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    葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究

    2017-11-20 02:48:03江連洲張瀟元張菀坤全惟誠王中江
    中國食物與營養(yǎng) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:能力

    江連洲,張瀟元,伍 丹,張菀坤,張 璟,盧 燕,全惟誠,米 思,劉 爽,王中江

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)

    葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究

    江連洲,張瀟元,伍 丹,張菀坤,張 璟,盧 燕,全惟誠,米 思,劉 爽,王中江

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)

    以綠豆分離蛋白(MBPI)和葡聚糖為原料,通過濕熱法制備MBPI-Dextran共價復(fù)合物。本研究通過測定產(chǎn)物的還原力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力共同評價糖基化反應(yīng)對MBPI抗氧化能力的影響。結(jié)果表明:MBPI-Dextran共價復(fù)合物具有一定的抗氧化能力,特別是90℃條件下反應(yīng)得到的產(chǎn)物,抗氧化能力較80℃產(chǎn)物顯著提升,這與美拉德反應(yīng)程度有關(guān),較高溫度下美拉德反應(yīng)進程加快,促使更多具有抗氧化能力的物質(zhì)生成。因此,糖基化改性后的綠豆蛋白在抗氧化能力研究上具有一定的應(yīng)用價值。

    綠豆蛋白;葡聚糖;糖基化處理;抗氧化性

    不同品種的綠豆中蛋白含量為20%~30%[1],所含蛋白質(zhì)中60%以上都是水溶性球蛋白[2]。美拉德反應(yīng)被廣泛認為是有效和安全的提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法[3-4]。目前的研究較多集中于利用生物酶解技術(shù)來制備綠豆肽,極少考慮利用糖基化對綠豆中的蛋白質(zhì)進行改性[5-6]。本研究通過對糖基化改性后綠豆蛋白的抗氧化性進行研究,運用多種分析檢測手段,探討糖基化反應(yīng)在綠豆分離蛋白中對其抗氧化能力所起的影響,同時對其作用機理進行探究,以期為拓展綠豆蛋白的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    綠豆分離蛋白,實驗室堿溶酸沉法自制(蛋白質(zhì)含量90.76%);葡聚糖,中國醫(yī)藥集團上?;瘜W(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛(OPA),天津市科密歐化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉:分析純試劑。

    1.2 主要儀器設(shè)備

    PH SJ-4A型實驗室pH計,中國上海雷磁公司;JJ-1增力電動攪拌器,江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠;TD5M-WS臺式大容量離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;722型可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1綠豆分離蛋白的制備 綠豆→浸泡12h(料液比為1∶ 10,4℃)→去皮→磨漿→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為9.0→室溫下攪拌20min→10 000×g離心30min(4℃)→上清液用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為4.0→10 000×g離心30min(4℃)→沉淀加水分散→用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性→真空冷凍干燥(-50℃)→綠豆分離蛋白。

    1.3.2綠豆分離蛋白—糖接枝物的制備 將綠豆分離蛋白和葡聚糖(1/1)溶解于磷酸鹽緩沖溶液中,攪拌2h至完全溶解,置于水浴鍋中反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫,離心后上清液置于蒸餾水中透析24h(4℃),凍干成粉后置于冰箱中備用。

    1.3.3接枝度測定 采用OPA法。配制OPA試劑,此試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中,再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL,硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL,β-巰基乙醇100 μL最后用蒸餾水定容到50 mL。在測定過程中,取1支干凈試管放入4.0 mL的OPA試劑以及200 μL的樣品,混勻,置于35℃的恒溫水浴鍋中水浴2 min,并用可見分光光度計于340nm下測出吸光值A(chǔ)340。同時,另取一支試管中放入4.0 mL OPA試劑和200 μL水作為空白對照。

    接枝度可以用式(1)計算:

    DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

    (1)

    式(1)中:A0—接枝反應(yīng)前溶液的吸光值;A1—接枝反應(yīng)后溶液的吸光值

    1.3.4接枝產(chǎn)物褐變程度的測定 用0.1% SDS(w/w)將樣品液稀釋至蛋白濃度為0.2%(w/v),以稀釋液做空白,在420 nm下測定吸光值A(chǔ)420。

    1.3.5DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)Benjakul S[7]的方法對接枝產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力進行測定。當(dāng)日配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液,避光保存。取2 mL的上述溶液,加入1 mL一定蛋白濃度的蛋白或者接枝物溶液,混合均勻后,25℃下避光反應(yīng)30 min,然后測定溶液在517 nm處的吸光值。對照中樣品溶液由去離子水替代,空白中DPPH-乙醇溶液由無水乙醇替代。DPPH自由基清除能力根據(jù)式(2)計算:

    (2)

    式(2)中:Ac—對照的吸光值;AS—樣品溶液的吸光值;A0—空白的吸光值

    1.3.6還原力測定 參照Oyaizu的方法[8]對接枝產(chǎn)物的還原力進行測定。取樣品0.5mL(5mg/mL),加入濃度為0.2mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL以及1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL,充分攪拌。在恒溫水浴鍋內(nèi)將混合物在5℃條件下保持恒溫20min后加入冰塊進行冷卻,再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL,將樣液置于3 000r/min離心機下離心10min。隨后用移液槍取上清液2.5mL,蒸餾水2.5mL以及0.1%的氯化鐵溶液0.5mL,充分攪拌,靜置10min后,并用可見分光光度計在700nm處測定溶液的吸光值。

    1.3.7羥基自由基(OH·)清除能力的測定 通過Fenton體系模型[9]測定羥基自由基(OH·)的清除能力。吸取9.0mmol/L FeSO4和9.0mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0mL,然后加入10mg/mL樣品液2mL,最后加入2mL 8.8mmol/L H2O2。對照液中樣品液由去離子水替代,并于37℃下保持恒溫30min。以蒸餾水為空白,用可見分光光度計在510nm處測定其吸光值。

    對OH·清除率的公式如式(3):

    (3)

    式(3)中:OD0——空白對照液吸光度值;ODx——加入樣品液后吸光值;ODx0——樣品的本底吸光度值

    (4)

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

    至少進行3次試驗,利用Origin9.1軟件、OMNIC軟件包等進行數(shù)據(jù)分析,圖表處理及圖譜分析處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 反應(yīng)時間對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響

    圖1表明,產(chǎn)物的接枝度在反應(yīng)進行過程中逐漸增加。這是因為,在初期,蛋白質(zhì)鏈上的ε-氨基基團并未完全暴露,隨著糖基化反應(yīng)時間延長,ε-氨基基團不斷暴露出來,與還原性羧基末端發(fā)生反應(yīng)程度增加,從而增加產(chǎn)物的接枝度[11-12]。游離氨基和還原性羰基之間產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)同時也能提高產(chǎn)物的褐變程度。美拉德反應(yīng)的高級階段涉及Amadori產(chǎn)物的降解,和生成被稱為“類黑精”的有色的高分子化合物[13]。同時,褐變程度也在反應(yīng)進行的過程中逐漸增加,這表明有部分美拉德反應(yīng)的高級產(chǎn)物生成。

    圖2為90℃條件下反應(yīng)的接枝度先迅速增加而后增加速度變緩,這是因為,溫度過高在促進蛋白和多糖之間反應(yīng)的同時,也使蛋白質(zhì)之間發(fā)生了一定程度的聚集,從而不利于反應(yīng)的繼續(xù)進行。隨反應(yīng)時間延長產(chǎn)物的褐變程度急劇增加,這表明90℃下美拉德反應(yīng)的高級產(chǎn)物生成量逐漸增加。反應(yīng)時間過長導(dǎo)致產(chǎn)物出現(xiàn)不良的色澤和氣味,這會限制其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,因此,控制反應(yīng)的時間和溫度在一定范圍內(nèi)是十分必要的。

    2.2 還原力

    由圖3可知,產(chǎn)物的還原力隨著反應(yīng)時間的延長緩慢升高。研究表明,美拉德反應(yīng)初級階段的Amadori熱解產(chǎn)物[14-15]、中間產(chǎn)物還原酮[16]、高級階段產(chǎn)物裂解形成“類黑精[17]”都具有一定的還原能力,此外,焦糖化反應(yīng)產(chǎn)物也具有一定的還原能力[18]。其中,中間產(chǎn)物還原酮是起到還原能力的主要物質(zhì)[19]。80℃條件下隨著反應(yīng)時間延長,產(chǎn)物接枝度不斷增大,中間產(chǎn)物還原酮積累增多,因此,產(chǎn)物的還原力不斷增大。Limsuwanmanee J等[18]研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中羥基基團的存在與其還原性呈相關(guān)性。Daglia等[20]研究表明,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是一種特殊的由許多不同分子量的化合物組成的物質(zhì),特別是高分子量化合物。這種高分子量化合物是使產(chǎn)物表現(xiàn)出抗氧化性質(zhì)的主要物質(zhì)。由圖4可知,在反應(yīng)開始1h內(nèi)產(chǎn)物的還原能力增加較小,隨反應(yīng)時間延長還原力迅速上升,并在反應(yīng)4h后達到峰值,繼續(xù)延長反應(yīng)時間,產(chǎn)物還原力有略微的下降,但仍處于較高水平。整體上90℃下產(chǎn)物的還原能力較80℃條件下產(chǎn)物有所提高,這可能是由于90℃下美拉德反應(yīng)速率提高,產(chǎn)物褐變程度進一步增大,美拉德高級產(chǎn)物積累由此增多而導(dǎo)致。有研究表明,高級美拉德產(chǎn)物中的這些羥基基團也是使其表現(xiàn)出還原能力的重要物質(zhì)[16]。反應(yīng)時間繼續(xù)延長,產(chǎn)物還原力下降,這可能是因為過度熱處理一部分具有還原能力的產(chǎn)物分解所致。

    2.3 DPPH自由基清除能力

    圖5結(jié)果表明,在美拉德反應(yīng)過程中,中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物“類黑精”均可作為氫供體,其中高級階段產(chǎn)物“類黑精”主要起消除自由基作用[21-22]。隨著美拉德反應(yīng)時間延長,產(chǎn)物的褐變程度逐漸增強,DPPH自由基清除能力也隨之增大。圖6結(jié)果表明,在反應(yīng)開始1h內(nèi),DPPH自由基清除能力上升幅度較小,反應(yīng)2h后急劇增加,反應(yīng)進行到3h時,產(chǎn)物DPPH自由基清除能力達到峰值,之后DPPH自由基清除能力緩慢下降。研究表明,高級階段產(chǎn)物“類黑精”主要起清除自由基作用。在反應(yīng)開始階段,DPPH自由基清除能力提升并不明顯,這是由于美拉德反應(yīng)高級階段產(chǎn)物生成量有限;隨著時間延長,高級產(chǎn)物積累增多,DPPH自由基清除能力隨之增大,但反應(yīng)時間過長,DPPH自由基清除能力也會下降,這可能是由于過度的熱處理,蛋白質(zhì)發(fā)生劇烈聚集,不利于自由基清除反應(yīng)的發(fā)生。90℃下產(chǎn)物相比于80℃反應(yīng)產(chǎn)物DPPH清除能力有所提高,這是由于90℃下產(chǎn)物反應(yīng)程度更高,在美拉德反應(yīng)過程中積累了更多高級產(chǎn)物“類黑精”。但整體而言,MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力水平略低。有報道稱,DPPH自由基是一類相對疏水的自由基,較難作用于蛋白質(zhì)、多糖類大分子,從而導(dǎo)致其難以與MBPI及MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物作用,使樣品整體的DPPH自由基清除處于較低水平[23]。

    2.5 羥自由基(·OH)清除能力

    由圖9、10可知,90℃下產(chǎn)物反應(yīng)開始1h時,·OH清除能力迅速提升,之后隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)先緩慢上升而后下降的趨勢,反應(yīng)4h時產(chǎn)物的·OH清除能力達到峰值,為未處理MBPI的1.46倍,隨著反應(yīng)時間的延長,·OH清除能力出現(xiàn)下降,研究發(fā)現(xiàn)是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有·OH清除能力的物質(zhì)在長時間高溫加熱的環(huán)境下被熱分解。反應(yīng)一定時間后80℃與90℃產(chǎn)物的·OH清除能力相當(dāng),表明糖基化反應(yīng)產(chǎn)物對·OH清除能力的影響有限。整體上MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物的·OH清除能力高于MBPI,原因可能是,MBPI與葡聚糖共價結(jié)合后導(dǎo)致分子量變大以及螯合Fe2+的能力增強,使MBPI無法產(chǎn)生羥自由基,進一步阻斷了反應(yīng)的繼續(xù)進行,最終表現(xiàn)為其清除能力的增強[24]。

    圖1 80℃下反應(yīng)時間對接枝度及褐變程度的影響

    圖2 90℃下反應(yīng)時間對接枝度及褐變程度的影響

    圖3 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物還原力的影響

    圖4 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物還原力的影響

    圖5 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

    圖6 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-葡聚糖共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

    圖7 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物超氧自由基清除能力的影響

    圖8 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物超氧自由基清除能力的影響

    圖9 80℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

    圖10 90℃下反應(yīng)時間對MBPI-Dextran共價復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響

    3 結(jié)論

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    (責(zé)任編輯 李婷婷)

    The Inoxidizability of Mung Bean Protein with Dextran Glycosylation Process

    JIANG Lian-zhou,ZHANG Xiao-yuan,WU Dan,ZHANG Wan-kun,ZHANG Jing,LU Yan,QUAN Wei-cheng,MI Si,LIU Shuang,WANG Zhong-jiang
    (College of Food Science,Northeast Agricultural Univeristy,Harbin 150030,China)

    mung bean protein;dextran;glycosylation process;inoxidizability

    國家自然科學(xué)基金面上項目(項目編號:31671807、3157101375);十三五重點研發(fā)專項“中華傳統(tǒng)食品工業(yè)化加工關(guān)鍵技術(shù)研究與裝備開發(fā)”(項目編號:2016YED0400402);方便即食豆制品制造關(guān)鍵技術(shù)研究及新產(chǎn)品創(chuàng)制(項目編號:2016YFD0400702);霍英東教育基金會高等院校青年教師基金(項目編號:20152325210002)。

    江連洲(1960— ),男,博士,教授,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

    王中江(1987— ),男,博士,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

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