拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中應(yīng)用的研究進(jìn)展

王超+郭堅(jiān)華+席運(yùn)官+田偉

摘要：生防細(xì)菌在植物病害生物防治中發(fā)揮著巨大作用，以拮抗細(xì)菌最常見。本文概述了生防細(xì)菌防治植物病害的作用機(jī)制，包括營養(yǎng)物質(zhì)和定殖位點(diǎn)的競爭、抗生作用和誘導(dǎo)植物抗病性；簡述了國內(nèi)外拮抗細(xì)菌分離、篩選及商業(yè)化等的研究進(jìn)展；并剖析了拮抗細(xì)菌應(yīng)用與發(fā)展中遇到的問題及改進(jìn)現(xiàn)狀；最后提出展望：拮抗細(xì)菌因其對環(huán)境無污染、對人畜安全、產(chǎn)品無殘留、對病原菌特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供可靠保障，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

關(guān)鍵詞：拮抗細(xì)菌；植物病害；生物防治；應(yīng)用研究

中圖分類號： S432 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0001-06

收稿日期：2016-04-26

基金項(xiàng)目：國家重大科技專項(xiàng)（編號：2014ZX07206001）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新引導(dǎo)資金[編號：CX（15）1044]。

作者簡介：王 超（1989—），男，山東臨沂人，博士，助理研究員，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：wcofrcc@126.com。

通信作者：郭堅(jiān)華，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：jhguo@njau.edu.cn。 植物病害威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，施用化學(xué)農(nóng)藥一直是人們防治植物病害的主要措施，具有殺菌譜廣、見效快、成本低等優(yōu)點(diǎn)。然而，長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染，危害人類健康并破壞生態(tài)平衡，病原菌抗藥性不斷增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)用藥量與病害發(fā)生程度相互遞增的惡性循環(huán)。生物防治因其對環(huán)境無污染、對人類和其他動(dòng)物安全、產(chǎn)品無殘留、對病原菌特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)得到世界各國的廣泛重視并發(fā)揮越來越重要的作用。植物病害生物防治不僅滿足了人們對綠色食品的需求，而且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了可靠保障。細(xì)菌、放線菌、真菌等有益微生物及其代謝產(chǎn)物已成功應(yīng)用于植物病害生物防治中，在有害生物綜合治理（integrated pest management，簡稱IPM）中發(fā)揮了重要作用。

1 生防細(xì)菌——防治植物病害的環(huán)保新選擇

2005年全球農(nóng)資類產(chǎn)品的銷售額約為267億美元，其中大多數(shù)產(chǎn)品為人工合成的化學(xué)農(nóng)藥[1]。2013年我國農(nóng)藥（折合相對有效成分110%含量）產(chǎn)量約319萬t，同比增長16%，其中殺菌劑產(chǎn)量為20.3萬t，同比增長33.8%[2]。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的非科學(xué)性選擇和大量濫用，農(nóng)藥毒性殘留造成環(huán)境污染，農(nóng)藥施用會對生態(tài)系統(tǒng)中其他非目的毒殺生物造成不良影響，農(nóng)藥的藥效也因有害生物抗藥性的產(chǎn)生而降低甚至喪失。另外，隨著生活水平的日益改善，人們對環(huán)境保護(hù)和食品安全逐漸重視，對綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的需求不斷上升，農(nóng)民和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者對植物病蟲害的防治逐步傾向于生態(tài)管控措施。與此同時(shí)，生物農(nóng)藥不斷發(fā)展，它們在總農(nóng)資投入中約占 2.5%，并以每年10%的速率不斷上升[3]。20世紀(jì)90年代以來，隨著“生態(tài)農(nóng)業(yè)”“有機(jī)農(nóng)業(yè)”以及環(huán)境保護(hù)呼聲日益增高，我國的生物防治迅速發(fā)展，成為小麥、水稻、玉米、棉花、果樹、蔬菜等作物病害綜合防控中的一項(xiàng)重要技術(shù)措施[4]。

生物防治，顧名思義就是利用生物農(nóng)藥降低有害生物的群體數(shù)量及不良影響，與其他防治方法的最大區(qū)別是生物農(nóng)藥作用方式的多樣性能夠有效避免有害生物抗性的快速產(chǎn)生[5-6]。生物農(nóng)藥包括活體生物（植物、昆蟲、線蟲和微生物）以及活體生物的代謝產(chǎn)物，其中微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌、病毒和酵母）及其相關(guān)產(chǎn)品所占的比重約為30%，這些微生物被稱為生物防治因子，是相對于化學(xué)農(nóng)藥的環(huán)境友好型植物健康管理新方式，具有無污染、無殘留、不殺傷天敵、不易產(chǎn)生抗藥性、利于人畜安全及環(huán)境保護(hù)、兼防兼治、增產(chǎn)增收等優(yōu)點(diǎn)。在谷物類、豆類、果實(shí)類、花類以及觀賞性植物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，微生物及相關(guān)產(chǎn)品被廣泛用于防治土傳、葉面以及采后病原物。目前被開發(fā)作為生物農(nóng)藥的細(xì)菌菌株主要集中于土壤桿菌（Agrobacterium sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.）[7]，其中芽孢桿菌占較大比例，比如美國Gustafson公司開發(fā)的枯草芽孢桿菌（B. subtilis） GBO3和短小芽孢桿菌（B. pumilus） GB34、美國Novozymes Biologicals公司開發(fā)的地衣芽孢桿菌（B. licheniformis） SB3086、德國Abitep GmbH公司開發(fā)的枯草解淀粉芽孢桿菌（B. subtilis var. amyloliquefaciens） FZB24等[3]。

來自我國、俄羅斯以及其他一些西方國家的發(fā)明專利和研究成果已經(jīng)證明了植物根圍促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）菌株在植物病害控制中的潛在價(jià)值。歐盟在1985年推出了枯草芽孢桿菌的第1款生物農(nóng)藥，隨后在60%～75%的棉花、花生、大豆、玉米、細(xì)糧類及蔬菜作物栽培中得到應(yīng)用，對鐮刀菌（Fusarium sp.）及絲核菌（Rhizoctonia sp.）等土傳病原菌的防治效果顯著[8]。在印度，已有40多位投資者通過與孔巴托Tamil Nadu農(nóng)業(yè)大學(xué)合作獲得了中央殺菌劑董事會的PGPR菌株大宗生產(chǎn)許可[9]。PGPR菌株在我國的成功應(yīng)用已有20多年歷史，使用面積達(dá)2 000萬hm2，已開發(fā)出20多個(gè)芽孢桿菌菌株生物農(nóng)藥用于防治作物土傳病害，如亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等[9]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所篩選獲得的枯草芽孢桿菌菌株Bs-916對多種病原真菌和水稻白葉枯病病菌[Xanthomonas campestris pv. oryzae（Ishiyama） Dye]都有顯著抑制作用，從1991年至今對水稻紋枯病田間防效穩(wěn)定在60%～81%，目前已進(jìn)行農(nóng)藥登記，年使用面積達(dá)6.7萬hm2[10-11]。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合研發(fā)的微生物農(nóng)藥“百抗”（10億CFU/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑）已獲得農(nóng)業(yè)部登記注冊，并在多個(gè)省份推廣使用，推廣面積約 4 667 hm2，用于防治水稻紋枯病、煙草黑脛病以及三七根腐病[11]。endprint

植物病害生物防治技術(shù)注重生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)和環(huán)境保護(hù)，因其社會效益、生態(tài)效益、長遠(yuǎn)利益而愈來愈引起人們的重視，利于我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的持久穩(wěn)定發(fā)展[12]。生防細(xì)菌能夠有效地控制植物病害，具有對人畜安全、環(huán)境相容性好、植物病原菌不易產(chǎn)生抗性、促進(jìn)植物生長等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足消費(fèi)者對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量和安全性的多重要求[11]。利用生防細(xì)菌防治植物病害是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢。

2 生防細(xì)菌防治植物病害的作用機(jī)制

生防細(xì)菌的直接作用機(jī)制包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)（抗生作用）、產(chǎn)生嗜鐵素競爭鐵元素、競爭定殖位點(diǎn)及營養(yǎng)物質(zhì)、鈍化病原物的寄生及增殖能力、降解病原物致病因子，間接作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[13]。實(shí)際上，生防細(xì)菌對病原物的抑制通常是上述機(jī)制協(xié)同、連續(xù)、綜合作用的結(jié)果[14]。

2.1 微生物拮抗作用

微生物拮抗作用通常發(fā)生于生活在同一生態(tài)位中的2種微生物之間，由二者的直接交互作用引起。生防細(xì)菌與病原菌之間的拮抗作用主要包括營養(yǎng)物質(zhì)的競爭、植物上定殖位點(diǎn)的競爭以及抗生作用[15]。

2.1.1 營養(yǎng)物質(zhì)的競爭 營養(yǎng)競爭是發(fā)生在生活于同一生態(tài)位、生理學(xué)需求相同的微生物之間的普遍現(xiàn)象，它們以此調(diào)節(jié)不同種群的數(shù)量，尤其是在營養(yǎng)成分有限的環(huán)境中。不同微生物對于營養(yǎng)成分的競爭在土壤等寡養(yǎng)環(huán)境中是非常普遍的，尤其是碳源物質(zhì)[16]。微生態(tài)環(huán)境中的生防細(xì)菌與其他微生物（包括病原菌）在定殖部位爭奪可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，包括微生物生長發(fā)育必需的氨基酸、碳水化合物、維生素、無機(jī)鹽等。對于微量營養(yǎng)成分的競爭也比較常見，比如競爭鐵元素是產(chǎn)嗜鐵素類假單胞菌屬菌株抑制病原真菌生長、降低植物病害發(fā)生率和嚴(yán)重度的主要機(jī)制之一[17-18]。鐵元素是微生物增殖過程中必需的營養(yǎng)成分之一，微生物分泌嗜鐵素獲取環(huán)境中的Fe3+，通過微生物特異性受體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)以滿足自身需求。不同種類的細(xì)菌性嗜鐵素對鐵元素的親和力不同，但真菌性嗜鐵素的親和力相對較低，生防細(xì)菌通常會爭奪病原真菌吸納的鐵元素[18]。

2.1.2 定殖位點(diǎn)的競爭 微生物為了在植物上成功定殖，它們之間的競爭會發(fā)生在根表面以及其他植物組織中。生防細(xì)菌在植物體表、體內(nèi)或根圍以及土壤中與病原微生物相互作用，尤其是針對病原菌侵入位點(diǎn)的爭奪。有研究表明，拮抗細(xì)菌在植物根表密集定殖后會阻擋病原菌進(jìn)入侵染位點(diǎn)[6]。黎起秦等發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B47主要定殖于番茄（Lycopersicon esculentum）維管束中，可以有效抑制番茄內(nèi)生病原菌的生長[19]。Bacon等從玉米（Zea mays）植株體內(nèi)分離到的內(nèi)生芽孢桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢菌（F. moniliforme Sheldon）具有相同的生態(tài)位點(diǎn)，生防芽孢桿菌能在植株體內(nèi)迅速增殖，從而有效降低串珠鐮孢菌的增殖及其毒素的積累[20]。此外，1株優(yōu)秀的生防細(xì)菌產(chǎn)生生防作用的第1步就是在寄主植物根圍以及其他生境中穩(wěn)定定殖[21]。蠟樣芽孢桿菌（B. cereus） AR156能在辣椒根圍穩(wěn)定定殖，增強(qiáng)植株對青枯病的抗性[22]。

2.1.3 抗生作用 抗生作用因一種微生物產(chǎn)生對另一種微生物具有毒性的次生代謝物質(zhì)而引起，是熒光類假單胞菌、芽孢桿菌等拮抗細(xì)菌發(fā)揮生防作用的主要機(jī)制。微生物產(chǎn)生的很多物質(zhì)對植物病原菌具有抑制作用，不僅包括嚴(yán)格意義上的抗生素類物質(zhì)，一些細(xì)菌素和酶類同樣具有抑菌效果[6，23-24]。芽孢桿菌能產(chǎn)生脂肽伊枯草菌素A和多馬霉素，破壞和抑制病原真菌菌絲體的形成，抑制產(chǎn)孢[25]。沙雷氏菌（Serratia plymuthica） C48產(chǎn)生的殼多糖酶能抑制灰霉菌（Botrytis cinerea）的孢子萌發(fā)和芽管伸長[26]。枯草芽孢桿菌AF1通過分泌β-1，4-N-乙?；被咸擒彰负挺?1，3葡聚糖酶產(chǎn)生抗真菌作用[27]。熒光假單胞菌[P. fluorescens（Trevisan） Migula]F113產(chǎn)生抗生素2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol，簡稱DAPG）來控制馬鈴薯軟腐病病原菌胡蘿卜歐氏菌[Erwinia carotovora ssp. atroseptica （van Hall） Dye][28]。一種特定的生防細(xì)菌往往產(chǎn)生多種具有不同功能的次生代謝物質(zhì)，對多種病原真菌具有拮抗作用，比如熒光假單胞菌CHA0能產(chǎn)生嗜鐵素、吩嗪類、DAPG及氰化物，強(qiáng)烈抑制全蝕病菌和根串珠霉菌[29]。李海峰等從水稻葉片表面分離到的枯草芽孢桿菌7Ze3能夠產(chǎn)生表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturinA）和環(huán)二肽等抗菌活性物質(zhì)，表現(xiàn)出較好的平板拮抗效果[30]。Yang等發(fā)現(xiàn)生防細(xì)菌熒光假單胞菌HC1-07通過產(chǎn)生氯霉素抑制病原菌，防治小麥根部病害[31]。

2.2 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性

為了應(yīng)對病原物，植物進(jìn)化產(chǎn)生了一套基礎(chǔ)防衛(wèi)系統(tǒng)和多重抵御屏障，這些防御機(jī)能可以被系統(tǒng)性地激發(fā)，從而降低病害的發(fā)病率及嚴(yán)重度。系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，簡稱SAR）由某種病原物初侵染引發(fā)的防衛(wèi)反應(yīng)激活，能對多種病原物產(chǎn)生長久抗性；誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance，簡稱ISR）與SAR作用效果相似，其防衛(wèi)反應(yīng)由有益細(xì)菌激發(fā)產(chǎn)生；SAR與水楊酸和病程相關(guān)蛋白的積累密切相關(guān)，ISR涉及茉莉酸及乙烯信號通路；SAR和ISR由NPR1（non-expressor of pathogenesis-related genes 1，即病程相關(guān)基因肺表達(dá)子1）蛋白共同調(diào)節(jié)[32]；SAR和ISR在表型特征上相似，主要包括誘導(dǎo)木質(zhì)素形成、產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白、積累伸展蛋白（hydroxyproline-rich glycoproteins protein，簡稱HRGP）、積累酚類物質(zhì)以及寄主植株防御酶活性增強(qiáng)等。接種假單胞菌WCS417r的康乃馨（Dianthus caryophillus）植株對鐮刀菌真菌引起的枯萎病感病性降低[33]，黃瓜（Cucumis sativus）對葉部病害炭疽病病菌（Colletotrichum orbiculare）的感病性降低[34]，這些是關(guān)于有益細(xì)菌激發(fā)ISR的首次報(bào)道。芽孢桿菌是激發(fā)ISR最常見的有益細(xì)菌，研究表明，枯草芽孢桿菌GBO3和解淀粉芽孢桿菌IN937a通過分泌揮發(fā)性有機(jī)物激發(fā)植物的ISR反應(yīng)[35]。蠟樣芽胞桿菌AR156能同時(shí)激發(fā)擬南芥植株的SAR和ISR，增強(qiáng)其對丁香假單胞菌番茄致病變種（P. syringae pv. tomato）菌株DC3000的抗性[36]；蠟樣芽胞桿菌AR156也可通過誘導(dǎo)防御性酶和防衛(wèi)基因增強(qiáng)水稻對紋枯病抗性[37]。Elbadry等發(fā)現(xiàn)蠶豆種子接種熒光假單胞菌和根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）后會對黃斑花葉病毒（BYMV）產(chǎn)生ISR[38]。Liu等同樣發(fā)現(xiàn)黃瓜接種惡臭假單胞菌（P. putida） 89B-27和黏質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens） 90-166 后會對黃瓜枯萎病病菌（F. oxysporum f.sp. cucumerinum）引起的枯萎病產(chǎn)生抗性[39]。Weller等發(fā)現(xiàn)熒光類假單胞菌屬菌株產(chǎn)生的DAPG同樣能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[40]。endprint

3 拮抗細(xì)菌的研究與應(yīng)用進(jìn)展

拮抗細(xì)菌，顧名思義是一些對其他微生物具有抑制作用的細(xì)菌，其抑制作用主要體現(xiàn)在產(chǎn)生抗生物質(zhì)、對營養(yǎng)物質(zhì)及生態(tài)位的競爭等。植物病原菌拮抗細(xì)菌的篩選和應(yīng)用是當(dāng)前植物病害防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，拮抗細(xì)菌在植物病害防治中發(fā)揮了非常重要的作用，主要優(yōu)勢在于細(xì)菌的數(shù)量和種類眾多，廣泛存在于植物根際和地上部，對植物生長環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)；繁殖速度快，易于培養(yǎng)；對病原菌的作用方式多樣，通過競爭、拮抗和寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等對病原菌產(chǎn)生影響；部分細(xì)菌在防治病害的同時(shí)可以增加作物產(chǎn)量。目前應(yīng)用較多的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬以及土壤桿菌屬細(xì)菌。

3.1 拮抗細(xì)菌的分離、篩選及商業(yè)化

拮抗細(xì)菌的分離多來源于土壤、植株病害組織，還有一些內(nèi)生拮抗細(xì)菌分離自植株病、健組織內(nèi)部[41-45]。徐劉平等以辣椒生境分離細(xì)菌為研究對象，首次建立了拮抗活性指數(shù)概念，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的拮抗指數(shù)高于外生細(xì)菌，以葉內(nèi)細(xì)菌的拮抗指數(shù)最高，表明內(nèi)生菌比植物外源的微生物更具有競爭力[46]。從病原菌寄主植物病健植株生境分離拮抗細(xì)菌是常見方法，王路遙等從小麥健株生境分離獲得了對禾谷鐮刀菌（F. graminearum）具有較好拮抗效果的細(xì)菌[47-48]；王超等從煙草病健植株生境中篩選得到的拮抗細(xì)菌對煙草青枯病溫室防效達(dá) 87.57%[45]；王宇光等則以枯萎病多年嚴(yán)重發(fā)病的香蕉園中感病致死植株包圍的正常掛果香蕉植株為研究材料，從中分離了對黃瓜枯萎病菌生理小種（F. oxyaporum f. sp. cubense）具有顯著抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌[49]。

平板對峙培養(yǎng)法是拮抗細(xì)菌篩選過程中的常用方法。例如，劉樂濤等通過拮抗菌平板對峙法試驗(yàn)從辣椒根際土壤中篩選出6株對辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）具有拮抗作用的細(xì)菌[50]；王超等采用平板對峙培養(yǎng)法篩選到對大白菜軟腐病具有較好防治效果的解淀粉芽孢桿菌DQ31[51]。但是，平板對峙培養(yǎng)法（離體抑菌圈篩選法）用于篩選拮抗菌株是依據(jù)微生物的抗生現(xiàn)象進(jìn)行的，可能會忽視許多有益的微生物而得不到理想結(jié)果。離體條件下細(xì)菌抑制病原菌的能力與其在植株活體上抑制此病原菌引起的病害不存在普遍的相關(guān)性，因此，在瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生最大抑菌圈的菌株并不一定是最好的生防因子，并且這些菌株通常無法表現(xiàn)出較好的田間防效。郭堅(jiān)華等則同時(shí)考慮細(xì)菌的抗生現(xiàn)象和定殖能力，發(fā)展出抑菌圈-定殖力雙重測定法，篩選到了具有較好田間防效和增產(chǎn)作用的辣椒青枯病拮抗細(xì)菌[52]。Yang等綜合考慮細(xì)菌的拮抗活性，以及產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和產(chǎn)嗜鐵素的活性，建立賦分評估系統(tǒng)，高效分離篩選用于防治生姜青枯病的拮抗細(xì)菌[53]。隨著微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展，可以對某一生境微生物群落進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測，探知優(yōu)勢微生物的分布，從而獲得該生境中的優(yōu)勢菌株[54]。黃毅等利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）分析了同一苗圃中健康小黑楊、感病但未發(fā)病小黑楊及發(fā)病小黑楊葉際的細(xì)菌微生物群落，結(jié)合地高辛探針標(biāo)記從健康楊樹葉片上分離到1株在自然生境中對楊樹灰斑病具有顯著抑制作用的優(yōu)勢細(xì)菌[55]。

分離篩選有效菌株是獲得較高農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值生防細(xì)菌的關(guān)鍵，通常從病原菌抑菌土或植物各生境中以稀釋涂平板法分離細(xì)菌菌株，然后以平板對峙培養(yǎng)法篩選對包括靶標(biāo)病原菌在內(nèi)的多種病原菌具有抑制作用的拮抗細(xì)菌[8，56-57]。然后，進(jìn)一步通過溫室試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)評價(jià)拮抗細(xì)菌的防治效果，有潛力的拮抗細(xì)菌則進(jìn)入田間與常用化學(xué)藥劑比較防治效果，有田間防效的拮抗細(xì)菌通過毒理學(xué)評測、產(chǎn)品登記、劑型選擇、成分優(yōu)化、規(guī)?；a(chǎn)等一系列過程獲得商業(yè)化[58-59]。對于專性寄生病原菌，陳穎瀟等直接通過溫室試驗(yàn)從非專性寄生病原菌拮抗細(xì)菌中篩選到了對黃瓜霜霉病具有較好防效的生防細(xì)菌[60]。

在拮抗細(xì)菌的商業(yè)化進(jìn)程中，最著名的是土壤放射桿菌K-84，它能有效抑制引起桃根癌病根癌土壤桿菌（A. tumefaciens）的生長，高濃度菌懸液處理植物種子、插條后抑菌防效高達(dá)100%，目前此菌系已在澳大利亞、美國等9個(gè)國家推廣應(yīng)用。另外，芽孢桿菌能夠形成具有較強(qiáng)抗逆能力的芽孢而備受研究者的青睞，由我國研制的無公害、無污染農(nóng)藥“百抗”（有效成分為枯草芽孢桿菌B908）已獲得農(nóng)藥登記注冊，對水稻紋枯病的田間防效達(dá)70%以上，美國已有4株芽孢桿菌屬生防菌株（MBI600、FZB24、QST713、GBO3）得到了美國環(huán)保署（EPA）商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[61-62]。武漢天惠生物工程有限公司登記并投產(chǎn)的枯草芽孢桿菌BS2208可濕性粉劑可防治灰霉病、白粉病2種病害，為細(xì)菌性植物保護(hù)劑，是多種植物病原菌的競爭性抑制劑；昆明沃霖生物工程公司登記注冊的由枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌復(fù)配的可濕性粉劑“根腐消”，通過灌根處理可防治三七根腐??；黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所研發(fā)的枯草芽孢桿菌水劑主要防治保護(hù)地蔬菜及瓜類枯萎病、立枯病和豆類根腐病，已在黑龍江等地推廣應(yīng)用[63]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的拮抗細(xì)菌復(fù)合微生物肥料“蔬得康”“寧盾”“使命”已商業(yè)化生產(chǎn)，在江蘇、福建、上海、山東等地推廣應(yīng)用[64-67]，對青枯病[68]、枯萎病[65，69]、疫霉病[66]、細(xì)菌性果斑病[70]等具有較好防效，并在葉菜類[71]、草莓[64]、黃瓜[67]、番茄[72]、大豆[66]等作物上表現(xiàn)出促生增產(chǎn)效果。

3.2 拮抗細(xì)菌的應(yīng)用與發(fā)展現(xiàn)狀

拮抗細(xì)菌是防治植物病害的重要生防因子之一，拮抗菌劑在國內(nèi)外生產(chǎn)實(shí)踐中取得了令人矚目的成就，顯示出它的巨大經(jīng)濟(jì)效益和廣闊應(yīng)用前景。當(dāng)然，也存在很多問題，比如生防效果不穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)性差、抑菌譜較窄、成本較高、使用方法繁瑣等。針對上述問題，科研工作者提出了很多解決方案。

研究表明，添加外源化合物是改善拮抗細(xì)菌拮抗效果的一種簡單、有效的途徑，Janisiewicz等發(fā)現(xiàn)，添加2-脫氧-D-葡萄糖能夠增強(qiáng)丁香假單胞菌（P. syringae）防治采后病害的能力，其原因可能是致病菌可吸收，但無法利用添加物而導(dǎo)致其生長受限[73]。拮抗細(xì)菌還可以與小劑量殺菌劑或抑菌有機(jī)物結(jié)合從而提高其拮抗效果。一些植物激素、有機(jī)化合物、無機(jī)化合物和某些化學(xué)離子同樣具有增強(qiáng)拮抗細(xì)菌抑菌效果的作用[74]。比如市場上在售的2.5%井岡霉素100億活芽孢/mL Bs水劑、6%井岡霉素240億活芽孢/g Bs可濕性粉劑[75]。Latha等將根際促生細(xì)菌與大蒜葉提取物復(fù)配對番茄早疫病病菌（Alternaria solani）的抑制率達(dá)到87%，復(fù)配組合顯著提高了番茄植株體內(nèi)抗病相關(guān)酶的活性[76]。此外，與化學(xué)農(nóng)藥配合使用可協(xié)助拮抗細(xì)菌克服定殖過程中與其他微生物群落的競爭，形成優(yōu)勢種群，同時(shí)發(fā)揮化學(xué)藥劑抑菌迅速、防效穩(wěn)定的優(yōu)勢，通過協(xié)同作用達(dá)到用量減少、優(yōu)勢互補(bǔ)、增強(qiáng)防效的目的[77]。蔡曉劍等在青藏高原特殊生境下研究了不同生防菌菌種混合以及與有機(jī)肥配合使用對辣椒疫病的防治效果，篩選出具有最佳防效的菌劑和物料配比，為辣椒疫病生防菌劑的研發(fā)和成果轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)[78]。王小慧等將土壤中分離篩選出的西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌與已腐熟的有機(jī)肥制成生物有機(jī)肥，在盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)出了較好的防病和促生效果，同時(shí)顯著改變了根際土壤的微生物群落組成[41]。endprint

對于單一拮抗細(xì)菌抑菌譜窄的問題，通過互作可實(shí)現(xiàn)多種拮抗細(xì)菌功能互補(bǔ)、多種病害兼防、作用持久的協(xié)同控病效果，比如將不存在寄生、拮抗、競爭或溶解等互斥關(guān)系的2種及2種以上的拮抗細(xì)菌混合，有利于混合菌株對植物不同部位的空間進(jìn)行全面占領(lǐng)；同時(shí)，混合菌劑能更好地適應(yīng)不同環(huán)境條件，可在更大的光、氣、溫、濕度變幅內(nèi)生存繁衍，從而更好地發(fā)揮菌株的協(xié)同控病效果[79]。張麗萍等將熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌和木霉菌（Trichoderma sp.）進(jìn)行復(fù)配，對蘋果輪紋病的防治效果達(dá)到84.2%，能夠顯著抑制蘋果輪紋病病菌（Botryosphaeria berengeriana）的生長，有助于提高蘋果產(chǎn)量，降低蘋果表面病菌濃度[80]。劉蘇閩等發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌劑在田間能有效防治草莓黃萎病，平均防效達(dá)76.8%，增產(chǎn)效果達(dá) 133.6%[81]。葛紅蓮等將5個(gè)功能互補(bǔ)的細(xì)菌菌株復(fù)配，發(fā)現(xiàn)復(fù)配菌劑AR99對辣椒青枯病溫室防效顯著高于單一菌株，AR99復(fù)配菌劑的田間防效達(dá)94.0%[82]。

采用基因工程、誘變等方法對拮抗細(xì)菌進(jìn)行改造，獲得營養(yǎng)生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、競爭能力強(qiáng)、抗菌物質(zhì)產(chǎn)量高的理想生防工程菌株，已成為生防細(xì)菌應(yīng)用領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，通過遺傳改良構(gòu)建的工程菌兼具殺蟲、防病等作用，且遺傳性狀穩(wěn)定[62]。張禮生等利用N+離子注入技術(shù)對枯草芽孢桿菌（Ehrenberg）生防菌株進(jìn)行誘變處理，選育出高效菌種，使其拮抗能力提高10%以上[75]。

拮抗細(xì)菌在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及大規(guī)模商品化過程中要保證較高的菌劑濃度、有效組分含量及恰當(dāng)?shù)膭┬?，以便拮抗?xì)菌在田間應(yīng)用時(shí)發(fā)揮最佳效果。因此，需要探究拮抗細(xì)菌的最佳生長溫度等發(fā)酵條件，優(yōu)化發(fā)酵工藝，確定拮抗細(xì)菌的最佳劑型。王玲等通過正交試驗(yàn)確定了辣椒青枯病病菌（Ralstonia solanacearum）拮抗細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌L009的最佳發(fā)酵條件[83]。胡敏等通過響應(yīng)面法優(yōu)化了枯草芽孢桿菌HJD.A32產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件，細(xì)菌素的效價(jià)比優(yōu)化之前提高了300%[84]。香蕉枯萎病病菌[F. oxysporum f. sp. cubense （E. F. Smith） Snyder et Hansen]拮抗細(xì)菌菌株海洋細(xì)菌 TC-1 的發(fā)酵條件優(yōu)化后其無菌發(fā)酵液的抑菌活性提高了174%[85]。芽孢沒有新陳代謝，能經(jīng)受多種環(huán)境傷害，包括熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等，這一特征使芽孢桿菌具有廣闊的應(yīng)用前景，對提高菌劑的倉儲期、維持菌劑生物活性非常重要，是制備微生物制劑的理想存在形式[86]。侯敏等對番茄枯萎病拮抗細(xì)菌S13的產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，芽孢產(chǎn)率達(dá)90%，為進(jìn)一步將該菌株應(yīng)用于復(fù)合生物肥奠定了基礎(chǔ)[87]。為了使拮抗細(xì)菌便于保存運(yùn)輸，提高其藥效和便于利用，需要將其制成合適的劑型，微生物農(nóng)藥的劑型種類很多，化學(xué)農(nóng)藥所涉及的劑型在生物農(nóng)藥中幾乎都有研究[88]。劑型研究是生防菌能否從實(shí)驗(yàn)室走向田間的關(guān)鍵步驟之一，對于農(nóng)用微生物殺菌劑的產(chǎn)業(yè)化意義重大。王琴等將植物根際土壤中分離所得的3種芽孢桿菌進(jìn)行膠懸劑和微膠囊的制備，并探究了不同劑型對芽孢桿菌抑菌作用的影響，為拮抗細(xì)菌的實(shí)際應(yīng)用提供了科學(xué)支撐[89]。我國目前已登記的農(nóng)用微生物殺菌劑的主要?jiǎng)┬褪强蓾裥苑蹌?，懸浮劑則是美國農(nóng)用微生物殺菌劑的主要?jiǎng)┬蚚90]。

4 展望

隨著人們對環(huán)境保護(hù)和食品安全的日益關(guān)注，安全、無污染的有益微生物類農(nóng)藥、肥料等農(nóng)業(yè)投入品的研究越來越受到人們重視。研究表明，生防細(xì)菌利于植物防病抗逆，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位[91]。植物病原菌拮抗細(xì)菌具有對環(huán)境無污染、對人畜安全、產(chǎn)品無殘留、對病原菌特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物病害防治中。拮抗細(xì)菌應(yīng)用于植物病害防治不僅滿足了人們對綠色食品的需求，而且能為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供可靠保障，拮抗細(xì)菌將會有廣闊的應(yīng)用前景，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

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