血根堿對大鼠結(jié)腸炎及炎癥通路中相關(guān)因子的影響△

柳亦松，唐昭山，劉兆穎，蔣昊航，段志貴，曾建國

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081；4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

·基礎(chǔ)研究·

血根堿對大鼠結(jié)腸炎及炎癥通路中相關(guān)因子的影響△

柳亦松1，2，唐昭山1，劉兆穎1，2，蔣昊航1，段志貴3，曾建國2，4*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081；4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

目的探討血根堿對葡聚糖硫酸鈉致潰瘍性結(jié)腸炎的療效及可能的機(jī)制。方法建立葡聚糖硫酸鈉致潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，隨機(jī)分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、血根堿組。觀察各組大鼠體質(zhì)量、腹瀉及隱血情況；通過熒光定量PCR(qPCR)分析炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α在結(jié)腸組織中的表達(dá)量；利用免疫組化實驗檢測NF-κB通路中關(guān)鍵因子p65。結(jié)果與模型組相比，血根堿組和陽性組大鼠的結(jié)腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6表達(dá)降低，而IL-10的表達(dá)升高；同時，免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)血根堿組與模型組相比，其核內(nèi)轉(zhuǎn)入因子核蛋白p65顯著下調(diào)。結(jié)論血根堿可能通過調(diào)節(jié)NF-κB通路中的核轉(zhuǎn)入因子p65，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)，同時提高炎癥因子IL-10的表達(dá)，從而對炎癥起到抑制作用。

血根堿；結(jié)腸炎；炎癥因子；NF-κΒ(p65)

腸道與動物的健康生長有著密切的聯(lián)系，保護(hù)好腸道的健康[1]，對動物生長有著重要的作用。目前動物炎性腸病(IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病，這種疾病防治越來越困難。炎性因子在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)在潰瘍性結(jié)腸炎的血清中顯著增加。IL-10是一種多能干細(xì)胞因子，它在炎癥過程中起重要的抑制作用；在炎癥性腸病患者中，可以檢測到IL-10的表達(dá)水平超出正常值。NF-κB是炎癥發(fā)生的重要信號通路之一[2-3]，尤其對于促炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。NF-κB家族包括5個成員：KRelA(P65)、RelΒ、c-Rel、P(105/50/52)和P100。在未受刺激的細(xì)胞中，NF-κB是以p50和p65二聚體形式處于失活狀態(tài)。刺激后，核蛋白二聚體磷酸化或降解，核轉(zhuǎn)入因子NF-κB由胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核[4]，進(jìn)而產(chǎn)生更大的炎癥反應(yīng)。有文獻(xiàn)表明[5-6]，在炎性疾病患者的結(jié)腸黏膜中巨噬細(xì)胞增加，同時炎癥因子TNF-α，IL-1和IL-6的表達(dá)也增加，表明NF-κB的活化增加了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，有效抑制NF-κΒ途徑、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，有利于減輕炎性疾病。

血根堿是一種主要存在于罌粟科、藍(lán)堇科及蕓香科植物中的苯并菲啶類生物堿，主要來源植物為血水草、博落回和白屈菜，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，具有抗炎、抗菌、促進(jìn)動物生長、抗腫瘤及殺蟲等作用[7-9]，其作為一種植物源成分，還具有低殘留、無環(huán)境污染等優(yōu)點，在獸醫(yī)領(lǐng)域具有抗菌作用和促進(jìn)動物生長等的應(yīng)用前景。近年許多實驗研究表明，血根堿在抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要價值[2-3]。

血根堿(Sanguinarine，SA)圖1 血根堿結(jié)構(gòu)式

潰瘍性結(jié)腸炎臨床癥狀為腹瀉和黏液膿血便等特征，病變在腸道黏膜及黏膜下層，在病變部位形成潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細(xì)胞減少、炎性細(xì)胞浸潤等。常見的人造動物潰瘍性結(jié)腸炎模型有葡聚糖硫酸鈉(DSS)模型、乙酸模型、角叉菜膠模型等。DSS模型廣泛用于研究腹瀉及炎癥[10-12]。該方法采用5% DSS水溶液給大鼠自由飲用，連續(xù)7 d，大鼠的病變從肛門開始自后而前地發(fā)展，黏膜充血水腫，散在性糜爛或潰瘍；在4～5 d出現(xiàn)腹瀉，用隱血試紙檢測成陽性，在5～7 d可出現(xiàn)不同程度的肉眼便血。大鼠出現(xiàn)腹瀉的同時，體質(zhì)量也會減輕，呈現(xiàn)以淋巴細(xì)胞浸潤為主的非特異性炎癥，與人類的潰瘍性結(jié)腸炎(UC)病變類似。本實驗采用DSS模型來驗證血根堿的抑制或緩解大鼠結(jié)腸炎的作用并說明其可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(200±10)g、雄性，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK湘2011-0003。

1.2 主要藥品與試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS，MP Biomedicals，LLC，Cat No.160110 M.W=36 000～50 000)、便隱血(FOB)檢測試紙(艾博生物醫(yī)藥有限公司，批號：2015020127)、柳氮磺吡啶腸溶片(上海中西三維藥業(yè)有限公司，批號：20141115)、98%氯化血根堿(湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，批號：1408011)、羧甲基纖維素鈉CMC-Na(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司，批號：20121015)、qPCR Master Mix 2×(Cat：#K0361)購自Thermo Scientific 公司；動物組織RNA提取試劑盒(Cat：#DP431)購自天根生物科技有限公司；Prime ScriptTM RT Master Mix第一鏈合成試劑盒(Cat：RR036A)購自TaKaRa公司。p65 免疫組化試劑盒(上海科彩生物科技有限公司，批號：20120406)。

1.3 主要儀器

7300熒光定量PCR儀器(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，MILLI-Q純水儀(德國默克-密理博實驗室設(shè)備有限公司)，J12-21M型離心機(jī)(Beckman Model)，CR21型高速立式離心機(jī)(HITACHI)，DRP-9271型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信試驗儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組

選取健康大鼠32只，全部雄性，體質(zhì)量為(200±10)g，恒溫25 ℃適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、血根堿組。

2.2 實驗?zāi)Ｐ徒⑴c給藥方式

第1天到第14天血根堿組和柳氮磺吡啶組大鼠每天分別按體質(zhì)量灌胃75 mg·kg-1的血根堿(該劑量設(shè)定來自于前期研究基礎(chǔ))[10]和225 mg·kg-1的柳氮磺吡啶[13]，灌胃體積為1 mL，空白組、模型組灌胃等體積的CMC-Na溶液；模型組、柳氮磺吡啶組和血根堿組在第8天到第14天自由飲用含5% DSS的蒸餾水，空白組飲用蒸餾水。

2.3 實驗觀察與記錄

每天定時(早上9時)稱量并記錄每只大鼠體質(zhì)量，大便性狀及出血級別，并計算每只大鼠的日常疾病活動指數(shù)(DAI)。DAI具體評分指標(biāo)見表1，DAI=(體質(zhì)量+大便性狀+便血)評分/3。

表1 DAI具體指標(biāo)評價方法

注：大便正常：正常成形的；大便松軟：黏糊狀，但并不黏在肛門上；腹瀉：糞便呈液體狀，在肛門處有殘留；糞便潛血檢測：使用便隱血(FOB)快速檢測試紙檢測。

2.4 動物處理

第15天處死大鼠，取出結(jié)腸，一部分保存于甲醛溶液中，用于觀察結(jié)腸部位的病理變化；一部分結(jié)腸組織和血清于-80 ℃保存，用于炎癥因子的檢測。

2.5 熒光定量PCR

總RNA提取：每組大鼠結(jié)腸組織各自于-80 ℃取50 mg立即放入裝有液氮的研缽，用研缽棒研磨成粉末狀，加入RNA提取試劑盒對應(yīng)量體積的RL裂解液，后續(xù)步驟按試劑盒提取操作說明，獲得總RNA。各組取1 μg RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。利用表2設(shè)計好的引物對炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α進(jìn)行熒光定量(qPCR)分析。qPCR條件：95 ℃ 30 s 1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理，對每個組織設(shè)立3個重復(fù)，首先計算各組織的目的基因與β-actin的Ct差值，即ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，選取空白組的平均ΔCt作為對照，用其他基因的ΔCt減去其平均ΔCt，即為ΔΔCt；2-ΔΔCt表示各組織基因的表達(dá)相對于空白組基因的變化倍數(shù)。

2.6 免疫組化和HE染色

2.6.1 石蠟制片 取保存在10%甲醛溶液中的結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟切片：第一步，石蠟包埋，取結(jié)腸組織進(jìn)行方塊修整用紗布包好置流水下沖洗過夜，再進(jìn)行70%、80%、95%、100%乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯進(jìn)行透明，置于溶好的石蠟中進(jìn)行包埋。第二步，將包埋好的組織在切片機(jī)上切成厚度4 μm并貼片到載玻片上。制成好的切片將進(jìn)行HE染色和免疫組化。

表2 相關(guān)炎癥因子的引物

2.6.2 免疫組化 切片脫蠟、水化：二甲苯10 min→100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→85%乙醇5 min→80%乙醇5 min→75%乙醇5 min→60%乙醇5 min→50%乙醇5 min→30%乙醇5 min→自來水1 min；PBS洗2～3次各5 min；3%H2O2(80%甲醇)滴加在切片上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次各5 min。抗原修復(fù)：利用枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)在微波爐中加熱至沸騰，然后將脫臘、水化的組織切片放入，斷電，間隔5～10 min，反復(fù)1～2次；PBS洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，甩去多余液體；滴加Ι抗(p65抗體)50 μL，室溫靜置1 h或4 ℃過夜或37 ℃ 1 h；4 ℃過夜后需在37 ℃復(fù)溫45 min；PBS洗3次每次2 min；滴加Ⅱ抗45～50 μL，室溫靜置或37 ℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明，30%乙醇3 min→50%乙醇3 min→70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→95%乙醇3 min→100%乙醇3 min→二甲苯20 min；封片、鏡檢。免疫組化后觀察p65蛋白在結(jié)腸中的表達(dá)情況。

免疫組化結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)：1)陽性著色細(xì)胞數(shù)：每只大鼠觀察5張切片、每張切片上觀察5個高倍視野(×200)，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。2)陽性著色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。3)兩者計分相乘即為陽性等級。

2.6.3 HE染色 脫蠟：二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ5 min；水化：100%乙醇Ⅰ5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ5 min→95%乙醇Ⅱ5 min→85%乙醇3 min→5%乙醇2 min→蒸餾水沖洗1 min；染色：蘇木精染色5 min→自來水洗→鹽酸乙醇分化15 s→自來水洗15 min→蒸餾水洗2 min→75%乙醇2 min→85%乙醇2 min→0.5%伊紅染色1 min→95%乙醇Ⅰ5 min→95%乙醇Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min；封片：中性樹膠封片，上述處理好的玻片，取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下去，避免發(fā)生氣泡。HE染色后觀察結(jié)腸組織病理情況。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 DAI指數(shù)

注：與模型組相比，*P<0.05；下同。圖2 各組大鼠DAI

3.2 炎癥因子的表達(dá)

圖3 IL-1β炎癥因子表達(dá)

圖4 IL-6炎癥因子表達(dá)

圖5 TNF-α炎癥因子表達(dá)

圖6 IL-10抑炎因子表達(dá)

3.3 HE染色和免疫組化

3.3.1 HE染色 根據(jù)圖7可見空白組杯狀細(xì)胞較多，具有紋狀緣；模型組紋狀緣消失，杯狀細(xì)胞減少，并且有許多炎性細(xì)胞產(chǎn)生。該實驗結(jié)果表明葡聚糖硫酸鈉對大鼠造模成功，符合實驗預(yù)期結(jié)果。

注：A.空白組；B.模型組。圖7 大鼠結(jié)腸組織HE染色

3.3.2 免疫組化 空白組大鼠NF-κB(p65)蛋白陽性細(xì)胞正常表達(dá)(見圖8A)，模型組中NF-κB(p65)蛋白陽性細(xì)胞最多(見圖8B)；血根堿組(見圖8C)和陽性組(見圖8D)NF-κB(p65)蛋白陽性細(xì)胞低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但高于空白組。通過表3組織免疫評分結(jié)果分析：模型組陽性等級為強(qiáng)陽性(+++，10.26±1.61)，血根堿組的陽性等級為弱陽性(+，3.20±0.96)，統(tǒng)計學(xué)分析P=0.009，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，血根堿組大鼠炎癥情況明顯得到了緩解，趨于正常大鼠。結(jié)果表明在正常情況下，大鼠炎癥因子NF-κB(p65)也有表達(dá)，在給予血根堿后大鼠炎癥因子NF-κB(p65)表達(dá)顯著降低。分析血根堿可能降低炎癥因子NF-κB(p65)表達(dá)，抑制或緩解炎癥發(fā)生。

注：A.空白組；B.模型組；C.血根堿組；D.陽性組；箭頭指的為陽性細(xì)胞。圖8 大鼠NF-κB(p65)蛋白免疫組化

組別 陽性等級NF?κB(p65)(x±s)空白組+213±074模型組+++1026±161血根堿預(yù)防給藥組+320±096??陽性藥物預(yù)防給藥組++640±128??

注：與模型組相比，**P<0.01。

4 討論

本研究主要基于葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型，這種結(jié)腸炎造模方式已經(jīng)得到了大量的實驗驗證，并且被普遍接受[12-13]。在此基礎(chǔ)之上，實驗通過預(yù)防灌胃75 mg·kg-1·d-1血根堿14 d，其中在第8天進(jìn)行DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型，大鼠的DAI與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。該結(jié)果表明血根堿在臨床癥狀上能起到影響體質(zhì)量、減緩便血的產(chǎn)生，說明血根堿對治療大鼠結(jié)腸炎具有一定的保護(hù)作用。

DAI測量的指標(biāo)主要包括體質(zhì)量、糞便的軟硬和糞便中的隱血[13]，這3個指標(biāo)能夠較好地反映所檢測動物的生理機(jī)能。本實驗中的結(jié)果表明，血根堿能夠顯著減緩葡聚糖硫酸致大鼠炎癥的產(chǎn)生和增強(qiáng)大鼠對疾病的抵抗，在生長過程中保持健康。動物臨床表現(xiàn)為血根堿組大鼠較模型組的大鼠更活躍和日增重高。該結(jié)果說明血根堿能夠預(yù)防動物疾病和保持動物的日增重。

組織病理變化能較客觀地反映機(jī)體的防御表現(xiàn)。在免疫系統(tǒng)中上皮細(xì)胞具有先天的天然屏障作用，同樣也具有許多與免疫相關(guān)的細(xì)胞，比如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞，這些細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變對機(jī)體免疫的第一道防御功能具有重要意義。該實驗病理切片表明，血根堿能較好地保護(hù)上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞，能使得杯狀細(xì)胞的形態(tài)保持完整，同時保障其發(fā)揮正常的生理反應(yīng)。

白介素調(diào)節(jié)因子(IL)和腫瘤壞死因子(TNF-α)在機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有非常重要的作用，如IL-1、IL-6和IL-10在炎癥通路上能影響NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)，從而影響NF-κB炎癥通路。在該實驗中，我們從熒光定量和免疫組化的實驗結(jié)果來看，血根堿可能抑制IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)，聯(lián)級反應(yīng)后能使NF-κB的表達(dá)降低。從機(jī)體中多種蛋白質(zhì)分子中的表達(dá)來看，血根堿在抑制炎癥上可能是通過下調(diào)IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)來抑制炎癥的產(chǎn)生。同樣，IL-10在炎癥通路上是抑制炎癥發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。因此該實驗表明，血根堿能夠顯著提高IL-10調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。基于以上結(jié)果，我們認(rèn)為血根堿不僅能下調(diào)促炎因子的表達(dá)，還能提高抑炎因子的表達(dá)，通過這兩條途徑來共同減緩炎癥的發(fā)生發(fā)展。血根堿通過影響白介素和腫瘤壞死因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥的變化，是否還通過其他途徑來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)制，還需要結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等動態(tài)變化分析技術(shù)進(jìn)行更深入的研究。

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EffectsofSanguinarineonInflammatoryFactorsinRatColitisandInflammatoryPathway

LIU Yisong1，2，TANG Zhaoshan1，LIU Zhaoying1，2，JANG Haohang1，DUAN Zhigui3，ZENG Jianguo2，4*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.NationalandProvincialUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.CollegeofLifeScience，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China；4.HunanCo-innovationCenterforUtilizationofBotanicalsFunctionalIngredients，Hunan，Changsha410128，China)

Objective：To explore the regulatory effect of sanguinarine on inflammation，and provide the foundation for research of sanguinarine for its anti-inflammatory effect.MethodsWith dextran sulfate sodium induced colitis in rats as a model，the regulating mechanism of sanguinarine on rat body weight，diarrhea and colitis and the occult blood detection factor was observed.The expression of IL-1，IL-6，IL-10 and TNF-αin colonic tissue was analyzed by fluorescence quantitative PCR (qPCR).ResultsCompared with the model group，the nuclear factor p65 protein in the sanguinarine group significantly decreased.ConclusionSanguinarine can up-regulate IL-10 and down-regulate IL-1β，IL-6，and inhibits inflammation.The nuclear factor p65 was also down-regulated.

Sanguinarine；colitis；inflammatory factors；NF-κΒ(p65)

國家自然科學(xué)基金(31200615)；國家重點實驗室培育基地開放項目(15KFXM09)

*

曾建國，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.008

2017-02-26)