響應(yīng)曲面法與正交法在二氧化碳超臨界萃取桑葉總黃酮中的比較

繆偉偉+王志雄+石仝雨+大野優(yōu)子

摘要：為探索桑葉中總黃酮提取的最佳方案，利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)，依次用響應(yīng)曲面法和正交試驗(yàn)法考查萃取壓強(qiáng)、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑無水乙醇的流速對桑葉中總黃酮得率的影響，優(yōu)選出桑葉黃酮類化合物在使用超臨界萃取裝置時提取的最佳工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正交試驗(yàn)的最佳萃取條件為萃取壓強(qiáng)25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間3 h，夾帶劑無水乙醇流速2.5 mL/min，在此試驗(yàn)條件下總黃酮得率為（6.18±0.05）%；響應(yīng)曲面法的最佳提取率方案為壓強(qiáng)26.75 MPa，溫度50 ℃、時間3 h、流速2.61 mL/min，預(yù)期的總黃酮得率為6.20%，驗(yàn)證試驗(yàn)的總黃酮得率為（6.21±0.05）%。結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法及正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝后所得的總黃酮萃取率分別為（6.21±005）%、（6.18±0.05）%，可以看出響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得條件的黃酮萃取率大于正交試驗(yàn)法，但是不顯著；正交試驗(yàn)只能得到總黃酮萃取中各因素不同水平之間的最優(yōu)組合，不能考察到組合外的情況；響應(yīng)曲面法通過構(gòu)建二次回歸模型，不僅可以得到各因素對黃酮得率的影響大小及顯著性，還能找出試驗(yàn)設(shè)置水平之外的最優(yōu)萃取工藝，且最優(yōu)萃取工藝的總黃酮提取率要優(yōu)于正交試驗(yàn)法，但是兩者的差距并不明顯。

關(guān)鍵詞：桑葉；超臨界萃取技術(shù)；總黃酮得率；響應(yīng)曲面法；正交試驗(yàn)法

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0189-05

收稿日期：2017-03-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：81402030）。

作者簡介：繆偉偉（1988—），女，江蘇鹽城人，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：miaoww@sumhs.edu.cn。

通信作者：王志雄，博士，副教授，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：wangzx@sumhs.edu.cn。 桑葉是我國傳統(tǒng)中藥之一，為桑屬植物桑樹（Morus alba L.）的葉片，曾被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，中醫(yī)又稱神仙草、鐵扇子。桑葉性甘、寒，甘可以益血，寒可以涼血，甘寒相合，故下氣而益陰，主治風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤昏花等癥[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中含有多種功能性成分，如礦物質(zhì)、維生素、食物纖維、氨基酸、植物甾醇、黃酮類、生物堿類、多糖等。其中黃酮類化合物具有顯著的抗癌、抗氧化作用，受到人們的廣泛關(guān)注，其抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)抑癌基因活性及抑制癌基因表達(dá)等方面[5-7]。超臨界二氧化碳流體（supercritical CO2 fluid extraction，簡稱SFE-CO2）萃取方法是一種新興技術(shù)，目前在國際上屬于最先進(jìn)的物理萃取分離技術(shù)，萃取方法主要利用高滲透性和高溶解能力來提取分離成分，用到的溶劑是二氧化碳，以二氧化碳為溶劑，與一般的液體溶劑萃取相比，超臨界二氧化碳萃取在速度和范圍上更占優(yōu)勢[8-10]。綜上所述，本研究運(yùn)用響應(yīng)曲面法分析超臨界萃取中桑葉總黃酮提取的關(guān)鍵因素，并獲得其最佳提取條件，能為進(jìn)一步開發(fā)和利用桑葉中的總黃酮成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料、藥品 桑葉干粉（日本野姬和株式會社），蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海金穗生物公司），無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉（上海金穗生物公司），氫氧化鈉（上海沃凱化學(xué)試劑有限公司），均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 器材 容量瓶，量筒，移液槍，離心管，過濾器，漏斗，濾紙，石英比色杯等。紫外可見光分光光度計（756P，上海光譜儀器有限公司），超臨界二氧化碳流體萃取設(shè)備（美國Waters公司），恒溫水浴箱（CV-420，上海恒一精密儀器有限公司），超純水系統(tǒng)（RE-100，上海本昂科學(xué)儀器有限公司），電子天平（FA2104，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝路線 稱取干燥后的桑葉粉2 g，裝入超臨界萃取裝置的萃取釜中，以無水乙醇為夾帶劑。在本試驗(yàn)中通過改變相關(guān)萃取參數(shù)，完成相關(guān)萃取，獲得總黃酮提取液，計算得總黃酮提取率。具體步驟如下：

桑葉→干燥→稱量→超臨界萃取→總黃酮提取液→測定總黃酮提取率

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用無水乙醇超聲溶解，搖勻，定容至50 mL，使之成為濃度100 μg/mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL，加5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，放置 6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，混勻后放置6 min，加入1%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min后，加無水乙醇定容至10 mL，靜置15 min，等待顯色后用紫外-可見分光光度計在510 nm波長處測吸光度。以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、510 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

1.2.3 總黃酮提取率數(shù)理公式 量取1 mL桑葉提取液， 按

繪制蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟顯色，于510 nm波長處測定吸光度，計算提取液中總黃酮的濃度，再根據(jù)以下公式，得到總黃酮提取率：

總黃酮提取率=C×Vm×100%。

式中：C表示提取液總黃酮的濃度（mg/mL）；V表示提取液定容后的體積（mL）；m表示稱取的樣品桑葉干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[8-10]可得，影響總黃酮得率的主要因素有萃取溫度、萃取壓強(qiáng)、萃取時間和夾帶劑流速。本研究中采用這4個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察各因素對桑葉總黃酮得率的影響，具體見表1。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，建立4因素3水平的正交試驗(yàn)，分析上述因素對總黃酮得率的影響，設(shè)計見表2。endprint

1.2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計 依據(jù)最佳單因素條件，根據(jù) Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理采用4因素3水平的響應(yīng)曲面法對桑葉提取總黃酮工藝條件進(jìn)行分析和優(yōu)化。具體因素編碼及因素水平見表3。

1.2.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)的設(shè)計和統(tǒng)計分析，采用Sigmaplot10.0和Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)表1中的單因素試驗(yàn)設(shè)計所得結(jié)果見圖2。萃取溫度45 ℃、萃取時間2.5 h、夾帶劑流速2.5 mL/min、萃取壓強(qiáng)25 MPa為各單因素的最大響應(yīng)值。在正交試驗(yàn)及響應(yīng)曲面法試驗(yàn)中以此為基礎(chǔ)，設(shè)計因素水平，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以看出，對總黃酮得率影響的大小順序?yàn)镃>A>D>B，即萃取時間>萃取壓強(qiáng)>夾帶劑無水乙醇流速>萃取溫度。其中萃取時間對總黃酮得率的影響最大，其次是萃取壓強(qiáng)，并且萃取的最優(yōu)化組合為A2B1C3D2，即最優(yōu)工藝為萃取壓強(qiáng)25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間3.0 h，夾帶劑無水乙醇流速2.5 mL/min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，黃酮得率為（6.18±0.05）%。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 黃酮得率條件擬合 根據(jù)前期試驗(yàn)分析，選取萃取時間、萃取壓強(qiáng)、夾帶劑無水乙醇流速、萃取溫度這4個因素，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.0 軟件設(shè)計3個水平因子試驗(yàn)，篩選顯著因素；通過爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)；然后運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.0軟件設(shè)計中心組合試驗(yàn)，建立提取模型，預(yù)測最佳提取條件和黃酮得率。因素編碼及水平見表3。

由表6可知，萃取壓強(qiáng)、萃取時間對黃酮得率影響極顯著（P<0.01），萃取溫度對黃酮得率影響顯著（P萃取壓強(qiáng)>萃取溫度>夾帶劑無水乙醇流速。

2.3.2 擬合模型的建立 從圖3-a、圖3-b可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷母鳉埐罘植冀Y(jié)果基本都表明，經(jīng)方法分析對總黃酮得率建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ突驹谕粭l直線上，與失擬分析相一致。從模型分析顯著性可以看出，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ透鳉埐铧c(diǎn)在“0”點(diǎn)直線兩側(cè)不均勻分布，證明這2個模型的建立具有可靠性。失擬項(xiàng)P=0.427 3>0.05，不顯著，純誤差值為0.000 45，數(shù)值比較小。相關(guān)數(shù)據(jù)分析表明，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合程度較好，試驗(yàn)誤差較小。失擬項(xiàng)反映擬合函數(shù)與離散點(diǎn)之間的關(guān)系，分析其結(jié)果值，極不明顯，對分析本模型具有重要作用。

模型方程回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表6。可以看出，模型一次項(xiàng)A、B、C顯著或極顯著，D不顯著；二次項(xiàng)AC、A2、C2、D2顯著或極顯著；其余各項(xiàng)不顯著。因此可知，各個具體試驗(yàn)因素與響應(yīng)值都不是線性關(guān)系。

通過軟件對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，并且采用Y作為因變量，采用R1為總黃酮提取量，A、B、C、D分別代表萃取壓強(qiáng)、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑流速。得到回歸方程如下：

R1=5.95+0.068×A+0.024×B+0.14×C+5.833×10-3×D+0.020×A×B-0.042×A×C-0.020×A×D+0.000×B×C+0.018×B×D+0.010×C×D-0.059×A2+

6.250×10-3×B2+0.076×C2-0.059×D2。

2.3.3 響應(yīng)曲面結(jié)果分析 通過模型方程所作的響應(yīng)曲面及等高線結(jié)果見圖4至圖9，萃取時間對總黃酮得率的影響最明顯，其次是萃取壓強(qiáng)，并且各個因素之間的交互作用并不明顯。根據(jù)圖4至圖9及表5、表6中的試驗(yàn)結(jié)果分析，采用CO2超臨界技術(shù)萃取桑葉中的黃酮類物質(zhì)，萃取時間和萃取壓強(qiáng)是需要考慮的重要因素[9，11-13]，提高萃取時間和萃取壓強(qiáng)雖然有利于活性物質(zhì)從植物細(xì)胞中釋放出來，但是超過最適值之后，則有可能導(dǎo)致一些壓敏、熱敏感的黃酮物質(zhì)在提取過程中發(fā)生分解或異構(gòu)化反應(yīng)[13]。目前已經(jīng)有研究表明，在高溫高壓條件下總黃酮中部分物質(zhì)的異構(gòu)化進(jìn)程大大加快[14]。萃取時間也是影響黃酮提取率的一個重要因素，在一定的萃取溫度、萃取壓強(qiáng)下，試驗(yàn)總黃酮提取率隨著萃取時間的延長而提高，但延長萃取時間會增加夾帶劑的消耗，同時儀器損耗增加，故設(shè)定萃取時間需要綜合考慮，以獲得更好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。相比其他參數(shù)而言，夾帶劑流速對總黃酮得率影響最不顯著（P=0.578 2），故在實(shí)際生產(chǎn)中，可以適當(dāng)降低夾帶劑流速，降低生產(chǎn)成本。

2.3.4 最優(yōu)提取條件的選擇 根據(jù)Design-Expert8.0.5軟件可以優(yōu)化最佳方案，最佳提取率方案為壓強(qiáng)26.75 MPa，溫度50 ℃，時間3 h，流速2.61 mL/min，預(yù)期的總黃酮得率為6.20%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到總黃酮得率為（6.21±0.05）%，試驗(yàn)結(jié)果與Design-Expert8.0.5軟件優(yōu)化的理論預(yù)測值比較誤差約為2.00%，可以證明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)基本準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價值。

2.4 響應(yīng)曲面分析與正交試驗(yàn)驗(yàn)證比較

響應(yīng)曲面法、正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝后所得的黃酮萃取率分別是（6.21±0.05）%、（6.18±0.05）%，可以看出響應(yīng)曲

面法優(yōu)化所得條件的黃酮萃取率大于正交試驗(yàn)法，但是不顯著。正交試驗(yàn)只能得到總黃酮萃取中各因素不同水平之間的最優(yōu)組合，不能考察到組合外的情況，信息量少，而且未能體現(xiàn)各因素對總黃酮得率是否有顯著性影響。而響應(yīng)曲面法對數(shù)據(jù)的分析比較詳細(xì)，不僅可以知道各因素對黃酮得率的影響大小，而且可以知道各因素是否對黃酮得率有顯著性影響。因此，響應(yīng)曲面法與正交試驗(yàn)法相比，在各因素對黃酮得率影響程度及顯著性的分析上優(yōu)于正交試驗(yàn)。endprint

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)上萃取桑葉中總黃酮的方法主要有回流提取法、超聲提取法、微波提取法、索氏提取法等。但上述方法存在溫度相對較高、總黃酮提取率相對較低、萃余物質(zhì)存在大量的溶劑殘余等缺陷。相比而言，超臨界CO2萃取方法能夠在較低溫度條件下實(shí)現(xiàn)桑葉中總黃酮物質(zhì)的高效提取，萃取液中能夠保留多種具有生理活性的總黃酮成分，萃余物無有機(jī)溶劑殘留，流程簡單，操作相對簡單，可保護(hù)桑葉總黃酮中熱敏性物質(zhì)不受破壞等特點(diǎn)，能夠很好地解決上述工藝缺陷[14-16]。

響應(yīng)曲面法與正交試驗(yàn)法都是優(yōu)化有效成分提取工藝的最常用方法。正交試驗(yàn)只能找到各因素不同水平之間的最優(yōu)組合，不能考察不同水平組合之外的情況；而響應(yīng)曲面法通過構(gòu)建二次回歸模型，能找出試驗(yàn)設(shè)置水平之外的最佳水平組合，還可以得到各因素對總黃酮得率的影響大小及顯著性。根據(jù)響應(yīng)曲面法對提取影響因素的分析，確定最優(yōu)工藝為萃取壓強(qiáng) 26.75 MPa，萃取溫度50 ℃，萃取時間3 h，夾帶劑流速2.61 mL/min，總黃酮預(yù)期提取率可達(dá)6.20%，驗(yàn)證試驗(yàn)的總黃酮得率是（6.21±0.05）%?？梢婍憫?yīng)曲面法對桑葉的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅科學(xué)合理、準(zhǔn)確可靠，而且快速可行，該方法對工藝方面的研究具有一定的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國藥典委員會.中國藥典[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：297-298.

[2]白 華.《神農(nóng)本草經(jīng)》桑葉考證[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2016（1）：102-103.

[3]Doss S，Chakraborti S，Chattopadhyay S，et al. Physiological and biochemical characteristics associated with leaf retention in mulberry （Morus spp.）[J]. Open Journal of Genetics，2011（1）：27-33.

[4]宿樹蘭，段金廒，歐陽臻，等. 我國桑屬（Morus）藥用植物資源化學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2012，14（7）：1-6.

[5]Mohammad I，Hamayun K，Mohibullah S，et al.Chemical composition and antioxidant activity of certain Morus species[J]. Journal of Zhejiang University Science（ Biomedicine & Biotechnology），2010，11（12）：973-980.

[6]孫 玲. 桑葉的化學(xué)成分、研究方法及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 臨床合理用藥，2012，5（28）：178-179.

[7]王志雄，高劍文，繆偉偉. 桑葉對腫瘤血管生成的影響[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（25）：22-25.

[8]Luik H，Luik L，Palu V，et al. Applicability of static supercritical carbon dioxide extraction in biogeochemical characterization of oil shales[J]. American Journal of Analytical Chemistry，2014，5（3）：173-180.

[9]Allawzi M，Al-Otoom A，Allaboun H，et al. CO2 supercritical fluid extraction of jordanian oil shale utilizing different Co-solvents[J]. Fuel Processing Technology，2011，92（10）：2016-2023.

[10]Carulo M. Use of SFC in extraction of adaptogens from brazilian plants[J]. American Journal of Analytical Chemistry，2012，3（12A）：977-982.

[11]Al-Asheh S，Allawzi M，Al-Otoom A，et al. Supercritical fluid extraction of useful compounds from sage[J]. Natural Science，2012，4，544-551.

[12]Vuong Q V，Golding J B，Stathopoulos C E，et al. Optimizing conditions for the extraction of catechins from green tea using hot water[J]. Journal of Separation Science，2011，34（21）：3099-3106.

[13]何 晶，錢斐瑩，鄒 培，等. 不同提取方法對桑葉中蘆丁含量的影響研究[J]. 廣東化工，2016，43（17）：18-19.

[14]李佳慧，拱健婷，趙麗瑩，等. 黃蜀葵花總黃酮提取工藝[J]. 國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（2）：370-373.

[15]馬澤剛，袁小紅，徐春霞，等. 費(fèi)約果葉片總黃酮的提取工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2016，37（9）：79-82.

[16]錢亞琴，劉漢清，莊 煒. SFE-CO2萃取技術(shù)在中藥提取分離中的應(yīng)用[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，20（4）：254-256.張會敏，謝澤奇，張善文，等. 基于WT-Otsu算法的植物病害葉片圖像分割方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：194-196.endprint