites was determined by LC-MSMS.ResultsThe length and width of leaf and fruit，fruit mass and secondary metabolite were significantly different among three cultivars.ConclusionThe quality of round fruitA.oxyphyllawas better than that of the other two cultivars.

AlpiniaoxyphyllaMiq.；cultivars；morphology；secondary metabolites

國家自然科學基金(81560738)，海南省應用技術研發(fā)與示范推廣專項(ZDXM2014071)

*

張俊清，教授，研究方向：中藥新產(chǎn)品研究；Tel:(0898)66893460，E-mail：hy_jqzhang@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.017

2016-12-20)