川芎抗腦缺血的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a—as機制研究

方翔　杜建民　彭友

[摘要] 目的 觀察川芎抗腦缺血的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as機制。 方法 取清潔級昆明種小鼠66只，隨機分為川芎組（n=22）、模型組（n=22）、對照組（n=22）。川芎組、模型組采用線栓法建立昆明種小鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）局灶性缺血再灌注模型。川芎組利用立體定位儀在側(cè)腦室注射川芎提取物治療，模型組不接受任何治療。采用Bederson評分法對小鼠神經(jīng)學(xué)進行評估，并分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，通過GFAP免疫化學(xué)分析鑒定原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的純度，分析川芎抗腦缺血的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as機制。 結(jié)果 3組小鼠建模前Bederson評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。川芎組與模型組建模后1天Bederson評分均顯著高于對照組（P<0.05）。建模后1 d、2 d以及處死前，川芎組經(jīng)治療后小鼠Bederson評分明顯低于模型組（P<0.05）。川芎組昆明小鼠梗死面積明顯小于模型組（P<0.05），對照組昆明小鼠未建立模型，未見梗死面積。鏡下可見原代小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞生長良好，所有細(xì)胞均貼壁生長。免疫組化染色法鑒定結(jié)果顯示，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP免疫陽性反應(yīng)率均在98.0%以上。PCR檢測結(jié)果顯示，川芎組小鼠海馬組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as水平顯著高于模型組（川芎組：2.47±1.21；模型組：1.01±0.27，P<0.05）。 結(jié)論 腦缺血昆明種小鼠采用川芎提取物治療效果良好，藥物能直接影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as基因水平。

[關(guān)鍵詞] 川芎提取物；腦缺血；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；Ube3a-as機制

[中圖分類號] R96 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）28-0031-05

[Abstract] Objective To observe the mechanism of chuanxiong against cerebral ischemic glial cells Ube3a-as. Methods 66 Kunming mice with the clean grade were selected and randomly divided into chuanxiong group （n=22）， model group （n=22） and control group（n=22）. The thread-occluded method was used to establish a model of middle cerebral artery occlusion（MCAO） focal cerebral ischemia and reperfusion of Kunming mice in chuanxiong group and the model group. Chuanxiong group was treated with injection of chuanxiong extract by stereotaxic device in the lateral ventricle. The model group did not receive any treatment. Mice neurology was assessed using the Bederson score method. The hippocampal glial cells were isolated and cultured. And the mechanism of chuanxiong against cerebral ischemic glial cells Ube3a-as was analyzed through identifying the purity of primary glial cells with GFAP immunochemical analysis. Results There was no significant difference in the Bederson score among the three groups before modeling（P>0.05）. The scores of Bederson in the chuanxiong group and model group at 1 day after modeling were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. The Bederson score of the mice in chuanxiong group after treatment was significantly lower than that in model group at 1 day， 2 days of modeling and before the execution（P<0.05）. The infarct area of Kunming mice in chuanxiong group was significantly lower than that of the model group（P<0.05）. The Kunming mice in the control group did not establish model. The infarct area did not occur in Kunming mice of the control group. It can be seen that the primary mice glioblast astrocytes were well grown and all cells were adherent under the microscope. Immunohistochemical staining identification results showed that the GFAP immune positive response rate of hippocampus astrocytes was above 98.0%. The level of Ube3a-as in glial cells of hippocampus in chuanxiong group（2.47±1.21） was significantly higher than that of model group（1.01±0.27） （P<0.05）. Conclusion The treatment effect of the extract of chuanxiong on Kunming mice with cerebral ischemia is good， and the drug can directly affect the Ube3a-as gene level of glial cells.endprint

[Key words] Chuanxiong extract； Cerebral ischemia； Glial cells； Ube3a-as mechanism

腦卒中（Stroke）是臨床的常見病，為腦梗死及蛛網(wǎng)膜下腔出血的總稱。臨床上，根據(jù)腦卒中的類型可以將其分為缺血性腦卒中及出血性腦卒中，其機制均為中樞神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞缺血缺氧性死亡[1]。目前，國際上對于腦卒中治療以藥物治療為主，且有許多針對神經(jīng)元保護的藥物，但是藥物長期療效欠佳，難以達到預(yù)期的治療效果[2]。神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）理論為神經(jīng)元保護藥物的開發(fā)提供了新的思路。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，主要由神經(jīng)元、血腦屏障、小膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。而血腦屏障包括[3]星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和基底膜。膠質(zhì)細(xì)胞屬于腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一受損細(xì)胞，易出現(xiàn)肥大、增殖等作用，從而形成相對復(fù)雜的“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”調(diào)控機制，因此，臨床上針對神經(jīng)血管單元進行藥物開發(fā)提高腦卒中臨床效果具有重要的作用[4]。

文獻報道顯示[5]：將川芎注射液運用于腦卒中效果理想，藥物能提高臨床療效，促進機體恢復(fù)。川芎屬于傘形科高木屬植物，具有活血行氣、消散淤血及祛風(fēng)止痛等功效，藥物中的活性物質(zhì)為川芎嗪（TMP），能提高SOD活性，降低氧自由基對脊髓缺損的損失[6]。同時，TMP還能提高白介素-6含量，減輕機體內(nèi)炎癥反應(yīng)，但是該結(jié)論尚未得到進一步證實[7]。為了探討川芎抗腦缺血的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as機制，本研究選取醫(yī)院動物實驗室昆明種小鼠66只，經(jīng)建立相關(guān)模型后觀察川芎對腦缺血的治療效果及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1主要儀器和試劑

采用的儀器和試劑主要有2，3，5-氯化三苯基四氮唑（批號2603c312）、戊巴比妥鈉（批號 051135）、XTZ-D解剖顯微鏡、DMR+Q550 病理圖像分析儀、MDT-380AT型超低溫冰箱、超凈工作臺、0.6號尼龍漁線等，相關(guān)試劑和儀器廠家如下，見表1。

1.2 實驗動物

選取醫(yī)院動物實驗室提供的昆明種清潔級小鼠66只（雄性42只，雌性24只），平均體質(zhì)量（27.45±4.75）g，周齡（1～4）周，許可證號：SYXK2016-0160。飼養(yǎng)條件符合國家二級動物房飼養(yǎng)及運動干預(yù)，室溫（23±3）℃，相對濕度：55.0%～60.0%，每天換風(fēng)2次，并進行12 h黑夜、光照更替。對昆明種小鼠處理符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)則，隨機分為川芎組（n=22）、模型組（n=22）、對照組（n=22）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腦中動脈阻塞（MCAO）局灶性缺血再灌注模型建立 川芎組、模型組采用線栓法建立昆明種小鼠局灶性缺血再灌注模型，對照組不做任何處理。利用鋒利的剃須刀將尼龍漁線切割成段，每段4 cm，頭端0.5 cm均勻包裹704硅橡膠，在常溫下固定，時間24 h，鏡頭下篩選出頭端光滑原段、直徑為0.2～0.23 cm的尼龍線，備用。利用記號筆在線栓距離頭端4 mm及8～9 mm部位進行標(biāo)記，浸泡在生理鹽水中，備用[8]。采用改良線栓法制備小鼠MCAO/R模型病進行適當(dāng)?shù)母倪M。將線栓從頸總動脈經(jīng)頸外動脈，圍術(shù)期僅分離結(jié)扎頸總動脈，不分離結(jié)扎頸外動脈及頸內(nèi)動脈。小鼠腹腔內(nèi)注射0.2 mL濃度為1%戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉生效后從頸部正中切口分離左側(cè)頸總動脈4 mm到頸內(nèi)動脈及頸外動脈分叉部位，穿雙線，備用。結(jié)扎頸總動脈近心端，采用微動脈夾在頸總動脈分叉下方夾閉頸總動脈血流后，采用顯微剪做一個小切口，插入線栓并固定在頸總動脈上[9]。松開微動脈夾，將線栓緩慢地沿著總動脈插入頸內(nèi)動脈，操作過程中密切觀察進入頸外動脈。線栓插入深度距頸總動脈分叉約4 mm時，提示線栓接近頸內(nèi)動脈顱點。在插入距離頸總動脈8～9 mm時，提示線栓頭端已經(jīng)達到大腦中部起始部位。扎進絲線固定線栓，縫合切口，術(shù)后注意保溫，待小鼠蘇醒后單獨放置在籠中。缺血3 h后拔出栓線并結(jié)扎頸總動脈殘端，繼續(xù)進行24 h灌注，完成動物模型的建立[10]。

1.3.2 昆明種小鼠的處理 昆明種小鼠模型建立完畢后第1天，川芎組利用立體定位儀在側(cè)腦室注射川芎提取物治療，有效成為分川芎，根據(jù)小鼠體重8 mg/100 g進行注射治療，每天注射1次，連續(xù)注射3 d（1個療程），對照組為健康小鼠，不做處理[11]。3 d后采用斷頸方法處死小鼠，取小鼠海馬，剪碎消化40 min后離心（2500 rpm×10 min），按106個/cm2密度進行接種，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)7～9 d，待細(xì)胞融合80.0%后開始傳代培養(yǎng)。

GFAP免疫化學(xué)分析鑒定原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的純度。組織切片用0.01M PBS（pH7.4）沖洗3次后，用3% H2O2/甲醇溶液室溫孵育切片30 min，消除組織中的內(nèi)源性過氧化物酶活性。之后PBS充分沖洗切片3次，每次10 min。用含0.3% Triton X-100和5%正常山羊血清的0.01M PBS溶液室溫孵育切片30 min。封閉處理完畢后棄去封閉液，分別用Rabbit anti-c-Fos抗體（1∶600稀釋）、Rabbit anti-GFAP抗體（1∶500稀釋）4℃孵育24 h。陰性對照用0.01M PBS代替一抗。孵育完畢后PBST（含1% Triton X-100沖洗切片3次，每次10 min。生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗稀釋液（用10%Triton X-100、10%山羊血清的0.01M PBS稀釋，比例為1∶4），室溫孵育切片2 h，隨后用PBST充分沖洗切片3次，每次10 min。在 DAB 顯色液（三蒸超純水1 mL，依次加入濃縮型DAB試劑盒中的A、B、C試劑各50 μL，混勻）中，處理 5 min左右，PBS充分沖洗切片。切片經(jīng)自然晾干后進行酒精逐級脫水（75%酒精，95%酒精，100%酒精（兩級）和二甲苯（兩級）透明，Olympus顯微鏡觀察GFAP表達情況。endprint

1.4 觀察指標(biāo)

觀察建模前、建模后1 d、2 d及處死前昆明小鼠Bederson評分情況，得分越低，治療效果越理想。Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)[12]：0級：無神經(jīng)缺損體征；1級：將小鼠尾巴提起，癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；2級：除1級體征外，向癱瘓側(cè)推小鼠時阻力較從對側(cè)明顯降低；3級：除以上體征外，小鼠向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)。通過GFAP免疫化學(xué)分析鑒定原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的純度[13]。取2～3代制備的細(xì)胞，接種在培養(yǎng)細(xì)胞中，運用siRNA轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Ube3a-as的RNA表達水平，相關(guān)操作步驟必須嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒操作說明進行[14]。小鼠大腦組織經(jīng)制備成4 μm切片，采用TTC染色計算腦梗死面積。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件處理，計數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗。計量資料以（x±s）表示，多組計量資料比較采用ANOVA方差分析檢驗方差齊性后行t檢驗、LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組小鼠Bederson評分比較

3組小鼠建模前Bederson評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。川芎組與模型組建模后的Bederson評分均顯著高于對照組（P<0.05）。建模后1 d、2 d以及處死前，川芎組經(jīng)治療后小鼠Bederson評分明顯低于模型組（P<0.05），見表2。

2.2 海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分離及鑒定

原代小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞鏡下可見細(xì)胞生長良好，所有細(xì)胞均貼壁生長。采用免疫組化染色法鑒定，細(xì)胞的GFAP免疫陽性反應(yīng)率均在98.0%以上，見封三圖4。

2.3 梗死面積計算

對照組昆明小鼠未建立模型，未見梗死面積，川芎組昆明小鼠梗死面積（39.21±2.35） mm2明顯小于模型對照組（45.13±3.46）mm2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組無梗死，模型組大面積梗死，川芎組梗死面積較小。見封三圖5。

2.4川芎抗腦缺血的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as機制

PCR檢測結(jié)果顯示：川芎組小鼠組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as的RNA表達水平顯著高于模型組（川芎組：2.47±1.21；模型組：1.01±0.27；P<0.05）。

3 討論

缺血性腦血管病又稱腦卒中，占全部腦血管病的70.0%～80.0%，且每年新增病例約150萬。與其他疾病比較，其具有發(fā)病率高、致殘率高及治愈率低等特點，成為威脅我國居民健康的第三大疾病。腦缺血再灌注損傷屬于腦卒中的一種，是一種能引起永久性神經(jīng)功能缺損的并發(fā)癥。目前膠質(zhì)細(xì)胞保護靶點研究的熱點集中在四方面：膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的相互關(guān)系、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及調(diào)控、膠質(zhì)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)上的偶聯(lián)、膠質(zhì)細(xì)胞本身內(nèi)在功能及調(diào)控機制[15]。

近年來，川芎（Ligusticum wallichii）在缺血性腦卒中得到廣泛應(yīng)用，且效果理想。本研究中，3組小鼠建模前Bederson評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。川芎組與模型組建模后1 d、2 d直至處死前Bederson評分均顯著高于對照組（P<0.05）。建模后1 d、2 d以及處死前，川芎組經(jīng)治療后小鼠Bederson評分明顯低于模型組（P<0.05）。川芎屬于傘形科蒿木屬植物，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效，其主要活性成分為川芎嗪（TMP），化學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪，能有效降低氧自由基對脊髓缺血的損傷作用；增加白介素-6含量，降低組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕炎癥反應(yīng)，具有神經(jīng)保護作用，臨床上可用于治療肺癌、腎臟疾病以及腦血管病[16-20]。除抗氧化作用外，TMP還能抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡。腦組織缺氧缺血后，電鏡觀察顯示細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，核不規(guī)則，染色質(zhì)高度凝聚邊緣化，凋亡細(xì)胞增多；TMP處理后，細(xì)胞損傷減輕，凋亡細(xì)胞減少。在真核生物基因組中，非編碼蛋白DNA也有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（RNA），這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、剪切和修飾等方面有重要的功能，與疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療密切相關(guān)。本研究中，對照組昆明小鼠未建立模型，未見梗死面積，川芎組昆明小鼠梗死面積明顯小于模型組（P<0.05）。哺乳動物基因組中非編碼轉(zhuǎn)錄物（non-coding RNAs，ncRNAs）可分為短ncRNAs（長度小于200 nt）和長ncRNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）。本研究中，原代小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞鏡下可見細(xì)胞生長良好，所有的細(xì)菌均貼壁生長。采用免疫組化染色法鑒定，細(xì)胞的GFAP免疫陽性反應(yīng)率均在98.0%以上。

Ube3a（Ubiquitin-proteinligase E3A，Ube3a）基因也稱人類腺病毒E6相關(guān)蛋白（humanpapillomavirus E62associatedprotein，E62AP）基因，是一個印記基因，僅特異地表達父源或母源的等位基因。該基因的母源突變導(dǎo)致Angelman綜合征（Angelmen syndrome，AS），父源突變引起Prader-Willi綜合征（Prader-Willi syndrome，PWS）[21]。本研究中PCR檢測結(jié)果顯示：川芎組小鼠組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as水平顯著高于模型組（P<0.05）。由此可見：Ube3a-as是Ube3a基因的反義轉(zhuǎn)錄物（antisense transcript，AT），通過負(fù)性調(diào)節(jié)作用抑制Ube3a的表達，減輕細(xì)胞損傷。

綜上所述，腦缺血昆明種小鼠采用川芎提取物治療效果確切，藥物能直接作用在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3a-as中，能提高臨床治療效果，促進機體恢復(fù)，值得推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2017-08-01）endprint