絨山羊精子檢測方法簡介

楊文凱(遼寧省家畜家禽遺傳資源保存利用中心，遼寧 遼陽 111000)

絨山羊精子檢測方法簡介

楊文凱
(遼寧省家畜家禽遺傳資源保存利用中心，遼寧 遼陽 111000)

精液采集后應(yīng)立即對其品質(zhì)進(jìn)行全面檢查，為精液處理及使用提供參考依據(jù)。檢查的內(nèi)容包括：顏色、射精量、活力、密度、畸形精子率、頂體完整率、存活時(shí)間等。

1 射精量

可直接用注射器吸取測量，測量時(shí)將針頭尖部磨平，以使集精杯中的精液全部吸入注射器內(nèi)，排出氣泡，讀取數(shù)值即可。也可以采用稱重法測量射精量。

2 活力

可分目測法和儀器測定法兩種。

2.1 目測法

用200～600倍的光學(xué)顯微鏡，觀察視野中直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比。例如視野中有60%的精子直線運(yùn)動(dòng)，即活力為0.6，其它依此類推。肉眼目測活力存在一定的誤差，但是只要人員相對固定、測定數(shù)量較多形成經(jīng)驗(yàn)后，準(zhǔn)確性會(huì)明顯提高。并且目測法具有測定速度較快，比較適合人工授精現(xiàn)場操作和大批量生產(chǎn)凍精的要求。為確保測定的準(zhǔn)確性，可以定期將目測結(jié)果與儀器測定結(jié)果進(jìn)行比對。

2.2 儀器測量法

精液樣品制成平板壓片，即在載玻片上滴一滴精液，蓋上載玻片即可，放在37～38℃顯微鏡恒溫載物臺(tái)上或有保溫箱的顯微鏡下觀察。可用平板壓片法在200～400倍恒溫顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 密度

3.1 目測法

在300～600倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，分為密、中、稀三個(gè)等級(jí)。密，視野中精子很多，精子間的空隙不足容納一個(gè)精子，很難看出單個(gè)精子的活動(dòng)情況；中，視野中精子間有容納1～2個(gè)精子的空隙；稀，視野中精子之間的空隙超過兩個(gè)精子以上。

3.2 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

工具為紅細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)，由吸管、軟橡膠連管、計(jì)數(shù)室、蓋玻片等組成。因?yàn)樵芯用芏群芨?，不便?jì)數(shù)，因而取少量精液稀釋若干倍，再放入一定容積的計(jì)數(shù)室內(nèi)進(jìn)行查數(shù)，最后換算成1 mL精液中含有的精子數(shù)。應(yīng)用紅細(xì)胞吸管取精液至0.5(稀釋200倍)或1.0(稀釋100倍)刻度，再吸取3%氯化鈉溶液至101刻度，以拇指和食指分別按住吸管兩端，振蕩，使精液與3%氯化鈉溶液充分混勻，棄去數(shù)滴，吸管尖端放在計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間的空隙邊緣使稀釋的精液流入計(jì)算室，進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上的兩個(gè)計(jì)數(shù)室被劃成25個(gè)大方格，內(nèi)由400個(gè)小方格組成，25個(gè)大方格的面積為1 mm×1 mm=1 mm2，計(jì)算5個(gè)大方格內(nèi)的精子數(shù)，即可計(jì)算出1 mL精液中含有的精子數(shù)。為了計(jì)算具有代表性，可以選擇四角四個(gè)大方格及中央的一個(gè)大方格或者處于對角線上的5個(gè)大方格。計(jì)算室的劃分情況如圖1。

圖1 計(jì)算室劃分情況

5個(gè)大方格中的精子數(shù)×5等于計(jì)算室內(nèi)25個(gè)大方格中的精子數(shù)，再乘10則換算成1立方毫米容積內(nèi)的精子數(shù)，再乘1000，則換算為1 mL精液中含有的精子數(shù)，因?yàn)榭偟南♂尡稊?shù)為200倍，所以1 mL原精中含有的精子數(shù)為上數(shù)乘積再乘200，即原精密度=0.1億×5個(gè)大方格中的精子數(shù)。

3.3 精子密度儀測定法

主要根據(jù)不同精子密度的透光性原理，取少量精液進(jìn)行比色分析，操作按儀器說明書進(jìn)行即可，一般在2 min左右即可測定完成一只公羊的精子密度，主要用于凍精生產(chǎn)及實(shí)驗(yàn)室精子密度的測定。

4 存活時(shí)間

精子存活時(shí)間是指在一定條件下的總生存時(shí)間。方法為每1～2 h觀察精子的活動(dòng)狀態(tài)，直至精子全部死亡，記錄精子存活時(shí)間。存活時(shí)間越長，精子的受精能力越強(qiáng)，反之越差。

5 存活指數(shù)

精子存活指數(shù)是指精液內(nèi)精子平均存活時(shí)間，即精液內(nèi)精子活力下降的速度。具體方法是由第1次檢查時(shí)間到倒數(shù)第2次檢查之間的間隔時(shí)間，加上最后一次與倒數(shù)第2次時(shí)間的一半，其總和時(shí)間即為精子存活時(shí)間。每相鄰前后兩次檢查的精子平均活率與其間隔時(shí)間的乘積相加的總和即為精子存活指數(shù)。精子存活指數(shù)越長，精子的受精能力越強(qiáng)，反之越差。

6 精子畸形率和頂體完整率

畸形精子的檢查，可在計(jì)數(shù)死活精子數(shù)的同時(shí)進(jìn)行，也可將精液制成抹片直接在顯微鏡下觀察，或用普通染色液(美藍(lán))或紅藍(lán)墨水染色，水洗干燥后鏡檢。檢查的精子數(shù)不得少于200個(gè)，計(jì)算畸形百分比，即畸形率。

精子畸形包括：單身雙頭精子、單頭雙身精子、尾部折斷精子、尾部彎曲精子、無頭精子、無身精子、頂體脫落精子、頂體破裂精子、頂體膨大精子、有原生質(zhì)滴精子、小頭精子等。精子頂體完整率與畸形率的具體測定方法如下：

用精子快速染色液染色，取少量稀釋精液抹片，用95%乙醇鋪滿載玻片固定2～3 min，空氣中自然晾干，干透后水合1～2 min，倒凈液體。滴加試劑一(細(xì)胞核染液)鋪滿載玻片染色30 s～2 min，流水洗凈倒凈液體。試劑二(細(xì)胞質(zhì)染液)鋪滿載玻片染色20 s～2 min，不要倒丟，立即滴加若干滴增色液混合作用5 s左右，再用試劑三(增色液)充分沖洗一遍，濾紙吸干。利用精子分析儀分析。在上述200個(gè)精子中標(biāo)記出畸形精子(畸形精子是指頭、體、尾的形態(tài)變異，頭部畸形有巨大頭、無定形、雙頭等；體部畸形有體部粗大、折裂、不完整等；尾部畸形有卷尾、雙尾、缺尾等。)

畸形率=(畸形精子數(shù)/200)*100%

隨機(jī)選取200個(gè)精子，觀察頂體，標(biāo)記頂體不完整的精子。由于頂體在受精過程中具有重要作用，因此只有呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)并具有完整頂體的精子才具有正常的受精能力。常規(guī)檢查方法：先同畸形精子檢查一樣制成抹片，待自然干燥后再在固定液中固定片刻，水洗后用姬姆薩緩沖液染色1.5～2.0 h，再水洗干燥后，用樹脂封裝，置于1 000倍以上顯微鏡或相差顯微鏡下觀察200個(gè)以上個(gè)精子，計(jì)算異常率。凡是含有卵黃、甘油成分稀釋液的精液抹片，必須先要在含有甲醛的檸檬酸鹽液中固定，然后在37℃下干燥后，才能染色和鏡檢。頂體完整率=(200-頂體不完整精子數(shù)/200)*100%

7 精子抗力的測定

抗力測定是用1%氯化鈉溶液來進(jìn)行，因該溶液對精子有一定破壞作用，并隨量的增加而增強(qiáng)，精子如能經(jīng)受較多的溶液則抗力較強(qiáng)。

方法：測定抗力時(shí)保持周圍溫度在18～25℃，用吸管吸取0.02 mL原精液放在玻璃瓶內(nèi)，然后由滴定管滴入消過毒的1%氯化鈉溶液10 mL，輕輕搖動(dòng)。用玻璃棒取出一滴來鏡檢。如發(fā)現(xiàn)仍有前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子，可再滴入10 mL 1%的氯化鈉溶液，直到精子完全停止前進(jìn)運(yùn)動(dòng)為止。整個(gè)測定時(shí)間不能超過15 min，最后按下列公式求出抗力指數(shù)：抗力=加入的1%氯化鈉溶液總量/0.02 mL原精液。

8 精液pH

取一滴精液滴于pH 6.6～8.0的精密試紙上測定，也可用pH電測定儀作更正確的測定。

9 滲透壓

是指用半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開時(shí)發(fā)生滲透現(xiàn)象，到達(dá)平衡時(shí)半透膜兩側(cè)溶液產(chǎn)生的位能差。滲透壓可以用氣壓、冰點(diǎn)下降度(△)或者滲透克分子濃度等來表示。溶液滲透壓的大小取決于單位體積溶液中溶質(zhì)微粒的數(shù)目：溶質(zhì)微粒越多，即溶液濃度越高，對水的吸引力越大，溶液滲透壓越高；反過來，溶質(zhì)微粒越少，滲透壓越小。與無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。測量精液的滲透壓可用滲透壓儀或滲透壓計(jì)等進(jìn)行測量。

10 精子質(zhì)膜完整率

將稀釋精液搖勻后取中層精液25 μL的稀釋精液于200 μL Host低滲溶液中，37℃水浴孵育30 min，取少量液體制作抹片，待其干燥后在顯微鏡下檢測精子彎尾率。在顯微鏡下隨機(jī)選取200個(gè)精子進(jìn)行觀察分析，計(jì)算精子彎尾率。

質(zhì)膜完整率=(彎尾精子數(shù)/200)×100%

在上述各技術(shù)檢測指標(biāo)中，人工授精經(jīng)常使用的為射精量、密度、活力、存活時(shí)間、畸形率指標(biāo)，其它指標(biāo)主要供試驗(yàn)室對精子進(jìn)行具體分析。

11 參考文獻(xiàn)

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