雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

王淑菁 付 瑞 李曉波 王 吉 岳秉飛

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

王淑菁 付 瑞 李曉波 王 吉 岳秉飛

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

目的：建立雞胚致死孤兒病毒CELO的熒光定量PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)該病毒在雞胚及禽源性生物制品中的快速檢測(cè)。方法 根據(jù)CELO L5 纖突1序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其線性、特異性、精密性、靈敏度進(jìn)行考察。運(yùn)用建立的方法對(duì)40份SPF雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種進(jìn)行CELO檢測(cè)。結(jié)果：建立的熒光定量PCR其最佳線性范圍為1x109～1x104拷貝/μl，R2值達(dá)0.99以上，特異性良好，與其他種屬的腺病毒及流感病毒間均無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度為102拷貝/μl；熒光定量PCR方法檢測(cè)40份SPF雞胚尿囊液和16株流感毒種結(jié)果為陰性。結(jié)論：本研究所建立的雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，特異性好，敏感性高，為雞胚及禽源性生物制品中的快速檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

雞胚致死孤兒病毒；熒光定量PCR；雞胚

雞胚致死孤兒病毒（CELO）屬于禽腺病毒I型，為無(wú)包膜雙股DNA病毒，主要引起雞的包涵體肝炎、再生障礙性貧血、呼吸道感染、出血性腸炎和產(chǎn)蛋量減少，常與禽類呼吸道病原微生物混合感染，導(dǎo)致死亡率增加[1，2，3]。2008年制定的SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中要求SPF雞和雞胚需要排除禽腺病毒I型的感染[4]。此外，2015年版《中國(guó)藥典》中也規(guī)定流感病毒主種子毒種也需要進(jìn)行外源性禽腺病毒I型的檢測(cè)，排除外源性病毒的污染[5]。

目前國(guó)標(biāo)中規(guī)定的禽腺病毒I型的檢測(cè)方法是瓊脂擴(kuò)散法，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性差[4]。本研究旨在建立一種檢測(cè)禽腺病毒I型代表株CELO病毒的熒光定量PCR方法，能夠快速、靈敏的檢測(cè)CELO病毒。

1 材料與方法

1.1 病毒

CELO毒種（ATCC VR-432）購(gòu)于ATCC；禽腺病毒III型（EDS株）購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所；小鼠腺病毒（MAdV）均購(gòu)買于ATCC；猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均為本科室保存。H1N1、H3N2、B型流感病毒為疫苗廠家送檢毒種。

1.2 主要試劑

Takara MiniBEST Viral RNA/DNA 提取試劑盒試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；TaqMan Universal PCR Master Mix購(gòu)自Applied Biosystems公司。SPF雞胚購(gòu)買于北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 熒光定量PCR方法的建立

1.3.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

擴(kuò)增CELO29763-30208區(qū)域，得到446bp目的片段，測(cè)序后將目的片段轉(zhuǎn)入pMD19-T質(zhì)粒中，作為CELO質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 方法的建立

針對(duì)CELO六鄰體蛋白446bp保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，引物和探針序列如下：CELO-F：CGCTTACTGCCGTTTAGCT，CELO-R：GGCATAGCTTGTCACTTGAATGGT，

探針：FAM-CCGCTGACCACGCCAC-NFQ，探針標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。引物與探針均由英俊上海公司合成部合成。PCR反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10μl，探針引物混合物（10μM）1μl，無(wú)RNA酶水7μl，模板2μl。反應(yīng)條件：50℃2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及最佳線性范圍的確定

建立的熒光定量PCR方法對(duì)各濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均進(jìn)行考察，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定該方法的最佳線性范圍。

1.3.4 特異性考察

提取CELO、禽腺病毒III型EDS、鼠腺病毒，猴腺病毒-1，猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒的核酸DNA，進(jìn)行熒光定量PCR，考察該引物和探針的特異性。

1.3.5 靈敏度考察

倍比稀釋構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，從109至100拷貝/μl，每個(gè)稀釋度重復(fù)三次，考察該方法的靈敏度，以陽(yáng)性檢出率為100%的最低稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度。

1.4 方法的應(yīng)用

使用熒光定量PCR方法對(duì)40份SPF雞胚尿囊液和16株流感病毒主種子批毒種進(jìn)行檢測(cè)。其中16株流感病毒毒種包括3株H1N1亞型、6株H3N2亞型、7株B亞型.

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最佳線性范圍：當(dāng)CELO標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別在109～104拷貝/μl時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2值可達(dá)0.998，擴(kuò)增效率為96.184%。

2.1.2 特異性：檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)CELO病毒時(shí)，出現(xiàn)FAM熒光擴(kuò)增曲線。禽腺病毒III型、鼠腺病毒、猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒提取DNA樣品均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性良好，與其他腺病毒及流感病毒株無(wú)交叉反應(yīng)。見圖1

圖1 熒光定量PCR方法的特異性

2.1.3 靈敏度：以陽(yáng)性檢出率為100%的最低稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)CELO標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為102拷貝/μl。見圖2。

圖2 熒光定量PCR方法的靈敏度

2.2 方法的應(yīng)用

使用熒光定量PCR方法檢測(cè)40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種中是否存在CELO污染，結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照CELO毒種出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種擴(kuò)增曲線均無(wú)抬起，判定為CELO陰性。見圖3。

圖3 40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種CELO熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前新建立的CELO熒光定量PCR方法對(duì)于檢測(cè)雞胚和禽源性生物制品中是否存在外源性CELO病毒污染具有重要意義。新建立的CELO熒光定量PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法相比，建立的熒光定量PCR靈敏度高，最低檢測(cè)可達(dá)102拷貝/μl，特異性好，與其他種屬的腺病毒及流感病毒間均無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間更短，僅需要1天時(shí)間即可完成全部實(shí)驗(yàn)。對(duì)于污染了極其微量的外源性CELO病毒時(shí)也可以及時(shí)檢出，更好的保證雞胚和禽源性生物制品的安全性。

[1]周斌，劉華雷，曹瑞兵.污染疫苗的禽腺病毒分離和鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（3）：78-80.

[2]付瑞，王淑菁，岳秉飛，等.雞胚致死孤兒病毒PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29（4）：9-11.

[3]殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

王淑菁，女，助理研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。