GLI1與胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的關(guān)系及臨床研究

林智平++++++段炤

[摘要]目的 觀察GLI1表達(dá)與胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的關(guān)系。方法 收集2006年1月～2011年12月診斷明確、資料完整的58例手術(shù)切除胃癌標(biāo)本，做成組織芯片，采用免疫組化SP的方法檢測組織芯片中胃癌組織及正常胃黏膜組織中GLI1、E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)。結(jié)果 GLI1在胃癌中表達(dá)較正常組織高，與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；E-cadherin在正常胃黏膜組織表達(dá)比胃癌組織高，與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；N-cadherin在胃癌中表達(dá)高于正常胃黏膜組織，與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；GLI1表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的狀態(tài)有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 在胃癌組織中GLI1表達(dá)與E-cadherin、N-cadherin有關(guān)，提示GLI1可能參與了EMT過程。

[關(guān)鍵詞]胃癌；GLI1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）10（b）-0049-04

[Abstract]Objective To observe the relationship between GLI1 expression and epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer.Methods 58 cases of gastric cancer specimens who were given surgical resection with clear diagnosis and complete data from January 2006 to December 2011 were collected，and tissue microarray was made.The expression of GLI1，E-cadherin and N-cadherin in gastric carcinoma and normal gastric mucosa in tissue microarray were detected by immunohistochemical SP method.Results GLI1 expression in gastric cancer was higher than that in normal tissues （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.The expression of E-cadherin in normal gastric mucosa was higher than that in gastric cancer （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.The expression of N-cadherin in gastric cancer was higher than that in normal gastric mucosa （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.GLI1 expression was associated with epithelial-mesenchymal transition，with significant difference （P<0.01）.Conclusion The expression of GLI1 in gastric cancer is associated with E-cadherin and N-cadherin，indicating that GLI1 may be involved in the EMT process.

[Key words]Gastric cancer；GLI1；Epithelia-mesenchymal transition

胃癌（gastric cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球常見癌癥中居第4位，在癌癥相關(guān)死因中居第2位，每年因胃癌死亡者約70萬例[1]；其在我國常見癌癥中居第2位，在癌癥死因中居第3位[2]。我國中晚期胃癌患者術(shù)后5年的生存率為20%～30%，早期胃癌患者的生存率最高為85%～100%[3-4]。決定患者生存率的主要因素是轉(zhuǎn)移，因此尋找腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物是臨床研究的方向。研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelia-mesenchymal transition，EMT）現(xiàn)象及SHH信號通路中的GLI1表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是一種基本的生理病理現(xiàn)象，其表達(dá)上調(diào)的因子主要是N-cadherin，表達(dá)下調(diào)的因子主要是E-cadherin。本研究以胃癌標(biāo)本作為研究對象，采用免疫組化檢測胃癌中SHH信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子GLI1及E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)情況，現(xiàn)報道如下。endprint

1對象與方法

1.1研究對象

收集我院病理科存檔，2006年1月～2011年12月診斷明確、資料完整的58例手術(shù)切除胃癌標(biāo)本，所有患者術(shù)前未經(jīng)放療及抗癌化學(xué)藥物治療，其中男性38例，女性20例；按照WHO胃癌組織分類及分級標(biāo)準(zhǔn)歸納，分化類型：低分化24例，中高分化34例；按TNM進(jìn)行分期，其中Ⅰ+Ⅱ期有31例，Ⅲ+Ⅳ期有27例；按Lauren進(jìn)行分型，其中腸型30例，彌漫型28；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組39例，無轉(zhuǎn)移組21例。同時選取15例正常胃黏膜用作對照。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2試劑

GLI1抗體購自深圳華拓公司，E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、SABC（兔IgG）-POD試劑盒、SABC（小鼠IgG）-POD kit、DAB顯色試劑盒（黃）購自武漢博士德公司。

1.3免疫組化染色

所有標(biāo)本經(jīng)100%甲醛固定，石蠟包埋，制作成組織芯片，HE染色，SP法免疫組化。

1.4結(jié)果判定

①GLI1陽性的表達(dá)：定位于細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和（或）胞核上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。計算染色細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。染色細(xì)胞≥20%為陽性，<20%為陰性[5]。②E-cadherin：蛋白的陽性表達(dá)呈棕褐色，主要定位于細(xì)胞膜，或圍繞細(xì)胞膜呈線形。結(jié)果判斷參照Sulzers分級法，陽性細(xì)胞<10%為陰性；≥10%為陽性[6]。③N-cadherin：以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中棕黃色為陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行分級，<10%為陰性，≥10%為陽性[7]。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GLI1在胃癌組織中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系分析

GLI1在正常胃黏膜組織中的表達(dá)率為20%，在胃癌組織中的表達(dá)率為83%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。GLI1陽性表達(dá)率與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系分析

E-cadherin在正常胃黏膜中的表達(dá)率為80%，在胃癌組織中的表達(dá)率為36%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。E-cadherin陽性表達(dá)率與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3 N-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系

N-cadherin在正常胃黏膜中的表達(dá)率為11%，在胃癌組織中的表達(dá)率為43%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。N-cadherin陽性表達(dá)率與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.4胃癌組織中GLI1表達(dá)EMT狀態(tài)的關(guān)系

參考David Sarrio的方法，選擇E-cadherin表達(dá)陰性同時N-cadherin表達(dá)陽性的病例作為發(fā)生EMT過程，記為EMT（+）。在58例胃癌中，EMT陽性表達(dá)率為45%，使用Kendall tau-b相關(guān)分析顯示，GLI1與EMT的狀態(tài)有一定關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

3討論

EMT的概念最早于1982年，由Greenburg和Hay[8]在研究中提出。其是一種復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，在多種病理生理過程（如損傷、修復(fù)、炎癥、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等）進(jìn)展中發(fā)揮了重要意義。在正常情況下，EMT的發(fā)生是受到機體調(diào)控的，然而在腫瘤中，因喪失了機體正常調(diào)控作用，腫瘤細(xì)胞通過EMT形式獲得侵襲能力并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Thiery[9]采用EMT現(xiàn)象來描述癌的發(fā)生及發(fā)展，具體為：正常上皮細(xì)胞沿著基底膜生長，通過表現(xiàn)遺傳學(xué)改變或基因的改變，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化生成原位癌；繼續(xù)發(fā)展，癌細(xì)胞通過EMT形成局部擴散，基底膜變脆，細(xì)胞侵入淋巴管及血管，發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成轉(zhuǎn)移癌。EMT是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一個重要的過程[10]。在各類細(xì)胞中，EMT現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、口腔癌、肝癌等多種癌癥的原位浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[11]。余韜等[12]發(fā)現(xiàn)EMT在腫瘤發(fā)生、腫瘤演進(jìn)中也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin、N-cadherin表達(dá)水平與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關(guān)，提示胃癌發(fā)生與E-cadherin表達(dá)下調(diào)及N-cadherin上調(diào)有關(guān)，E-cadherin、N-cadherin對維持細(xì)胞間連接和極性起著重要作用，影響腫瘤細(xì)胞的生存與增殖，也提示E-cadherin、N-cadherin是EMT途徑的重要標(biāo)志。

Hedgehog信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]。Hedgehog信號通路之一的SHH信號通路表現(xiàn)出持續(xù)性激活并調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管形成，參與腫瘤的形成。SHH通路較為復(fù)雜，主要由分泌型信號糖蛋白SHH、跨膜蛋白受體PTCH和另一跨膜蛋白SMO以及轉(zhuǎn)入因子蛋白GLI1及下游靶基因組成[15-17]。PTCH結(jié)合SHH蛋白，解除了對SMO的抑制，抑制GLI1的水解。GLI1是整個信號通路中最關(guān)鍵的信號分子，功能性激活均會使該信號通路持續(xù)激活，全長的GLI1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，致使細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。生物化學(xué)研究顯示，GLI1因缺乏磷酸化和剪切修飾所必須的蛋白激酶A識別位點，因此僅有激活子功能，直接調(diào)控著該通路靶基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)以往的文獻(xiàn)，以GLI1的核染色作為這一信號通路活化的標(biāo)志，以GLl1陽性細(xì)胞百分比增加作為判斷這一信號通路活化程度提高的指標(biāo)[19]。倪卓然等[20]發(fā)現(xiàn)，異常激活的Hedgehog通路中GLI1可能參與了調(diào)控Snail、Ecadherin的表達(dá)，通過調(diào)控EMT的發(fā)生，促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Yanai等[21]發(fā)現(xiàn)，GLI1蛋白表達(dá)與體現(xiàn)胃癌侵襲力的三項指標(biāo)（浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期）密切相關(guān)，侵襲力強的胃癌組織中的GLI1蛋白表達(dá)增強，并且在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中GLI1顯著激活，暗示著SHH通路活化的胃癌可能具有較高的轉(zhuǎn)移潛能。本研究結(jié)果顯示，GLI1陽性表達(dá)與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ+Ⅳ期、彌漫型、低分化的患者其GLI1陽性率明顯增高，提示GLI1可作為胃癌的一個有效觀察標(biāo)志，有助于病情的判斷。GLI1在胃癌組織細(xì)胞中的表達(dá)高于正常胃黏膜的表達(dá)，兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GLI1有可能作為一種調(diào)控胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，從而對胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移起相關(guān)性作用。endprint

在本研究中，GLI1和N-cadherin在胃癌中表達(dá)較正常組織高，E-cadherin在正常胃黏膜組織表達(dá)比胃癌組織高。GLI1表達(dá)與EMT的狀態(tài)有關(guān)。隨著研究的進(jìn)展，胃癌中Hedgehog通路調(diào)節(jié)EMT過程的機制愈發(fā)明晰，靶向干涉或阻斷Hedgehog通路，將為胃癌的臨床治療提供一個更為廣闊的應(yīng)用前景。

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