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    視黃醇對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

    2017-11-17 06:23:17顧蓓蓓盧勁曄
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2017年16期
    關(guān)鍵詞:視黃醇腺泡活性氧

    顧蓓蓓 馬 卉 盧 煒 劉 靜 盧勁曄*

    (1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    視黃醇對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

    顧蓓蓓1馬 卉1盧 煒2劉 靜2盧勁曄2*

    (1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    本文探討視黃醇對(duì)大鼠大腸桿菌乳腺炎氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。選用72只清潔級(jí)SD大鼠,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(n=36)。懷孕后10d起,灌胃視黃醇(溶劑為大豆油)8000I.U/kg·d,連續(xù)灌注10d;對(duì)照組灌胃等體積的大豆油。產(chǎn)后72h,經(jīng)乳頭管灌注LPS 10μɡ/側(cè)到第四對(duì)乳腺內(nèi)。分別于灌注前(0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)頸靜脈放血處死大鼠后采樣。髓過(guò)氧化物酶活力檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)觀察顯示,視黃醇降低了LPS誘發(fā)炎癥過(guò)程中中性粒細(xì)胞在組織中的積聚與持續(xù)激活,有效控制了細(xì)胞損傷,并加快了組織修復(fù);同時(shí),視黃醇處理顯著降低LPS灌注后IL-8及外周血PMN活性氧的釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,灌胃視黃醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性乳腺炎大鼠PMN引起的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用。

    視黃醇;中性粒細(xì)胞;活性氧;乳腺炎;大鼠

    乳腺炎是導(dǎo)致奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一。由于乳腺炎是由多種非特異病原微生物引起的,目前尚無(wú)有效的疫苗進(jìn)行防治;抗生素和糖皮質(zhì)激素雖然對(duì)乳腺炎有一定的治療作用,但是乳汁中的藥物殘留會(huì)危害人的健康[1]。盡管乳腺組織中存在多種抗菌物質(zhì),如溶菌酶、乳鐵蛋白等,嗜中性粒細(xì)胞(PMN)仍然是乳腺抵御外源病原微生物最主要的效應(yīng)細(xì)胞[2]。

    當(dāng)乳腺遭受病原微生物或外源性致熱源侵襲時(shí),PMN首先被動(dòng)員,從毛細(xì)血管經(jīng)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)入感染部位,識(shí)別和吞噬入侵病原?;罨腜MN通過(guò)釋放活性氧殺滅病原微生物,但PMN的持續(xù)過(guò)度激活,所產(chǎn)生氧化劑(次氯酸、酪氨?;龋┥蛇^(guò)量,超過(guò)局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí),能降解蛋白多糖,減少細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺上皮的粘附性,引起乳腺上皮細(xì)胞的死亡從而促進(jìn)乳腺上皮的脫落和泌乳功能的損傷[3]。體外研究表明活化的PMN釋放的活性氧自由基對(duì)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性作用[4]。

    視黃醇是一類(lèi)天然或人工合成的維生素A及其衍生物,能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、PMN的功能)[5]。研究表明視黃醇通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化水平,抑制機(jī)體超氧化物的產(chǎn)生保護(hù)乳腺組織[6]。本實(shí)驗(yàn)研究了灌喂一定劑量的視黃醇對(duì)LPS誘發(fā)乳腺炎癥引起的中性粒細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用,深入闡明視黃醇對(duì)乳腺組織的保護(hù)機(jī)理。

    1 材料與方法

    108只清潔級(jí)健康SD大鼠,購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,其中雌鼠72只,體重260~300g,均未孕;雄鼠36只,體重350~400g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將雌鼠與雄鼠按2:1同籠飼養(yǎng),使之交配受孕。大鼠自懷孕第10d起,灌喂8000I.U/kg·d視黃醇(溶解于大豆油),對(duì)照組大鼠灌喂等量的大豆油,連續(xù)灌喂10d。大鼠產(chǎn)后72h經(jīng)乳頭管注入內(nèi)毒素10μg/側(cè)到大鼠第四對(duì)乳腺(雙側(cè))內(nèi),正常對(duì)照組注入等量滅菌的生理鹽水。分別于灌注前(定義為0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)頸靜脈放血處死動(dòng)物,收集血清及肝素抗凝血500μL,采集乳腺組織,部分中性甲醛液固定,部分置于液氮后轉(zhuǎn)存于-70℃中用于后續(xù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳腺組織的病理組織學(xué)觀察

    圖1 灌注大腸桿菌內(nèi)毒素后乳腺組織PMN的動(dòng)態(tài)變化(H.E.200×)C、T分別為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組灌注LPS前0h,灌注后2、4、8、16、24h乳腺組織PMN的變化

    組織病理學(xué)觀察顯示:LPS灌注前對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腺泡結(jié)構(gòu)均清晰可見(jiàn),腺泡腔內(nèi)乳汁充盈(腺泡內(nèi)均勻分布的紅色區(qū)域?yàn)橹橹?;灌注LPS后,對(duì)照組第4h起腺泡中開(kāi)始出現(xiàn)較多的PMN,同時(shí),組織損傷開(kāi)始出現(xiàn),乳汁分泌量明顯減少;組織病理變化第8h最為嚴(yán)重,此時(shí)腺泡腔內(nèi)充滿PMN,致使腺泡結(jié)構(gòu)模糊難辨;第24h結(jié)果顯示乳腺組織損傷有所修復(fù)。與對(duì)照組相比,視黃醇處理加快了PMN向腺泡內(nèi)遷徙及炎癥反應(yīng)的進(jìn)程,降低了組織損傷的程度;實(shí)驗(yàn)組病理變化最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)同樣出現(xiàn)在LPS灌注后第8h,但病變程度要明顯輕于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組在第16 h腺泡內(nèi)的PMN數(shù)量已經(jīng)明顯減少,乳腺的泌乳功能也有所恢復(fù)。

    2.2 灌注LPS后乳腺組織與血清中MPO的活性變化

    圖2 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中MPO活性的變化

    乳腺組織中(圖2 A)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MPO活性均先上升后下降。對(duì)照組灌注LPS后,MPO活性迅速上升,最高峰值出現(xiàn)在第8h(P<0.01),第16h該酶的活力仍顯著高于0h(P <0.05);實(shí)驗(yàn)組在第8h達(dá)到峰值(P <0.05)后迅速下降,第16h已恢復(fù)至正常水平;血清中(圖2B)的變化規(guī)律與組織中相反,MPO活性無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組同0h相比均先降后升,最低點(diǎn)同樣出現(xiàn)在LPS灌注后的第8h,到24h有所恢復(fù)。

    2.3 灌注LPS后乳腺組織與血清中IL-8的活性變化

    圖3 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中IL-8的變化

    如圖3所示,與0h相比,LPS灌注后第8 h對(duì)照組乳腺組織中IL-8含量極顯著升高8h乳腺組織中IL-8的活性(P <0.01),而實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化。與相應(yīng)的0h相比,對(duì)照組第8h(P <0.01),實(shí)驗(yàn)組第4h(P <0.05)、8h(P <0.01)血清中IL-8含量顯著升高;與對(duì)照組相比視黃醇處理的實(shí)驗(yàn)組顯著下調(diào)第8hIL-8的含量(P <0.05)。

    2.4 外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

    圖4 LPS灌注后外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5),LPS灌注乳腺組織后,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血PMN活性氧釋放均顯著升高;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,LPS灌注后第16h外周血PMN活性氧的釋放極顯著降低(P <0.01)。

    3 討論

    乳腺炎包括乳腺感染、乳腺炎癥、微循環(huán)和免疫障礙等的綜合癥,是制約奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。大量循環(huán)血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙,是乳腺炎發(fā)生時(shí)的重要特征[7]。在本研究中,病理切片結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在灌注LPS前乳腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰,腺泡腔內(nèi)乳汁充盈,灌注LPS后2h腺泡腔內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)PMN并在第8h達(dá)到浸潤(rùn)高峰,乳腺組織損傷嚴(yán)重,此后PMN浸潤(rùn)程度減輕,第24h基本恢復(fù)至正常水平。MPO是PMN的標(biāo)志酶,組織中MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度[8],與病理切片結(jié)果一致,灌注LPS后,乳腺組織中MPO活性升高,同樣在第8h達(dá)到峰值,血清中的變化趨勢(shì)則與組織中相反,先降低而后升高,灌注后第8hMPO活性最低,動(dòng)態(tài)反映了循環(huán)血液中PMN向乳腺組織遷徙的過(guò)程。

    吞噬細(xì)胞,主要是嗜中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵抗感染的主要非特異性防御細(xì)胞,任何PMN功能的障礙均會(huì)影響乳用家畜的生產(chǎn)性能[2]。PMN吞噬病原微生物主要是通過(guò)釋放活性氧自由基(ROS)實(shí)現(xiàn)的,但是ROS的產(chǎn)生在殺滅病原微生物的同時(shí),對(duì)宿主細(xì)胞和吞噬細(xì)胞本身也會(huì)造成損傷[3]。本研究中,LPS灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),ROS釋放均顯著升高,視黃醇處理極顯著的下調(diào)了LPS灌注后第16h ROS的釋放。該結(jié)果與先前的報(bào)道(第一章)視黃醇能提高機(jī)體的抗氧化能力一致,這可能是視黃醇保護(hù)乳腺組織的重要機(jī)制之一。

    LPS是重要的免疫細(xì)胞激活劑,通過(guò)激活NFκB/AP-1刺激單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[9]。白細(xì)胞介素(IL)-8是炎癥發(fā)生時(shí)一種重要的趨化因子,對(duì)PMN有激活作用,可以誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類(lèi)、整合素上調(diào)以及呼吸爆發(fā)等。研究表明視黃醇可以抑制NFκB/AP-1活性從而下調(diào)相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)。在本研究中,LPS灌注后對(duì)照組血清中IL-8顯著升高并在第8 h達(dá)到峰值,視黃醇處理則顯著降低了該時(shí)間點(diǎn)IL-8釋放,表明視黃醇通過(guò)下調(diào)IL-8水平降低PMN活性氧的釋放,從而保護(hù)乳腺組織。

    4 小結(jié)

    PMN是乳腺發(fā)生感染時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞,PMN通過(guò)釋放大量高毒性的活性氧在消滅病原微生物的同時(shí)亦會(huì)引起乳腺組織的損傷。孕鼠灌胃視黃醇促進(jìn)PMN迅速遷徙、粘附,發(fā)揮吞噬活性,同時(shí)視黃醇抑制PMN持續(xù)激活,降低活性氧的過(guò)度釋放,減輕PMN對(duì)乳腺組織的損傷。

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    江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研課題(編號(hào):NSF201609);江蘇省現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心開(kāi)放課題(編號(hào):TGC2XKF1402);江蘇高校品牌專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目(PPZY2015C230)。

    顧蓓蓓(1983—),江蘇興化人,博士,研究方向:乳腺炎的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

    盧勁曄(1983—),江蘇邗江人,博士。

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