基于UHPLC-QTOF/MS的博落回花中生物堿類化學成分研究△

黃嘉璐，劉秀斌，鄭亞杰，鄒超蘭，2，唐昭山，曾建國，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·基礎(chǔ)研究·

基于UHPLC-QTOF/MS的博落回花中生物堿類化學成分研究△

黃嘉璐1，劉秀斌1，鄭亞杰1，鄒超蘭1，2，唐昭山3，曾建國1，2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；
2.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；3.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

目的利用高通量、高靈敏和快速的UHPLC-QTOF/MS技術(shù)開展博落回花中的微量生物堿類成分的定性研究，闡明博落回花中生物堿類化學成分的類別和種類，為博落回植物的安全性提供科學依據(jù)。方法采用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)，借助數(shù)據(jù)挖掘方法發(fā)現(xiàn)和識別出博落回花中的微量生物堿類化學成分，對其高分辨一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行解析，并與數(shù)據(jù)庫進行比對，完成對微量生物堿類化學成分的結(jié)構(gòu)推測和確認。結(jié)果從博落回花中共鑒定了22個生物堿類化合物，主要化學成分為普洛托品類生物堿(原阿片堿、別隱品堿)和四氫原小檗堿類生物堿(N-甲基刺罌粟堿、N-甲基四氫小檗堿)。結(jié)論該研究結(jié)果為博落回植物的更全面、客觀的品質(zhì)評價和安全性評價提供了充分的科學依據(jù)。

博落回花；生物堿；UHPLC-QTOF/MS；定性分析

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.為罌粟科博落回屬多年生草本植物，全草皆可入藥，但有一定毒性[1-3]。博落回主要分布在我國長江以南、南嶺以北的山坡、路邊及溝邊，花期為6—7月[4]。博落回作為有毒蜜源植物[5-7]，國內(nèi)文獻中報道的多起食用蜂蜜中毒事件，因在有毒蜂蜜中發(fā)現(xiàn)博落回花粉，懷疑博落回是蜂蜜中毒性成分的來源[8-10]。本研究團隊基于前期對博落回植物化學成分的安全性評價研究[11]，結(jié)合有關(guān)文獻[12-13]，認為食用蜂蜜導(dǎo)致中毒的根本原因與博落回沒有關(guān)系。對于博落回在食品安全國家標準(GB 14963-2011)中明確被禁止作為蜜源植物的規(guī)定，作者認為可商榷分類且不納入危險級別。博落回中生物堿類成分被認為是主要的毒性成分，然而迄今僅有博落回果莢、莖、葉和根中化學成分及其毒性的研究報道[14-17]，博落回花中化學成分的類別和含量還尚未見報道。

UHPLC-QTOF/MS技術(shù)因具有分析速度快、靈敏度高和專屬性強等特點，在中藥材等復(fù)雜樣品中微量或痕量成分分析方面具有顯著的優(yōu)勢。本研究利用UHPLC-QTOF/MS開展博落回花中生物堿類化學成分的定性分析研究，為闡明博落回花中生物堿類等化學成分，以及博落回植物的品質(zhì)評價和安全性評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀-6530四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(UHPLC-QTOF MS，美國Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理軟件為Masshunter；METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器)；MI-Q超純水機(貝徠美生物公司)；0.22 μm有機相/水相通用針式濾器及液相樣品瓶(北京八方世紀科技有限公司)；無菌注射器(圣光醫(yī)用制品)；50 mL離心管(CORNING CentriStar公司)。

1.2 試藥與試劑

博落回花采自國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學曾建國教授鑒定為博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.的花。甲醇(色譜純，美國Merck)；甲酸(色譜純，美國TEDIA)；水為Milli-Q超純水；生物堿對照品來源詳見表1。

表1 生物堿對照品來源信息

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：華譜XAqua C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫見表2；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL；檢測波長：287 nm。

表2 梯度洗脫色譜條件

質(zhì)譜條件：掃描模式：ESI+全掃描模式；毛細管電壓：3500 V；干燥氣溫度：345 ℃；干燥氣體積流量：10 L·min-1；脫溶劑溫度：350 ℃；掃描范圍m/z：100～1200 Da；二級裂解電壓：20～45 eV。參比溶液中含嘌呤(C5H4N4，m/z：121.050 873)和HP-0921(C18H18O6N3P3F24，m/z：922.009 798)。

2.2 樣品預(yù)處理

于6月上旬摘取新鮮博落回花，立即放入液氮中冷卻，用液氮磨成粉狀后進行供試溶液制備。

2.3 供試品溶液的制備

稱取液氮研磨成粉狀的博落回花約1.0 g，置于具塞玻璃錐形瓶中，加入甲醇25 mL，30 ℃超聲30 min，靜置后取上清液6500 r·min-1離心10 min，繼續(xù)取上清液過0.22 μm有機相膜于液相小瓶內(nèi)，備用。

2.4 對照品溶液的制備

取上述對照品各約5 mg，精密稱定，分別加入甲醇超聲溶解后定容至25 mL，吸取適量用甲醇稀釋制成約1 μg·mL-1的單標溶液。

2.5 數(shù)據(jù)挖掘方法

供試品溶液按2.1項中LC-MS條件進行分析檢測，利用Agilent MassHunter workstation Software(version B.05.00)軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理。將全掃描模式的一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MassHunter軟件中分子特征查找(Find by Molecular Feature，MFE)功能，對博落回花樣品中所含的未知化合物進行查找。MFE參數(shù)設(shè)置：正離子形態(tài)為M+、[M+H]+或[M+Na]+；電荷數(shù)為1～2，化合物最低絕對峰高為3000 counts；保留時間范圍設(shè)定為3～27 min；化合物同位素質(zhì)量偏差范圍為0.002 5 Da；目標化合物類型為小分子有機化合物。

對疑似生物堿類成分的推測，在MFE查找出的化合物列表中，首先通過與隨行的空白樣品數(shù)據(jù)進行比對，去除干擾信息。接著與文獻報道的以及課題組前期整理的博落回生物堿類成分數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的精確分子量、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對，對可能的生物堿類成分進行初步確認。最后對可能的生物堿類成分通過與其對應(yīng)的對照品進行LC-MS/MS確認，對它們的M+或[M+H]+的精確分子量(m/z)、保留時間和MS/MS譜進行對比分析，若查找化合物的m/z及保留時間與生物堿對照品的偏差分別在0.001 0 Da和0.15 min內(nèi)，則可初步確定該化合物與生物堿對照品為同一化合物，MS/MS譜可進一步提高化合物推測結(jié)果的準確度。

3 結(jié)果與分析

3.1 分析條件的建立

在本課題組前期工作基礎(chǔ)上[18]，本研究對色譜分離條件進行了優(yōu)化，保證色譜圖上色譜峰具有好的峰形和分離。如圖1所示，在總離子流中各色譜峰分離度適中，主要色譜峰均達到基線分離，色譜峰信號響應(yīng)良好。

3.2 數(shù)據(jù)挖掘

對UHPLC-QTOF/MS采集的博落回花的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MFE進行化合物查找，共發(fā)現(xiàn)了331個化合物信號。將發(fā)現(xiàn)的這些化合物信號，與空白樣品和對照樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對，剔除了來自溶劑等背景干擾信號；結(jié)合文獻報道[19]及課題組前期整理的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的生物堿類化合物的M+、[M+H]+及[M+Na]+等精確質(zhì)量數(shù)，對樣品的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行提取離子操作，共發(fā)現(xiàn)了22個可能的生物堿類化學成分，詳細數(shù)據(jù)見表3。

3.3 生物堿類成分推測結(jié)果的確認

通過購買或?qū)嶒炇液铣色@取了上述推測的22個生物堿類化合物的對照品或純品。通過UHPLC-QTOF MS/MS對樣品中發(fā)現(xiàn)的可能生物堿類化合物與其對應(yīng)的標準品或純品進行比較分析，重點比較提取離子色譜峰的保留時間、一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)、二級質(zhì)譜中產(chǎn)物離子的質(zhì)量數(shù)和豐度等信息(見圖2)的一致性。結(jié)果，上述推測的22個生物堿類化合物信息與對照品或純品相一致(見表3)，表明本研究所推測的結(jié)果是準確的和可靠的。

圖1 博落回花UHPLC-QTOF MS總離子流圖

圖2 化合物9提取離子色譜圖及相關(guān)質(zhì)譜圖

色譜峰編號tR/min[M+H]+/M+(m/z)質(zhì)量偏差元素組成MS/MS[m/z，豐度(%)]化合物名稱145422721278-1102C16H17NO3123(628)，161(725)，143(986)，115(1255)，107(10000)去甲基衡州烏藥堿252773161526-7908C18H21NO4137(1945)，175(2076)，143(4526)，192(5814)，123(10000)3?羥基?N?甲基衡州烏藥堿358282861437-0699C17H19NO3209(689)，194(711)，143(1066)，115(1044)，107(10000)衡州烏藥堿4602930015970999C18H21NO3237(969)，209(1014)，175(1047)，143(1251)，107(10000)(S)?N?甲基衡州烏藥堿566223301699-0303C19H23NO4177(1866)，175(2129)，143(3573)，137(6543)，192(10000)網(wǎng)脈荔枝堿6731532815460914C19H21NO491(358)，119(364)，151(1045)，163(1256)，178(10000)金黃紫堇堿7796632613890613C19H19NO4155(1501)，171(1616)，151(2432)，170(4674)，178(10000)碎葉紫堇堿8851734217030877C20H23NO4176(243)，165(253)，151(656)，163(1208)，178(10000)四氫非洲防己堿9929435413431977C20H19NO5206(1760)，275(2172)，149(3798)，188(9366)，189(10000)原阿片堿

表3(續(xù))

在假定所有生物堿類化合物的質(zhì)譜信號響應(yīng)一致的前提下，對發(fā)現(xiàn)的22個化合物的提取離子色譜圖進行比較分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)博落回花中所含的生物堿類次生代謝產(chǎn)物主要有原阿片堿(9)、別隱品堿(10)、(s)-cis-N-甲基刺罌粟堿(12)和(s)-cis-N-甲基四氫小檗堿(14)等。

4 討論

博落回中主要含有生物堿、黃酮、三萜等類次生代謝產(chǎn)物[14，20-21]，其中生物堿類成分既是有效活性成分也是毒性成分[22-24]。博落回安全性研究發(fā)現(xiàn)，博落回總堿的小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗LD50值為1657 mg·kg-1[12]；博落回生物堿硫酸鹽是博落回果莢提取物精制而成的，主要含有血根堿和白屈菜紅堿，該藥品通過小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗的LD50值，水溶液為900 mg·kg-1，水混懸液為1043 mg·kg-1[13]；博落回提取物PE50(主要含有原阿片堿和別隱品堿)的小鼠經(jīng)口給藥的急性毒性試驗LD50值為426.1 mg·kg-1，屬中等毒性[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)博落回花中主要含有原阿片堿和別隱品堿等普洛托品類生物堿，以及四氫原小檗堿類生物堿(N-甲基刺罌粟堿、N-甲基四氫小檗堿)。由于該類生物堿具有一定的毒性，按有毒蜜源植物標準，應(yīng)在博落回花期采取相應(yīng)措施以達到減少蜜蜂采集該植物花蜜的目的。但該類生物堿毒性與相關(guān)植物如雷公藤、鉤吻相比較低得多，因此建議考慮對有毒蜜源標準進行危險分級，以免誤導(dǎo)毒源的判定。在蜜蜂采集博落回花蜜后，經(jīng)過自身生物作用和貯存期間的物理或化學變化，需要進一步對殘留在蜂蜜中的生物堿含量進行定量分析，繼而才能精準地對博落回作為有毒蜜源植物做出更為客觀的毒性評價。博落回植物為全草入藥，對其花中化學成分的闡明，可為該植物的全面品質(zhì)評價提供很好的參考依據(jù)。

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IdentificationofAlkaloidsinFlowersofMacleayacordata(Willd)R.Br.byUHPLC-QTOF/MS

HUANG Jialu1，LIU Xiubin1，ZHENG Yajie1，ZOU Chaolan1，2，TANG Zhaoshan3，ZENG Jianguo1，2 *

(1.Horticulture&LandscapeCollegeofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.CollegeofPharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；3.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Objective：To elucidate the minor alkaloids in the flower ofMacleayacordatabyusing the ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS) for safety evaluation ofM.cordata.MethodsThe alkaloids were found and identified through the serious data mining，structural speculation on basis of the careful analysis of the MS and MS/MS data，and confirmed by comparison with the reference standards and library.ResultsThere were total 22 alkaloids found in the flower ofM.cordataincluding protopines and tetrahydroprotonerberines，the main alkaloids including protopine，allocryptopine，N-methyltetrahydroberberine，N-methyltetrahydropapaverine.ConclusionThe results provide sufficient scientific evidence for evaluating its quality and safety of the flowers fromM.cordatacomprehensively and objectively.

Flowers ofMacleayacordata；alkaloid；UHPLC-QTOF/MS；qualitative analysis

國家自然科學基金(31600238)；湖南省教育廳科學研究項目(16C0769)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2014B302)；湖南省科技重點計劃(2016SK3002)

*

曾建國，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.005

2017-02-20)