不同品種根類中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染研究
2017-11-17 10:35:44鄧彥王婭珂韓曉宇王雅琪江珍玉于志君鄧海英
中國(guó)中藥雜志 2017年21期
鄧彥 王婭珂 韓曉宇 王雅琪 江珍玉 于志君 鄧海英
[摘要]該研究通過對(duì)8種根類飲片共計(jì)40份樣本需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（total aerobic microbial count， TAMC）、酵母、真菌總數(shù)計(jì)數(shù)（total yeast and mould count，TYMC），探討不同作用類型根類中藥飲片微生物污染狀況；進(jìn)一步評(píng)價(jià)樣品耐膽鹽革蘭陰性菌污染載量，并運(yùn)用革蘭陰性桿菌生化鑒定系統(tǒng)對(duì)分離到的耐膽鹽革蘭陰性桿菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，85%（34/40）的樣品TAMC超過1 000 CFU·g-1，30%（12/40）的樣品TYMC超過100 CFU·g-1；45%（18/40）的樣品檢出耐膽鹽革蘭陰性菌污染，7批樣品檢測(cè)結(jié)果N>1 000 MPN·g-1，從13批樣品中分離出陰溝腸桿菌、河生腸桿菌、創(chuàng)傷埃希氏菌、坂崎腸桿菌等16株耐膽鹽革蘭陰性桿菌，其中陰溝腸桿菌是丹參樣品中分離到的優(yōu)勢(shì)菌；河生腸桿菌是麥冬樣品中分離到的優(yōu)勢(shì)菌；假結(jié)核耶爾森菌是黨參樣品中分離到的優(yōu)勢(shì)菌。上述研究結(jié)果表明，武漢市場(chǎng)中根類飲片存在較嚴(yán)重的微生物污染，微生物種類對(duì)藥材成分具有一定的選擇特異性，依據(jù)不同作用類型飲片所含化學(xué)成分有針對(duì)性地鑒定控制菌類型、制定控制菌檢驗(yàn)限度，對(duì)提高中藥飲片的安全使用具有重要意義。
[關(guān)鍵詞]根類飲片； 微生物限度； 耐膽鹽革蘭陰性菌； 控制菌
[Abstract]To investigate the microbial contamination in Chinese herbal decoction pieces with different functional types by studying the total aerobic microbial count （TAMC）， and total yeast and mould count （TYMC） in 40 samples of 8 types of root decoction pieces； further evaluate the contamination load of bileresistant Gramnegative bacteria， and identify the Gramnegative bacteria by using biochemical identification system for Gramnegative bacteria Our results showed that the TAMC value was more than 1 000 CFU·g-1 in 85% （34/40） samples， and was more than 100 CFU·g-1 in 30% （12/40） samples； the contamination of bileresistant Gramnegative bacteria was detected in 45% （18/40） of the samples The bileresistant Gramnegative bacteria load of seven batches of samples was N>1 000 MPN·g-1 Sixteen bacterium strains including Serratia plymouthensis， Cedecea neteri， Escherichia vulneris， Klebsiella oxytoca， Enterobacter amnigenus， E cloacae， E sakazakii， Proteus penneri and E gergoviae were obtained and identified E cloacae was the predominant bacterium that was isolated from Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， while E amnigenus， Yersinia pseudotuberculosis was the typical bacterium of Ophiopogonis Radix and Codonopsis Radix， respectively All these suggested that the contamination of bileresistant Gramnegative bacteria was severe for the root decoction pieces in Wuhan city Microbial species have certain selection specificity for medicinal ingredients， so the type and limit of control bacteria for detection should be formulated according to the pollution type and quantity of bileresistant Gramnegative bacteria.
[Key words]decoction pieces； microbe load； bileresistant Gramnegative bacterium； control bacterium
中藥飲片是一種特殊的藥品類型，既可以用于直接服用，又可作為制劑和配方的原料，其中根類飲片是中藥飲片的主要來源之一。由于根類藥材多來源于土壤，長(zhǎng)期接觸多種有害元素及微生物，其安全性是近年來關(guān)注的重點(diǎn)[12]，中藥飲片的微生物控制已被列入《中國(guó)藥典》2015年版[3]。耐膽鹽革蘭陰性菌是一類不發(fā)酵乳糖、可利用葡萄糖且可耐受膽鹽的革蘭陰性菌，包括沙門菌、志賀菌等腸道致病菌及粘質(zhì)沙雷氏菌等條件致病菌，在特定條件下可引起人類消化系統(tǒng)感染。文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌總體污染情況嚴(yán)重[45]，周爽等[6]對(duì)17個(gè)品種174批飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌污染狀況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示污染率達(dá)810%。《中國(guó)藥典》2015年版已將耐膽鹽革蘭陰性菌規(guī)定為非無菌產(chǎn)品檢驗(yàn)控制菌[3]，但因缺乏系統(tǒng)性累積數(shù)據(jù)，尚未對(duì)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)規(guī)定。歐美等國(guó)家藥典亦均規(guī)定植物性來源藥物的耐膽鹽革蘭陰性菌控制[7]。目前，關(guān)于中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染多限于部分品種的定性和半定量研究[89]，對(duì)不同類型飲片的微生物污染特點(diǎn)少有報(bào)道。相同作用類型的中藥飲片多具有相類似的物質(zhì)成分，在藥材生長(zhǎng)過程和貯存期常對(duì)不同微生物種類具有選擇特異性。本研究以8種常見中藥飲片為代表，考察了不同品種根類中藥飲片的微生物污染狀況，對(duì)樣品中污染的耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行定性定量檢測(cè)，分析比較不同作用類型根類中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性桿菌污染特點(diǎn)，并對(duì)污染原因進(jìn)行了探討，為針對(duì)性地制定根類飲片的控制菌檢驗(yàn)類型及限度提供依據(jù)。endprint
1材料
11儀器雙人單面凈化工作臺(tái)（SWCJ2FD，蘇州凈化）；生化培養(yǎng)箱（DHP90，上海索普儀器有限公司）；生物安全柜（美國(guó)Thermo公司）；立式壓力蒸氣滅菌器（LDZH150KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；醫(yī)用冷藏箱（HYC940，青島海爾）。
12藥材信息與分類分別以白術(shù)、黨參等8味中藥飲片為代表進(jìn)行試驗(yàn)，所有樣品均購于武漢市不同轄區(qū)零售藥店及醫(yī)院，由湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院康四和主任藥師鑒定，并在0～8 ℃條件下保存于武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)藥用功能，將各味飲片分別分為燥濕、補(bǔ)益、活血、潤(rùn)肺等類別（當(dāng)歸雖有活血作用，但其含有糖類、氨基酸等成分，具有補(bǔ)血功能，本研究將其歸入補(bǔ)益組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。信息見表1。
13菌株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CMCC （B） 26 003]；大腸埃希菌Escherichia coli [CMCC （B） 44 102]；銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC （B） 10 104]；枯草芽胞桿菌Bacilllus subtilis [CMCC （B） 63 501]；白色念珠菌Candida aibicans[CMCC （F） 98 001]；黑曲霉Aspergillus niger[CMCC （F） 98 003]（均由湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供）。
14培養(yǎng)基及試劑胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、pH 70氯化鈉蛋白胨緩沖液體培養(yǎng)基、腸道增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂平板、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基、葡磷胨水液體培養(yǎng)基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基適用性檢查均符合《中國(guó)藥典》2015年版和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》規(guī)定。革蘭染液、班氏試劑、甲基紅試劑及靛基質(zhì)試劑等購于杭州微生物試劑有限公司。J2003發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管、J2002腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管由杭州微生物有限公司提供。
2方法
21需氧菌總數(shù)及酵母、真菌總數(shù)計(jì)數(shù)依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版[2]規(guī)定，取樣品25 g，加入225 mL pH 70無菌氯化鈉緩沖蛋白胨稀釋液勻漿制備1∶10樣品勻液，并進(jìn)行方法適用性實(shí)驗(yàn)。將上述1∶10樣品勻液梯度稀釋為4個(gè)稀釋度1∶100，1∶1 000，1∶1萬，1∶10萬，分別取100 μL接種至胰酪大豆胨瓊脂平板，每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板，30～35 ℃培養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（total aerobic microbial count，TAMC）；同法取各樣品稀釋液100 μL接種至含001%氯霉素的沙氏葡萄糖瓊脂平板，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行酵母及真菌總數(shù)計(jì)數(shù)（total yeast and mould count，TYMC）。
22耐膽鹽革蘭陰性菌定性定量檢測(cè)取10 g樣品于無菌勻漿杯中，加入100 mL無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，1 500 r·min-1勻漿1 min，制成1∶10供試品溶液，20～25 ℃培養(yǎng)2 h。將預(yù)培養(yǎng)物用無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基梯度稀釋成 1∶100，1∶1 000，1∶1萬，1∶10萬的稀釋液，分別取1 mL不同稀釋度預(yù)培養(yǎng)物稀釋液，接種于10 mL無菌腸道增菌液體
培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng) 24～48 h。再取上述腸道增菌培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。有菌落生長(zhǎng)者，則對(duì)應(yīng)管判為陽性，無生長(zhǎng)則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管培養(yǎng)結(jié)果，查MPN值表知1 g供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最可能數(shù)（N）[3]。
23耐膽鹽革蘭陰性桿菌分離與鑒定根據(jù)22項(xiàng)培養(yǎng)結(jié)果，從細(xì)菌生長(zhǎng)明顯的紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一接種環(huán)菌，在普通瓊脂平板上做分區(qū)劃線，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取不同可疑單菌落，革蘭染色，顯微鏡下觀察形態(tài)，選取革蘭陰性桿菌，進(jìn)行分離純化。依據(jù)產(chǎn)品說明書，運(yùn)用相應(yīng)革蘭陰性細(xì)菌生化鑒定管對(duì)純化細(xì)菌進(jìn)行生化反應(yīng)，通過編碼查得鑒定結(jié)果。
24統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果運(yùn)用IBM SPSS Statistics進(jìn)行處理，P<005顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；運(yùn)用Graphpad Prism 50軟件作圖。
3結(jié)果
31需氧菌總數(shù)、酵母及真菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果分別采用平板涂布法對(duì)樣品需氧菌總數(shù)、酵母及真菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。凡樣品1∶10稀釋組在胰酪大豆胨瓊脂平板上或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上未見菌落生長(zhǎng)者，計(jì)其對(duì)數(shù)值為05。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，40批樣品中共有3批樣TAMC<10 CFU·g-1，3批樣品TAMC為10～1 000 CFU·g-1，34批樣品TAMC>1 000 CFU·g-1。根據(jù)對(duì)樣品不同作用類別統(tǒng)計(jì)，lgTAMC均值最高組為活血組，達(dá)453，其次為潤(rùn)肺組400，補(bǔ)益組377，燥濕組298，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0650），見圖1。酵母及真菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，12批樣品TYMC<10 CFU·g-1，14批樣品TYMC為10～100 CFU·g-1，12批樣品TYMC>100 CFU·g-1；不同作用類別中，活血組lgTYMC均值為206，潤(rùn)肺組176，補(bǔ)益組152，燥濕組140，各組間未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖1。
A需氧菌總數(shù)（TAMC）；B酵母、真菌總數(shù)（TYMC）。
32耐膽鹽革蘭陰性菌定性定量檢驗(yàn)結(jié)果樣品耐膽鹽革蘭陰性菌定量總體檢測(cè)結(jié)果顯示，8個(gè)品種40批樣品中，22批樣品在紫紅膽鹽平板上未見細(xì)菌生長(zhǎng)，18批樣品檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，占總樣本量45%（18/40）。其中，當(dāng)歸5批，黨參4批，天冬和丹參各3批，麥冬2批，川芎1批。半定量檢測(cè)結(jié)果顯示，N>1 000 MPN·g-1的樣品有7批，分別為黨參2批，天冬2批，當(dāng)歸、麥冬、丹參各1批。檢出樣品主要集中于補(bǔ)益組和潤(rùn)肺組，見表2。endprint
33不同品種及生產(chǎn)地域樣品耐膽鹽革蘭陰性菌檢驗(yàn)結(jié)果根據(jù)本實(shí)驗(yàn)半定量檢驗(yàn)結(jié)果，分別對(duì)不同檢出量進(jìn)行賦值，N<10賦值05，10
34耐膽鹽革蘭陰性桿菌鑒定結(jié)果本研究從13批根類飲片中分離鑒定出耐膽鹽革蘭陰性桿菌16株，菌株鑒定結(jié)果見表3。其中活血組分離到陰溝腸桿菌2株，普里毛斯沙雷氏菌、奈特氏西地西菌及產(chǎn)酸克雷伯菌各1株；潤(rùn)肺組分離到河生腸桿菌2株，陰溝腸桿菌、坂崎腸桿菌及格高菲腸桿菌各1株；補(bǔ)益組分離到假結(jié)核耶爾森氏菌2株、創(chuàng)傷埃希氏菌、普里毛斯沙雷氏菌、潘尼變形桿菌及泰勒奇腸
A 8種飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢測(cè)；B 不同地區(qū)生產(chǎn)飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢測(cè)。
圖2不同根類藥材耐膽鹽革蘭陰性菌定量檢測(cè)結(jié)果分布
Fig2The results of bileresistant Gramnegative bacteria analyzed based on sample kind and distribution
桿菌各1株。所分離的陰溝腸桿菌、河生腸桿菌、假結(jié)核耶爾森氏菌3種菌的鑒定結(jié)果見表4。
4討論
根類藥材是中藥材的主要來源之一，由于生長(zhǎng)于土壤中，其所攜帶背景微生物復(fù)雜，并在種植過程中受施肥等因素影響易造成外來微生物的污染。我國(guó)飲片企業(yè)生產(chǎn)條件差異大，生產(chǎn)過程質(zhì)量控制水平不一致，致使部分企業(yè)根類飲片極易殘存藥材本底微生物。同時(shí)在飲片貯藏過程中保管不嚴(yán)格，也會(huì)造成新的微生物污染。中藥飲片因其藥物特殊性，其微生物控制，尤其是致病菌的控制已成為藥物安全性控制的主要內(nèi)容之一。本研究選用8種常見的根類藥材飲片作為研究對(duì)象，根據(jù)其作用類型分為燥濕、補(bǔ)益、活血、潤(rùn)肺組等幾個(gè)類別，對(duì)40批樣品微生物污染現(xiàn)狀及原因進(jìn)行探討。通過需氧菌總數(shù)、酵母及真菌總數(shù)計(jì)數(shù)，85%（34/40）的樣品TAMC超過1 000 CFU·g-1，30%（12/40）的樣品TYMC超過100 CFU·g-1，表明所檢測(cè)根類飲片微生物污染情況較為嚴(yán)重。各類別間lgTAMC均值雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但活血組、潤(rùn)肺組中同組不同樣品間差異較小，表明該類樣品較其他樣品具有更高細(xì)菌污染水平。補(bǔ)益組與潤(rùn)燥組中不同樣品間差異較大，
表4耐膽鹽革蘭陰性桿菌鑒定代表性
Table 4The representative results of of bacterial strains identified in the samples
菌株陰溝腸桿菌河生腸桿菌假結(jié)核耶爾森菌
硫化氫---
苯丙氨酸---
葡萄酸鹽++-
蛋白胨水---
枸櫞酸鹽++-
尿素--+
賴氨酸---
鳥氨酸+--
棉子糖++-
山梨醇++-
側(cè)金盞花醇---
木糖+++
氨基酸對(duì)照---
動(dòng)力++-
甲基紅--+
葡萄糖產(chǎn)氣+++
提示該類樣品微生物污染程度差異可能與生產(chǎn)、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)有關(guān)。
耐膽鹽革蘭陰性菌為一大類條件致病菌，廣泛存在于人與動(dòng)物腸道及自然界中，在特定條件下可引起人類消化系統(tǒng)感染。本研究對(duì)所收集的40批樣品中耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果有45%（18/40）的樣本檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，檢出陽性率低于文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[46]，主要是由于選用的藥材品種、樣品數(shù)量及不同生產(chǎn)單位微生物控制水平不同所致。研究中選用了凈制、切制等飲片樣品，排除了炮制加工方法的影響，提示藥材種植及品種所含成分等因素可能是造成耐膽鹽革蘭陰性菌污染程度差異的重要原因。目前大量藥材品種均實(shí)現(xiàn)人工種植，耐膽鹽革蘭陰性菌主要來源于人與動(dòng)物消化道，在動(dòng)物排泄物中具有較高含量，種植過程中施肥等因素易造成耐膽鹽革蘭陰性菌污染。同時(shí)微生物在生長(zhǎng)過程中受藥材成分影響，不同種類的微生物對(duì)藥材成分具有一定的選擇特異性，而相同功能作用的藥材往往具有相近的成分類型。本研究圖2A結(jié)果顯示，黨參、當(dāng)歸、天冬等補(bǔ)益、潤(rùn)肺類樣品lgTAMC均值高，且耐膽鹽革蘭陰性菌污染載量較高，提示樣品需氧菌污染主要來源于耐膽鹽革蘭陰性菌污染，這可能與樣品中所含多糖類成分可促進(jìn)該類污染菌的生長(zhǎng)有關(guān)；白術(shù)樣品lgTAMC均值高，但全部樣品則均未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，提示白術(shù)樣品中的需氧菌污染主要來源于其他類型的細(xì)菌。因此，中藥飲片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可依據(jù)藥材成分不同，如多糖類成分，分別擬定不同的耐膽鹽革蘭陰性菌限度值；對(duì)于含有多糖等成分的飲片在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)應(yīng)提出更嚴(yán)格的微生物控制措施。
本研究40批樣品的生產(chǎn)地分別來源于7個(gè)省區(qū)，通過對(duì)其生產(chǎn)地進(jìn)行分析，顯示8種飲片樣品主要來源于湖北、安徽等地區(qū)，其耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率分別為412%，462%，具有較高的檢出率。研究中部分藥材盡管產(chǎn)地一致，但不同飲片生產(chǎn)單位的樣品污染程度存在差異，如當(dāng)歸均來源于甘肅，其飲片微生物檢測(cè)結(jié)果差別較大，這可能是由于不同企業(yè)生產(chǎn)管理水平不一致造成的，提示提高生產(chǎn)管理水平可有效降低微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。
本文對(duì)分離的不同單菌落進(jìn)行革蘭染色，經(jīng)顯微鏡下檢視，結(jié)果以革蘭陰性桿菌為主，僅見極少數(shù)革蘭陰性球菌?；诟锾m陰性桿菌在消化道感染疾病中的重要意義，本研究對(duì)分離的耐膽鹽革蘭陰性桿菌進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定，結(jié)果13批樣品中共分離出革蘭陰性桿菌16株，其中從丹參（Sal1，Sal4）中分離出陰溝腸桿菌2株，從麥冬（Oph3，Oph4）中分離到河生腸桿菌2株、從黨參（Cod1，Cod5）中分離到假結(jié)核耶爾森氏菌2株、從黨參（Cod3）中分離到普里毛斯沙雷氏菌1株，并從川芎（Chu5）、麥冬（Oph4）、黨參（Cod4）3個(gè)樣品均同時(shí)分離到2種不同細(xì)菌。提示同一品種飲片往往攜帶有相似類型的一種或多種細(xì)菌，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，也證實(shí)了不同類型細(xì)菌對(duì)藥材成分具有選擇特異性。本研究分離菌株均屬腸桿菌科細(xì)菌，多數(shù)為條件致病菌，這類細(xì)菌過去在食品藥品檢驗(yàn)中未引起足夠重視。但近年來，隨著對(duì)陰溝腸桿菌臨床分布及耐藥性研究的深入，臨床樣本中陰溝腸桿菌的分離率越來越高，且由于廣譜抗生素的濫用，導(dǎo)致由多重耐藥陰溝腸桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染越來越常見[1314]，提示在飲片的控制菌類型研究工作中，對(duì)于樣品中分離到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，需進(jìn)一步進(jìn)行致病性及耐藥性研究。本研究還在麥冬Oph4樣品中分離到一株阪崎腸桿菌，該菌是嬰幼兒奶粉中的檢驗(yàn)控制菌[15]，屬于A類致病菌，值得重視。
本研究在對(duì)8種根類飲片進(jìn)行微生物污染總體評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行了定性定量檢測(cè)，對(duì)其中的耐膽鹽革蘭陰性桿菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)不同種類和作用類型飲片微生物污染特點(diǎn)進(jìn)行探討，為中藥飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌檢驗(yàn)限度及特定控制菌類型標(biāo)準(zhǔn)制定奠定了基礎(chǔ)。
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