應用響應面法優(yōu)化紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件

郭芳+劉海鵬+李保國+張雪梅+齊國輝+李迎超+張玲+許洋

摘要：在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合（BBD）試驗原理，選取6-BA濃度、光照度、增殖周期為試驗因素，以增殖系數(shù)為響應值，采取3因素3水平響應面法進行回歸模型分析，以優(yōu)化紅樹莓組培苗增殖的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，以無透氣孔的塑料蓋為封口材料，紅樹莓組培苗增殖的最佳培養(yǎng)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，在此條件下紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)預測值為10.950，驗證得到的實際值為11.019。

關鍵詞：響應面法；培養(yǎng)條件；紅樹莓；增殖系數(shù)；光照度；增殖周期

中圖分類號： S663.204+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0056-04

收稿日期：2016-04-17

基金項目：河北省科技支撐計劃（編號：16226806D）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果惠民示范工程 （編號：Z141100002314009）。

作者簡介：郭 芳（1990—），女，河北盧龍人，碩士研究生，從事經(jīng)濟林栽培生理研究。E-mail：guofang901003@163.com。

通信作者：李保國，博士，教授，博士生導師，主要從事經(jīng)濟林栽培生理和山區(qū)開發(fā)技術研究及經(jīng)濟林栽培教學工作。E-mail：13582620586@163.com。 紅樹莓（Rubus idaeus L.）為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木，別稱覆盆子、馬林、托盤等，果實為聚合果，富含果糖、維生素、氨基酸等，風味香醇，酸甜可口，在世界上被譽為“黃金水果”，具有防癌、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛、抗血凝等保健藥用功能，現(xiàn)廣泛應用于化妝、醫(yī)藥、食品、保健等領域，成為最具潛力的第3代新興保健水果[1-2]。發(fā)展紅樹莓，大量的優(yōu)質(zhì)苗木是關鍵。目前，紅樹莓苗木生產(chǎn)主要依靠根蘗繁殖，不僅繁殖系數(shù)低、速度慢，而且連續(xù)根孽繁殖會造成品種退化，易通過苗木傳播土壤病蟲害。利用組織培養(yǎng)技術進行紅樹莓脫毒快繁是快速繁育優(yōu)良苗木的最佳途徑，我國已在獼猴桃、棗樹、草莓等樹種上建立了相關的繁育體系[3-5]。對于紅樹莓，前人的研究大多集中在最佳培養(yǎng)基篩選[6-10]，而對其培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究尚無報道。

6-BA為人工合成的細胞分裂素類化合物，能夠顯著促進細胞分裂、調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)運輸、促進植物新陳代謝等[11]。光強直接影響植物的生長發(fā)育和結(jié)構(gòu)特征，而封口材料則會影響培養(yǎng)瓶內(nèi)的通氣性，進而影響容器內(nèi)濕度及氣體與外界的交換。響應面分析法作為一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可以精確表述因素和響應值之間的關系，現(xiàn)已被廣泛用于多因素影響的試驗優(yōu)化上。本研究在6-BA、光照度、封口方式及增殖周期等單因素對紅樹莓組培苗增殖影響試驗的基礎上，將響應面法應用于紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以確立紅樹莓組織培養(yǎng)育苗技術體系，為紅樹莓組織培養(yǎng)工廠化育苗提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為“海爾特茲”紅樹莓繼代組培苗1 cm左右的帶芽莖段。MS基本培養(yǎng)基，其蔗糖含量為30 g/L，瓊脂為 5 g/L，高壓滅菌前pH 值為5.8。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 6-BA濃度對紅樹莓組培苗增殖的影響 光照度2 000 lx、增殖周期30 d、封口方式選擇無透氣孔的塑料蓋，設定6-BA處理濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。

1.2.1.2 光照度對紅樹莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、增殖周期30 d、封口方式選擇無透氣孔的塑料蓋，設定光照處理強度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx。

1.2.1.3 增殖周期對紅樹莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、封口方式選擇無透氣孔的塑料蓋，設定增殖處理周期分別為30、40、50、60 d。

1.2.1.4 封口方式對紅樹莓組培苗增殖的影響 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、增殖周期30 d，設定封口處理方式分別為無透氣孔的塑料蓋、普通封口膜。

1.2.2 紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化 采用響應面分析法，根據(jù)中心組合試驗（BBD）設計原理，確定6-BA、光照度、增殖周期3個因素作為中心組合試驗因子（表1），增殖系數(shù)為響應值，進行響應面試驗設計（表2）。

1.3 試驗方法

試驗于2015年8—10月在河北省南和縣河北至高點農(nóng)業(yè)科技有限公司組培中心進行，選用容積為240 mL的培養(yǎng)瓶，每瓶接入7個紅樹莓莖段，均勻分布；各試驗隨機區(qū)組設計，每處理20瓶，重復5次；培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)30 d，調(diào)查其增殖系數(shù)，培養(yǎng)條件為溫度（25±2） ℃，濕度（50±5）%，光周期14 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用LSD法及Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 6-BA濃度對紅樹莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨培養(yǎng)基中6-BA濃度的升高，紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，6-BA濃度達到1.5 mg/L時增殖系數(shù)達到最大，為5.267；當6-BA濃度增加到2.0 mg/L時，紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)反而減小，說明6-BA濃度為2.0 mg/L時紅樹莓組培苗的增殖生長受到抑制。因此，紅樹莓組培苗增殖的最適6-BA濃度為1.5 mg/L。

2.1.2 光照度對紅樹莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨光照度的增加，紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，光照度達到1 500 lx時，增殖系數(shù)達到最大，為6.419；當光照度增加到2 000 lx時，紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)反而減小，說明當光照度超過2 000 lx 時，紅樹莓組培苗的增殖生長受到抑制。因此，紅樹莓組培苗增殖的最適光照度為 1 500 lx。endprint

2.1.3 增殖周期對紅樹莓組培苗增殖的影響 由表3可知，隨增殖周期由30 d延長到40 d，紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)逐漸增加，增殖系數(shù)達到6.962，

2.1.4 封口方式對紅樹莓組培苗增殖的影響 由表3可知，以無透氣孔塑料蓋為封口材料的紅樹莓組培苗，其增殖系數(shù)顯著優(yōu)于普通封口膜（P<0.05），且以普通封口膜為封口材料的紅樹莓組培苗明顯發(fā)黃，甚至發(fā)生死亡，這一方面可能是由于普通封口膜完全將培養(yǎng)瓶密封，而塑料蓋與培養(yǎng)瓶之間為螺旋狀連接，增加了容器的透氣性，培養(yǎng)過程中CO2得到補充，從而提高了組培苗的光合自養(yǎng)能力，進而影響其增殖，另一方面可能是光透過普通封口膜后被吸收或反射了利于紅樹莓組培苗進行光合作用的光譜，使其凈光合速率降低。因此，增殖的最適封口方式為無透氣孔的塑料蓋。

2.2 紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 試驗結(jié)果回歸分析 根據(jù)表2試驗結(jié)果，以6-BA（X1）、光照度（X2）、增殖周期（X3）為自因素，以增殖系數(shù)（Y）為響應值，得回歸方程模型為Y=-42.607 86+9.666 19X1+0.015 516X2+1.671 83X3+0.000 9X1X2+0.022 857X1X3+0000 06X2X3-3.746 67X12-0.000 007X22-0021 367X32（R2=0.994 0），該回歸擬合模型經(jīng)方差檢驗達到極顯著水平（表4），響應值的變化有99.40%來源于所選自變量；該模型決定系數(shù)R2=0.994 0與決定系數(shù)R2Adj=0986 3相近，表明該方程與數(shù)據(jù)擬合度良好，試驗誤差小，可用于對紅樹莓組培苗增殖情況的分析預測。由表4可見，6-BA濃度、光照度、增殖周期的一次項、二次項變化對紅樹莓組培苗的增殖有極顯著影響，光照度和增殖周期交互項對紅樹莓組培苗增殖有顯著影響，而6-BA和光照度、6-BA和增殖周期交互項對紅樹莓組培苗增殖的影響不顯著，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系；失擬項檢驗P=0.109 3>0.05，說明試驗無其他顯著因素的影響，可信度比較高[12]。

2.2.2 響應面分析 通過多元回歸方程所作響應面曲線圖及等高線圖可以直觀地反映6-BA濃度、光照度和增殖周期對紅樹莓組培苗增殖的影響。由圖1、圖2、圖3可見，增殖周期對紅樹莓組培苗增殖的影響最為明顯，曲線面最陡；其次是光照度，曲線面較陡；影響作用最小的是6-BA濃度，曲線面趨于平緩；各因素所選范圍內(nèi)均存在極值點；光照度和增殖周期的交互作用顯著，6-BA和光照度、6-BA和增殖周期的交互作用不顯著。

2.2.3 模型方程的驗證 通過Design-Expert 8.0.5軟件求出回歸模型的極值點，得到以無透氣孔塑料蓋為封口材料時紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)的最優(yōu)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度1 390.81 lx、增殖周期41.97 d，此條件下增殖系數(shù)理論值為10.950。驗證試驗培養(yǎng)條件調(diào)整為6-BA 1.59 mg/L、光照度1 391 lx、增殖周期42 d，重復3次，得到增殖系數(shù)真實平均值為11.019，與理論預測值非常相近，這說明該模型可信，響應面法可用于紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

3 結(jié)論與討論

單因素試驗結(jié)果表明，紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)的最適 6-BA濃度為1.5 mg/L、光照度為1 500 lx、增殖周期為 40 d，以無透氣孔塑料蓋對容器進行封口。在此基礎上，設計BBD中心組合試驗進行響應面分析，得到紅樹莓組培苗增殖的最佳綜合培養(yǎng)條件為6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，此時紅樹莓組培苗的增殖系數(shù)理論值為10950，實際驗證增殖系數(shù)為11.019，兩者高度接近，說明響應面法用于紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化是可靠的。

6-BA是一種細胞分裂素，其主要作用是促進細胞分裂，但濃度過高則會抑制芽的發(fā)生。本研究中，當6-BA濃度大于1.5 mg/L時，紅樹莓組培苗的增殖開始受到抑制，而其影響紅樹莓生長的機理有待進一步研究。封口方式對組培苗的增殖會產(chǎn)生影響，封口方式不同使容器內(nèi)外的氣體交換產(chǎn)生差異，從而對培養(yǎng)容器中氣體組成[13]、芽伸長、溫度、濕度及增殖等產(chǎn)生影響[14-15]。Tsuro等試驗表明，透氣狀況的改善可提高增殖培養(yǎng)的效率[16-17]。本試驗中選擇無透氣孔的塑料蓋進行封口，對紅樹莓組培苗的增殖效果要顯著好于普通封口膜，除由于透氣不同外，也可能是光透過普通封口膜后，被吸收或反射了有利于紅樹莓組培苗進行光合作用的光譜，使其凈光合速率降低，從而導致增殖率降低，具體原因也有待進一步研究。

對于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，主要方法有單因素試驗、正交試驗法、響應面法等。單因素試驗常用于確定某一因素的使用范圍，方法簡單、容易，結(jié)果明了，但忽略組分間的交互作用，可能會完全丟失最適宜的條件；正交試驗法雖研究多因素、多水平的組合，但只能對一個個孤立的試驗點進行分析，并不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應值之間一個明確的函數(shù)表達式；響應面法采用多元二次回歸模型擬合各因素與響應值之間的關系，試驗數(shù)少、周期短、回歸方程精度高，并能克服正交試驗只能處理離散水平值，而無法找出最佳組合和響應值的缺陷[18]。近幾年，響應面法在食品學、生態(tài)學等領域得到廣泛應用[19-22]。本試驗選取6-BA濃度、光照度、增殖周期3個因素，利用響應面分析法優(yōu)化紅樹莓組培苗的增殖培養(yǎng)條件并獲得成功，為紅樹莓組織培養(yǎng)的工廠化育苗提供了一定的理論支撐。

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