CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其在單子葉植物中的應(yīng)用

徐繼法+徐艷+趙吉強(qiáng)+陳磊+郭善利+宋建成

摘要：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第3代人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)成為繼鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease，簡稱ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，簡稱TALENs）之后的新型高效定點(diǎn)的基因組編輯新技術(shù)。作為新型的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)擁有突變效率高、構(gòu)建簡單、花費(fèi)成本低等特點(diǎn)，自其出現(xiàn)之后，受到廣泛關(guān)注且得到迅速發(fā)展，給植物基因組研究和遺傳育種帶來革命性的變革。目前，該技術(shù)已經(jīng)在多種單子葉植物中實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)精確編輯，包括水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）等單子葉植物。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因編輯技術(shù)；單子葉植物；植物基因組；遺傳育種

中圖分類號： Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0021-04

收稿日期：2016-04-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：3137616）；山東省自然科學(xué)基金（編號：ZR2011CM044、ZR2011CM006）。

作者簡介：徐繼法（1987—），男，山東棗莊人，碩士，研究方向?yàn)橹参锓肿影l(fā)育生物學(xué)。E-mail：dongfengxjf@163.com。

通信作者：宋建成，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锓肿影l(fā)育生物學(xué)。E-mail：jcsong88@yahoo.com。 基因組編輯技術(shù)是指將目的基因整合到宿主基因的特定靶位點(diǎn)上，從而達(dá)到特異性的改造生物基因組DNA，是基因功能研究的重要方法?；蚪M編輯技術(shù)通過構(gòu)建人工核酸內(nèi)切酶將基因組靶位點(diǎn)雙鏈DNA片段特異性切割開斷裂（double strand broken，簡稱DSB），繼而使細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接（non-homologous end joining，簡稱NHEJ）和同源重組（homologous recombination，簡稱HR）這2種修復(fù)機(jī)制激活，斷裂DNA片段得到修復(fù)，使該位點(diǎn)出現(xiàn)插入和缺失以及同源片段重組，此過程不僅可以使基因發(fā)生突變也可實(shí)現(xiàn)同源重組，可以說真正實(shí)現(xiàn)了對基因的編輯。目前，能對基因?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)精確編輯的技術(shù)主要有鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，簡稱ZFNs）[1-2]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator like effector nucleases，簡稱TALENs）[3-4]、成簇的規(guī)律的間隔的短的回文重復(fù)序列和相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein，簡稱CRISPR/Cas9）[5-6]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用方面與ZFNs、TALENs相比具有巨大的優(yōu)勢，載體構(gòu)建操作簡單，對每1個(gè)基因靶位點(diǎn)修飾只需合成1個(gè)靶標(biāo)sgRNA，就能順利實(shí)現(xiàn)對基因組精確定點(diǎn)編輯，而ZFNs、TALENs的編輯操作則相對繁瑣復(fù)雜[7-8]；此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還擁有試驗(yàn)周期短、成本花費(fèi)低、易于推廣等特點(diǎn)。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新的突破性基因編輯技術(shù)出現(xiàn)，就得到迅速推廣與應(yīng)用。目前該系統(tǒng)在水稻、小麥、玉米、高粱等單子葉植物基因組中成功實(shí)現(xiàn)了精確定點(diǎn)編輯。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌在長期自然進(jìn)化過程中針對噬菌體、病毒和外源DNA入侵進(jìn)化形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)也是長期自然選擇的進(jìn)化結(jié)果。約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌都含有CRISPR/Cas9系統(tǒng)[9-10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由CRISPR序列元件及其位點(diǎn)附近的一系列保守的相關(guān)Cas蛋白基因（CRISPR-associated genes，簡稱Cas genes）組成。CRISPR/Cas9的基因座結(jié)構(gòu)相對簡單（圖1），主要由5′端的tracrRNA、Cas蛋白編碼基因、CRISPR位點(diǎn)組成。不同物種間CRISPR位點(diǎn)數(shù)目與重復(fù)序列的數(shù)目也有所不同[11-13]，但均包括3種序列（重復(fù)-間隔序列、Cas蛋白序列、前導(dǎo)序列）。重復(fù)-間隔序列由多個(gè)相同的重復(fù)序列及穿插其間的間隔序列組成，間隔序列可以特異性地識別外源DNA。

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的3個(gè)主要類型

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可分為3種不同的類型：TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ[14-15]。TypeⅠ系統(tǒng)是最復(fù)雜以及含有Cas蛋白最多的系統(tǒng)，主要分布于細(xì)菌和古細(xì)菌中，包含6個(gè)蛋白，核心蛋白元件為Cas3蛋白，具有核酸酶和解旋酶的功能。在防御外源DNA入侵時(shí)，多個(gè)Cas蛋白與成熟的crRNA共同結(jié)合形成CRISPR相關(guān)病毒防御復(fù)合物CASCAD（CRISPR associated complex for antivirus defense，簡稱CASCAD），在crRNA的介導(dǎo)下，CASCAD與入侵的外源DNA結(jié)合，促使CASCAD內(nèi)的crRNA與外源DNA的互補(bǔ)鏈配對形成R環(huán)結(jié)構(gòu)，Cas3的核酸酶識別R環(huán)結(jié)構(gòu)后先將互補(bǔ)鏈切開，隨后在Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再將非互補(bǔ)鏈酶切，使其降解。

Type Ⅱ系統(tǒng)主要分布于細(xì)菌中，結(jié)構(gòu)組分簡單，核心蛋白元件為Cas9蛋白，Cas9蛋白包含2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，1個(gè)在N端，有類似于Ruc核酸酶的活性；另1個(gè)在中部，有類似HNH核酸酶的活性[16]。Ⅱ型與其他2種類型有著截然不同的區(qū)別，成熟的crRNA是在Cas9蛋白獨(dú)立參與下進(jìn)行的，并與之結(jié)合形成復(fù)合物，即可對入侵的噬菌體DNA或是外源質(zhì)粒進(jìn)行酶切、降解。目前Ⅱ型在CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究中最為深入，而且是被改造的最成功的人工核酸酶[17-19]。endprint

Type Ⅲ系統(tǒng)主要分布于古細(xì)菌中，只有少數(shù)的細(xì)菌擁有該類型。該系統(tǒng)的核心蛋白元件為Cas10，具有RNA酶活性和類似于TypeⅠ的CASCAD功能，主要參與crRNA的成熟以及外源核酸的降解。根據(jù)系統(tǒng)的靶標(biāo)對象不同可將Ⅲ分成2種亞型：TypeⅢA、TypeⅢB，前者的靶標(biāo)對象為mRNA，后者為DNA，這也反映了自然界中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的多態(tài)性。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過使用CRISPR RNA（crRNA）來指導(dǎo)入侵核酸的沉默，為細(xì)菌和古細(xì)菌提供針對病毒和外源質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫。該適應(yīng)性免疫系統(tǒng)依賴于由crRNA所引導(dǎo)的特異性序列和Cas9蛋白的內(nèi)切核酸酶活性來清除入侵的病毒和質(zhì)粒DNA，其主要作用過程可通過以下3步進(jìn)行[20]：（1）間隔序列的獲得。當(dāng)外來的病毒或外源質(zhì)粒入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能鑒別入侵核酸中的幾個(gè)保守的緊鄰靶區(qū)域下游的原始相鄰堿基序列（protospacer adjacent motif，簡稱PAM），然后將臨近PAM的間隔序列（PAM，序列：NRG，其中R=G/A）修飾加工并整合到自身CRISPR基因座中。（2）CRISPR基因座的表達(dá)。CRISPR基因座先被轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，然后與tracrRNA形成一個(gè)雙鏈復(fù)合物，Cas9幫助RNase Ⅲ將復(fù)合物切割成小片段，即生成成熟的crRNA。（3）CRISPR系統(tǒng)特異性降解入侵的外源核酸。成熟的crRNA與tracrRNA結(jié)合形成發(fā)夾RNA，發(fā)夾RNA再與Cas9結(jié)合形成功能性復(fù)合物（Cas9/crRNA/tracRNA），然后在成熟的crRNA中的靶向核苷酸序列引導(dǎo)下將Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合至入侵的DNA的PAM處互補(bǔ)靶位點(diǎn)上，Cas9切割入侵的外源DNA靶序列，入侵的外源核酸被降解。

2012年，Jinek等針對雙鏈tracrRNA與crRNA基因的功能，設(shè)計(jì)出能模擬二者結(jié)合后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，簡稱sgRNA），sgRNA具備了crRNA-tracrRNA復(fù)合物的功能，在sgRNA-Cas9系統(tǒng)中sgRNA部分能與Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合并將后者引導(dǎo)至基因組上的靶位點(diǎn)處進(jìn)行結(jié)合與切割[21]。與目前廣泛使用的基于ZFNs以及TALENs的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的識別機(jī)制賦予了該打靶系統(tǒng)在合成組裝上無可比擬的優(yōu)越性，因其可以通過簡單的替換一段短的RNA分子來改變其序列識別的特異性，故而更為簡便、經(jīng)濟(jì)。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建及在單子葉植物中的研究進(jìn)展

2.1 植物Cas9蛋白的優(yōu)化選擇

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌細(xì)胞所特有的，因此運(yùn)用這一系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對動植物細(xì)胞的編輯，必須借助細(xì)菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)類型Ⅱ結(jié)構(gòu)簡單、便于操作，對靶序列的切割只需tracrRNA、Pre-crRNA、Cas9、RNase Ⅲ等4種成分。Cas9基因來源于化膿性鏈球菌Ⅱ型CRISPR獲得性免疫系統(tǒng)，編碼區(qū)全長為4 107 bp[21]。Cas9基因應(yīng)用于真核生物基因組編輯還需要添加核定位信號，以保證Cas9蛋白能定位到細(xì)胞核[17]。Cas9基因在植物基因組定點(diǎn)編輯時(shí)，目前主要采取植物密碼子優(yōu)化[17，22]，部分直接使用動物密碼子優(yōu)化[23-24]。Feng等研究對水稻SPP、YSA、ROC5基因進(jìn)行了準(zhǔn)確地定點(diǎn)編輯，通過對Cas9的密碼子進(jìn)行偏好性優(yōu)化，在Cas9碳端添加核定位信號，并用35S啟動子驅(qū)動Cas9表達(dá)，最后成功對基因進(jìn)行了定點(diǎn)編輯[25]。因此對植物基因組的編輯過程中都采用了該類型。

2.2 植物的CRISPR/Cas9編輯載體系統(tǒng)的構(gòu)建

目前大部分植物CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)采用常規(guī)的酶切連接克隆方法構(gòu)建Cas9/sgRNA表達(dá)載體，只適合同時(shí)打靶單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)靶點(diǎn)。Ma等構(gòu)建了一套適用于單子葉植物、雙子葉植物并可進(jìn)行多靶點(diǎn)修飾的pYLCRISPR/Cas9載體系統(tǒng)[26]。該載體系統(tǒng)利用PCR擴(kuò)增獲得多個(gè)含不同靶序列的sgRNA表達(dá)盒，并通過基于Ⅱs型限制性內(nèi)切酶（如BsaⅠ）的Golden Gate ligation[27]或者基于復(fù)合酶的Gibson Assembly[28]克隆技術(shù)，一次性整合到CRISPR/Cas9雙元載體上。此外，Orel等也設(shè)計(jì)了Gateway雙元T-DNA載體來共表達(dá)Cas9和sgRNA，并利用報(bào)告基因DGU.US來研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否使雙鏈DNA發(fā)生斷裂[29]。研究結(jié)果表明，當(dāng)二者被共轉(zhuǎn)化到水稻的愈傷組織時(shí)，只有含有報(bào)告基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)所轉(zhuǎn)入的愈傷組織上含有GUS著色點(diǎn)，對照只有報(bào)告基因無GUS著色點(diǎn)，說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中依然有活性進(jìn)行表達(dá)。其他的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)使用傳統(tǒng)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶克隆方法，需要多輪克隆將少數(shù)幾個(gè)sgRNA表達(dá)盒組裝到CRISPR/Cas9雙元載體。

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)能使植物細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，并且其基因編碼區(qū)產(chǎn)生的大部分突變會產(chǎn)生移碼或片段缺失，可導(dǎo)致靶標(biāo)基因的功能缺失，使植物遺傳性狀發(fā)生變異。由此可見，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建能迅速提高其應(yīng)用與推廣。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單子葉植物中性狀改良與基因功能的研究

目前由CRISPR/Cas9系統(tǒng)所介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)的應(yīng)用主要有植物功能基因組學(xué)研究、農(nóng)作物品種的優(yōu)良選育、有針對性地利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來改造農(nóng)作物品種，提高植物的抗病性、提高產(chǎn)量等[30]。目前該CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)被迅速推廣及利用，并已經(jīng)有多位研究者對該系統(tǒng)在水稻、小麥、玉米和高粱等多種植物中的應(yīng)用情況進(jìn)行了綜述，闡述該技術(shù)在這些植物的基因組編輯中的應(yīng)用以及可行性。endprint

Jiang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)靶向水稻細(xì)菌性疫病的易感基因的OsSWEET14和OsSWEET11的啟動子區(qū)域，并在水稻原生質(zhì)體中實(shí)施轉(zhuǎn)化，測序結(jié)果顯示靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)突變[31]。Xie等同樣利用該技術(shù)也構(gòu)建水稻3個(gè)不同位點(diǎn)的sgRNAs，檢測的突變效率為3%～8%；此外，研究者還發(fā)現(xiàn)構(gòu)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)在不完全匹配的基因組位點(diǎn)存在脫靶效應(yīng)，進(jìn)一步分析表明sgRNA與靶標(biāo)DNA的錯(cuò)配位置是決定Cas9/gRNA打靶特異性的關(guān)鍵因素[23]。為了最大限度地降低可能存在的脫靶效應(yīng)的影響，應(yīng)該謹(jǐn)慎選擇spacer序列，盡可能選擇序列特異性較高的位置。此外，結(jié)合植物研究的特點(diǎn)，針對同一個(gè)目標(biāo)基因，分別使用不同的spacer構(gòu)建獨(dú)立的基因敲除個(gè)體，進(jìn)而綜合分析試驗(yàn)結(jié)果是排除偶然因素干擾試驗(yàn)結(jié)果的行之有效的方法。

Wang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對小麥MLO基因的定向突變，即針對MLO基因的單個(gè)拷貝設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)，在原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植物中的結(jié)果表明，突變只發(fā)生在A基因組上[32]。結(jié)果表明，在多倍體的小麥中，利用基因組編輯技術(shù)既可以同時(shí)突變多個(gè)拷貝，也可以特異地突變單個(gè)基因拷貝。此外，該研究還利用基因組編輯系統(tǒng)引發(fā)的DNA自身修復(fù)途徑非同源末端連接（non-homologous end joining，簡稱NHEJ）在小麥MLO位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)插入，插入的片段可以穩(wěn)定遺傳。Sharma等利用面包小麥（Triticum aestivum）EST數(shù)據(jù)庫中的120萬條序列，采用嚴(yán)謹(jǐn)型參數(shù)裝配出27 268條contigs。在2 832條contigs中鑒定出3 327條EST-SSR和每個(gè)contig中可能的CRISPR結(jié)合位點(diǎn)，并指出利用CRISPR系統(tǒng)可能減少小麥植酸含量的重要靶標(biāo)基因[33]。

Liang等利用TALENs、CRISPR/Cas9等2種技術(shù)對玉米相關(guān)基因中分別進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，二者都在玉米原生質(zhì)體獲得了很高的突變效率。此外還發(fā)現(xiàn)，這2種系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米原生質(zhì)體靶基因突變的效率基本相似[34]。Xing等同樣也利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在原生質(zhì)體中對玉米的高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（ZmHKT1）的定點(diǎn)編輯，同時(shí)也使CRISPR/Cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因玉米植株中進(jìn)行了穩(wěn)定遺傳[35]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對單子葉植物的單一外源基因、內(nèi)源基因或是單子葉植物的多個(gè)基因進(jìn)行定向的基因編輯。然而，在應(yīng)用過程中Cas9蛋白的修飾、啟動子的選擇等要素對單子葉植物基因組編輯的效率影響完全不同，這在設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的實(shí)際操作過程中須要注意。以CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)正廣泛應(yīng)用于植物新基因的功能研究，比反義基因和RNA干擾（RNAi）技術(shù)的效果更好。因此，CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將更廣泛應(yīng)用于植物基礎(chǔ)生物學(xué)研究和作物遺傳改良中。

3 展望

CRISPR/Cas9技術(shù)自2013年初開始被成功應(yīng)用以來，已被迅速應(yīng)用于多種生物的研究，其在基因編輯中的優(yōu)越性是顯而易見的，相較于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)而言是高效的、精準(zhǔn)的，相對于TALENs和ZFNs技術(shù)而言，其操作更加簡便、敲除效率更高、基因編輯更加精準(zhǔn)，大大降低了脫靶機(jī)率。最近美國麻省理工學(xué)院和哈佛學(xué)院的張峰博士實(shí)驗(yàn)室又鑒定出2種與Cas9蛋白具有相似功能，同樣來源于CRISPR系統(tǒng)的Cpf1蛋白，形成了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)[36]。Cpf1的PAM特異性以及切割方式都不同于Cas9，這一發(fā)現(xiàn)無疑是對基于CRISPR的基因組編輯技術(shù)的重要補(bǔ)充。

CRISPR/Cas9及其相關(guān)技術(shù)系統(tǒng)的發(fā)展隨著植物功能基因組研究的開展，以及對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的深入研究，將全面推動基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用領(lǐng)域必然會越來越廣。毫無疑問，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將是一種強(qiáng)大而高效的輔助工具，它的出現(xiàn)為植物基因工程的研究提供了一個(gè)新的想法和思路，必將給植物基因組定點(diǎn)編輯和植物遺傳育種帶來革命性的變革。

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