酸性氧化鋁用于甜葉菊甜菊糖苷分析樣品前處理

羅慶云，李小燕，鄧瑞欣，王甜甜，葉楊瀟，尚進(jìn)

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095）

酸性氧化鋁用于甜葉菊甜菊糖苷分析樣品前處理

羅慶云*，李小燕*，鄧瑞欣，王甜甜，葉楊瀟，尚進(jìn)

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095）

為促進(jìn)甜菊糖苷提取用甜葉菊新品種選育，以非糖苷類雜質(zhì)和甜菊糖苷的檢出量為指標(biāo)，比較了各吸附劑用于甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷高效液相檢測用樣品前處理的可行性，并建立了有效的高效液相檢測用樣品前處理方法。結(jié)果表明，甜葉菊葉片經(jīng)50%乙醇超聲浸提后，在所調(diào)查的幾種吸附劑添加處理中，以酸性氧化鋁對(duì)浸提液中非糖苷類雜質(zhì)的去除效果最好，且對(duì)以RA和STV為代表的甜菊糖苷含量影響小。進(jìn)一步的研究揭示，酸性氧化鋁用于甜葉菊葉片50%乙醇提取液高效液相檢測用樣品的前處理優(yōu)化方案為：在甜葉菊葉片的50%乙醇提取液中加入1/5（m：v）酸性氧化鋁，40r/min室溫振蕩30min，可使提取液中非糖苷類雜質(zhì)檢出量減少65.0%以上，且對(duì)以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量的影響小于3.0%。

甜葉菊；甜菊糖苷；高效液相色譜法；樣品前處理

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）為原產(chǎn)于巴拉圭的菊科多年生草本植物[1]，除含色素、鞣質(zhì)、多酚、多糖、樹膠、粗纖維和蛋白質(zhì)外[2-3]，其葉片中含有種類豐富的萜類化合物，其中以四環(huán)二萜為母核的糖苷類化合物（簡稱甜菊糖苷）就達(dá)44種以上[4]。到目前為止，包含Rebaudioside A（RA）和Stevioside（STV）在內(nèi)的以甜菊醇為母核的所有甜菊糖苷都已被允許作為低熱量、高倍甜味劑應(yīng)用于食品加工業(yè)[5]。此外，甜菊糖苷類化合物還廣泛用作香精、醫(yī)藥中間體、化妝品和植物生長調(diào)節(jié)劑[6-7]。當(dāng)前，甜葉菊人工種植及提取加工的主要目的之一在于獲取其葉片中富含的甜菊糖苷，甜葉菊葉片的應(yīng)用和市場價(jià)值受其各甜菊糖苷的絕對(duì)和相對(duì)含量影響，因此甜菊糖苷提取用甜葉菊優(yōu)良新品種的選育就顯得尤為重要。

為選育甜菊糖苷提取用甜葉菊優(yōu)良品種，有必要對(duì)甜葉菊種質(zhì)葉片中各甜菊糖苷組分進(jìn)行檢測。高效液相法是目前甜菊糖苷檢測普遍使用的方法[8]，樣品檢測前的除雜純化對(duì)提高色譜柱分辨率和使用壽命、提高分析結(jié)果準(zhǔn)確性具有決定性作用。而甜葉菊檢測液中含有色素、鞣質(zhì)、多酚等雜質(zhì)，其總量可達(dá)甜菊糖苷的5～7倍或以上[2]，為此，有必要基于現(xiàn)有的甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷高效液相檢測方法建立一種快速簡捷的樣品純化方法，以提高甜葉菊種質(zhì)葉片中的各甜菊糖苷組分檢測結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性，為甜菊糖苷提取用甜葉菊優(yōu)良新品種的選育提供技術(shù)支撐。

本研究在原有50%乙醇振蕩過夜結(jié)合超聲提取基礎(chǔ)上[9]，通過比較不同吸附劑對(duì)甜葉菊葉片提取液中雜質(zhì)和甜菊糖苷類化合物的吸附能力差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)吸附劑的選擇。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)吸附劑的具體使用方法進(jìn)行深入探究，建立了一種適用于甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性檢測的樣品前處理方法，為更方便快捷地開展甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性評(píng)估提供技術(shù)支撐，促進(jìn)甜葉菊優(yōu)良新品種選育。

1 材料與方法

1.1 材料

所用甜葉菊（S.rebaudiana）葉片取自本實(shí)驗(yàn)室位于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場的甜葉菊種苗繁育基地，參照羅慶云等方法[9]，改用含0.26%（v：v）濃氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液準(zhǔn)備高效液相檢測用浸提液備用。

1.2 酸性Al2O3和堿性Al2O3的制備

酸性Al2O3的制備方法為：取氧化鋁粉末40.0g，加入60.0mL 1%HCl（m：v）溶液中，充分振蕩處理30min，用蒸餾水洗至pH 4.0，80℃烘干保存?zhèn)溆?。堿性Al2O3的制備方法為：取氧化鋁粉末40.0g，加入60.0mL 1%NaOH（m：v）溶液中，充分振蕩處理30min，用蒸餾水洗至pH 10.0，80℃烘干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 有效處理方法分析

取1.1制備的高效液相檢測用浸提液各0.50mL于2.0mL離心管中，分別設(shè)硅藻土0.04和0.08g添加、硅膠0.08和0.16g添加、活性炭0.10和0.20g添加、酸性氧化鋁0.10和0.20g添加、堿性氧化鋁0.10和0.20g添加、5%TCA（三氯乙酸）0.2mL添加和25%石灰乳0.2mL添加12種處理，室溫振蕩2h，12000r/min 4℃離心15min，取上清，0.22μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存?zhèn)錂z。同時(shí)設(shè)未添加吸附劑的空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.4 酸性Al2O3最佳用量分析

取1.1所制備的高效液相檢測用浸提液各0.50mL于2.0mL離心管中，分別加入酸性Al2O30.025g，0.05g，0.10g，0.20g，0.30g，0.40g，0.50g， 室溫振蕩吸附處理 12h， 12000r/min 4℃離心 15min， 取上清，0.22μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存?zhèn)錂z。同時(shí)設(shè)未添加酸性Al2O3吸附劑的空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 酸性Al2O3最佳吸附時(shí)間分析

取1.1所制備的高效液相檢測用浸提液各0.50mL于2.0mL離心管中，加入酸性Al2O30.10g室溫下分別振蕩吸附處理 5min、15min、30min、1h、2h、4h 和 8h，4℃下 12000r/min 離心 15min，取上清 0.22μm 微孔濾膜過濾-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。同時(shí)設(shè)未添加酸性Al2O3吸附劑的空白對(duì)照和添加0.10g酸性Al2O3混勻后迅速離心分離的處理對(duì)照（0min），每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 試驗(yàn)

1.6.1 精密度試驗(yàn) 取1.1所制備的高效液相檢測用浸提液各0.50mL于2.0mL離心管中，加入酸性Al2O30.10g室溫下分別振蕩吸附處理30min，4℃下12000r/min離心15min，取上清0.22μm微孔濾膜過濾，在相同色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣檢測6次。

1.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.6.1方法準(zhǔn)備檢測液1份，分別于0h，1h，2h，4h，8h，12h，24h各檢測3次。同時(shí)跟蹤檢測未添加酸性Al2O3吸附劑的空白對(duì)照。

1.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 同樣按1.6.1方法分別準(zhǔn)備檢測液平行樣5份，各檢測3次。

1.7 實(shí)用性驗(yàn)證

為探討酸性Al2O3吸附去除甜葉菊提取液中非甜菊糖苷類雜質(zhì)的適宜使用方法，本研究進(jìn)一步依1.6.1方法設(shè)用含 0.26%（v：v）濃氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液浸提后加入 1/5（m：v）酸性 Al2O3吸附處理 30min（以下簡稱“后吸附法”）、參照羅慶云等方法[9]但甜葉菊葉片樣品加入含0.26%（v：v）濃氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液中時(shí)同步加入1/5（m：v）酸性Al2O3室溫振蕩過夜超聲提?。ㄒ韵潞喎Q“同步吸附法”）等兩種應(yīng)用方案。同時(shí)設(shè)未添加酸性Al2O3吸附劑的空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8 樣品的檢測及數(shù)據(jù)處理

參照J(rèn)ECFA（2010）[10]方法檢測各樣品RA、STV及RC含量。在數(shù)據(jù)的前期處理中以RA和STV的總量作為甜菊糖苷含量指標(biāo)，以保留時(shí)間早于RA的化合物總量作為非甜菊糖苷類化合物含量指標(biāo)。利用Excel（2007）處理各檢測數(shù)據(jù)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)檢測液雜質(zhì)及甜菊糖苷檢出量的影響

由于甜葉菊葉片除富含甜菊糖苷外，還含有色素、鞣質(zhì)、多酚、多糖、樹膠、粗纖維、蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素等非目標(biāo)分析物，這些化合物的存在會(huì)增加色譜柱的分離負(fù)擔(dān)、降低柱效和工作效率。

在植物提取液和污水凈化處理中，硅藻土可用于去除小顆粒固型雜質(zhì)，活性炭可以去除色素，氧化鋁可用于去除酚類等色素物質(zhì)，三氯乙酸可用于去除大分子蛋白質(zhì)，石灰乳可去除金屬陽離子。為此，本研究先對(duì)上述化合物在甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性檢測用樣品前處理中的應(yīng)用潛力進(jìn)行了比較研究。

圖1 各處理對(duì)樣品中雜質(zhì)及RA和STV總量的影響

由圖1可以看出，不同化合物的添加對(duì)檢測液中非糖苷類雜質(zhì)和以RA和STV為代表的甜菊糖苷含量的影響不同，其中硅藻土、活性炭、堿性氧化鋁、TCA和石灰乳的加入都或多或少地使檢測液中的雜質(zhì)和甜菊糖苷同步減少，表明這些化合物對(duì)非糖苷雜質(zhì)和甜菊糖苷選擇性較小，不適用于本研究所需高效液相檢測液的去雜前處理。與上述化合物不同的是，在本研究所涉及的化合物中，硅膠和酸性氧化鋁對(duì)非糖苷類雜質(zhì)和甜菊糖苷表現(xiàn)出一定的選擇性，其中酸性氧化鋁的添加可將雜質(zhì)降低到原液的20%左右 （酸性氧化鋁0.1g添加時(shí)，雜質(zhì)檢出量為原液20.8%±3.7%；0.2g添加時(shí)，雜質(zhì)檢出量為原液18.6%±0.8%），而對(duì)檢測液中以RA和STV為代表的甜菊糖苷含量的影響相對(duì)較小 （酸性氧化鋁0.1g添加時(shí)，RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量為原液86.6%±3.5%；0.2g添加時(shí)，檢出量為原液82.7%±0.8%）。表明酸性Al2O3可以作為高效液相檢測液去雜前處理用化合物，但隨著酸性Al2O3用量的增加，甜菊糖苷檢出量減少明顯，為此，有必要對(duì)酸性Al2O3的適宜用量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 酸性Al2O3最適用量探究

由圖 2的 A，不同用量酸性 Al2O3處理 12h 時(shí)，隨酸性 Al2O3用量由 0.025g（1/20（m：v））增加至 0.1g（1/5（m：v））時(shí)，檢測液中雜質(zhì)檢出量從對(duì)照的70.0%±10.0%迅速減少為對(duì)照的32.9%±0.96%。與此同時(shí)，檢測液中以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量保持基本穩(wěn)定，都為對(duì)照的98.0%左右。但，隨著酸性Al2O3用量的進(jìn)一步加大增加，以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量逐漸減少至對(duì)照的86%左右，而雜質(zhì)檢出量卻基本穩(wěn)定在對(duì)照的36.0%左右。上述結(jié)果表明，當(dāng)酸性Al2O3的用量為0.10g/0.5mL（1/5（m：v））時(shí)，糖苷檢出率的減少量（相對(duì)變化率為對(duì)照的97.1%±0.6%）遠(yuǎn)小于雜質(zhì)檢出率的相對(duì)變化率（為對(duì)照的32.9%±1.0%），也較其他處理水平表現(xiàn)出更好的工作效率。

圖2 不同量酸性Al2O3吸附處理12h（A）、1/5（m：v）酸性Al2O3吸附不同時(shí)間（B）對(duì)樣品中雜質(zhì)及RA和STV總量的影響

2.3 酸性Al2O3最佳處理時(shí)間探究

在實(shí)際樣品前處理中，適宜處理時(shí)間對(duì)于合理安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，提高工作效率具有非常重要的意義，為此，在前述2.2研究基礎(chǔ)上，本部分對(duì)酸性Al2O3的適宜處理時(shí)間進(jìn)行了研究。

由圖2的B可以看出，在相同用量下[0.10g/0.5mL（1/5（m：v））]，酸性Al2O3對(duì)非糖苷類化合物表現(xiàn)出快速的吸附去除能力，酸性Al2O3的加入可使雜質(zhì)檢出量迅速減少到對(duì)照的40.3%±0.3%，但處理時(shí)間大于15min時(shí)，雜質(zhì)檢出量就不再減少；同時(shí)，各處理間以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量變化很小。為此，在實(shí)際應(yīng)用中，可以考慮將酸性Al2O3的處理時(shí)間設(shè)置為15～30min。

2.4 酸性Al2O3處理方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性驗(yàn)證

為確定酸性Al2O3的加入除對(duì)高效液相檢測液中非糖苷類化合物吸附去除外，是否會(huì)對(duì)后續(xù)的糖苷類化合物及未吸附去除部分雜質(zhì)的檢測產(chǎn)生影響，本研究進(jìn)一步對(duì)酸性Al2O3處理樣品液各組分檢出量的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。

表1結(jié)果揭示，酸性Al2O3處理樣品液中包括非糖苷類化合物、RA、STV和RC在內(nèi)的各組分檢出精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性所對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都小于1.0%，表明酸性Al2O3處理后檢測液中各組分能夠保持良好的穩(wěn)定性，說明酸性Al2O3可用于甜葉菊葉片含0.26%（v∶v）濃氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液提取液高效液相檢測樣品前處理。

2.5 酸性Al2O3應(yīng)用方式的實(shí)用性驗(yàn)證

在前述研究中采取的工作策略為先進(jìn)行50%乙醇振蕩過夜結(jié)合超聲提取離心收集后再對(duì)上清液進(jìn)行酸性Al2O3處理，之后還需要再次離心去除酸性Al2O3后才可以微孔濾膜過濾上樣檢測，在整個(gè)過程中涉及兩次離心操作。由于實(shí)際育種評(píng)價(jià)中檢測所涉樣品量大，若能減少樣品處理步驟、降低樣品準(zhǔn)備工作量，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測工作將具有非常重要的實(shí)踐意義。

表1 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果

為此，前述“后吸附法”與“同步吸附法”等兩種酸性Al2O3添加處理方法對(duì)檢測液中非糖苷類化合物及以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量的影響情況進(jìn)行了比較。圖3結(jié)果表明，“后吸附法”與“同步吸附法”等兩種酸性Al2O3添加處理方式對(duì)非糖苷類化合物和以RA和STV為代表的甜菊糖苷的檢出量影響不大，處理間差異不顯著。為此，在實(shí)際應(yīng)用中可以采用“同步吸附法”，以減少離心操作次數(shù)，提高工作效率。

圖3 酸性Al2O3兩種添加方式對(duì)樣品中雜質(zhì)及RA和STV總量的影響

3 討論和結(jié)論

植物類樣品化學(xué)成分復(fù)雜，為降低后續(xù)檢測壓力，需要對(duì)樣品進(jìn)行包括凈化在內(nèi)的前處理。目前常用的方法包括液液萃取、固相萃?。⊿PE）[11]等步驟，但存在處理效率低，操作繁瑣，且在實(shí)際操作中由于存在容器之間的轉(zhuǎn)移等步驟，系統(tǒng)和人為誤差大，為此，在本研究中不予考察。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，活性氧化鋁和硅膠對(duì)親水性色素的吸附效果好[12-13]，活性炭和硅藻土可以用于親脂性色素的吸附[14]，TCA有助于蛋白質(zhì)的沉淀[15]，石灰乳可螯合沉淀去除部分礦質(zhì)元素。有鑒于此，本研究就這些化合物對(duì)甜葉菊提取液中非糖苷類雜質(zhì)和以RA和STV為代表的甜菊糖苷的選擇吸附特性首先進(jìn)行了初步評(píng)估，結(jié)果表明硅藻土、活性炭、堿性氧化鋁、TCA和石灰乳對(duì)非糖苷類化合物和甜菊糖苷的選擇性較小，而硅膠和酸性氧化鋁表現(xiàn)出一定的選擇性，并以酸性氧化鋁對(duì)非糖苷類化合物的選擇性吸附效果最好。

進(jìn)一步的分析表明，酸性氧化鋁處理對(duì)包括非糖苷類化合物、RA、STV和RC在內(nèi)的各組分檢出精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性所對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都小于1.0%。且在實(shí)際育種檢測中，可采用“同步吸附法”，以減少操作步驟，提高工作效率。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，經(jīng)本研究進(jìn)一步優(yōu)化的甜葉菊葉片甜菊糖苷特性分析用樣品前處理工作方案為：甜葉菊葉片取樣后80℃烘干過夜，研磨過60目篩，精密稱取于離心管中，加入6倍（m：m）酸性Al2O3和 30 倍（v：m）含 0.26%（v：v）濃氨水及 50%（v：v）乙醇的水溶液，室溫震蕩過夜，40℃超聲處理（功率 250W，頻率40kHz）60min，10000r/min離心10min后取上清，0.22μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后4℃保存?zhèn)錂z。

另外，也可以采用本研究前期實(shí)驗(yàn)中所利用的方案——“后吸附法”，即在甜葉菊葉片用30倍（v：m）含0.26%（v：v）及 50%（v：v）乙醇的水溶液提取所得的提取液中加入 1/5（m：v）酸性 Al2O3，40r/min 室溫振蕩處理30min，10000r/min離心10min后取上清，0.22μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后4℃保存?zhèn)錂z。

經(jīng)上述兩種方法處理后，可使提取液中非糖苷類化合物檢出量都減少65.0%以上，而對(duì)以RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量影響小于3.0%。

為此，本研究在原有50%乙醇振蕩過夜結(jié)合超聲提取[9]基礎(chǔ)上，通過比較不同吸附劑對(duì)甜葉菊提取液中非糖苷類化合物及甜菊糖類吸附能力差異，建立了一種適用于甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性檢測的樣品前處理方法，為更方便快捷地開展甜葉菊種質(zhì)中甜菊糖苷特性的評(píng)估提供了技術(shù)支撐，必將有力地促進(jìn)甜葉菊優(yōu)良新品種選育。

致謝：實(shí)驗(yàn)由羅慶云和李小燕共同設(shè)計(jì)，由李小燕在羅慶云的指導(dǎo)下負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的具體操作、數(shù)據(jù)采集及初稿撰寫，羅慶云負(fù)責(zé)圖表制作及定稿撰寫，鄧瑞欣、王甜甜對(duì)論文的修改提出參考意見，李小燕、鄧瑞欣、王甜甜、葉楊瀟、尚進(jìn)、李寧、葉青霞等參與實(shí)驗(yàn)材料繁育，陳愛彥和劉福鳳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)材料田間管理。

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Acid Aluminium Oxide Used in Stevia Sample Pretreatment for Steviol Glycosides Analysis

LUO Qing-yun*,LI Xiao-yan*,DENG Rui-xin,WANG Tian-tian,YE Yang-xiao,SHANG Jin
（College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu）

To promote the selection and breeding of new stevia lines for steviol glycosides （SGs）extraction,detection quantity of non-glycosides and SGs were employed as indicators to compare the feasibility of adsorbents used in the stevia sample pretreatment for SGs detection by high performance liquid chromatography （HPLC）.The results showed that,compared to the other adsorbents those addition to the extraction solution,acid Al2O3can remove most of the non-glycoside impurities in the leaching solution and，on the same time,take rebaudioside A（RA）and stevioside （STV）as representative of SGs,only a very slight impact were caused on the contents of SGs.Further analysis revealed that,the optimum pretreatment scheme for the HPLC detection SGs in the 50%ethanol extract of stevia leaves by using of acid Al2O3was as follows:After adding 1/5 （m:v）acid Al2O3to the 50%ethanol extract of stevia leaves,oscillation at 40 r/min under room temperature for 30 min.Pretreatment by above method,the detection quantity of non-glycoside impurities can be reduced by more than 65.0%,and those of SGs,take rebaudioside A and stevioside as representative,were impacted less than 3.0%.

stevia;steviol glycosides;HPLC;sample pretreatment

S566.9

A

1007－2624（2017）06－0013－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.004

*兩作者對(duì)該文的貢獻(xiàn)相同

2017-06-08

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目：基于轉(zhuǎn)錄組測序的甜葉菊Rebaudioside A生物合成關(guān)鍵基因優(yōu)異單倍型挖掘（31471553）。

羅慶云（1974-），男，重慶墊江人，博士，講師。研究方向：植物次生代謝生理與遺傳。E-mail：qyluo@njau.edu.cn