杉木降解預處理條件的優(yōu)化

沈博文，張 林

（1.長沙市雅禮中學，湖南 長沙 410021； 2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004）

杉木降解預處理條件的優(yōu)化

沈博文1，張 林2

（1.長沙市雅禮中學，湖南 長沙 410021； 2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004）

為了更好的利用杉木三剩物，從木質(zhì)原料獲得糖類及其他產(chǎn)品，通過對杉木屑進行稀硫酸預處理條件的分析，主要考察了稀硫酸濃度、處理溫度、處理時間對杉木綜纖維、纖維素、半纖維、木質(zhì)素等成分及酶解糖化效果的影響，發(fā)現(xiàn)稀硫酸對杉木預處理，以半纖維素的降解為主，纖維素和木質(zhì)素降解程度不大。確定了的條件為 0.3% 稀硫酸，160 ℃，處理 50 min 是處理效果最佳，還原糖可達 38 mg/mL，為后續(xù)的杉木降解為單糖并進行高效利用提供了支撐基礎(chǔ)。

杉木；預處理；稀硫酸；糖化

世界文明在不斷發(fā)展的同時，對化石資源的需求也越來越大，而傳統(tǒng)的化石資源的儲備日益減少，尋找可再生的、清潔的資源一直是全世界學者最為關(guān)注的問題。木質(zhì)纖維資源可再生能力強，儲量非常大，如果能將木質(zhì)纖維降解可轉(zhuǎn)化為生物乙醇和丁醇、乳酸等能源或化工產(chǎn)品原料，可以在很大程度上解決化石資源危機問題［1-3］。通過生物工程和基因工程技術(shù)的改良，纖維素酶的生產(chǎn)技術(shù)［4-8］，乙醇、丁醇、乳酸等發(fā)酵菌種的選育及馴化技術(shù)［9-12］基本趨于成熟。但是木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)比較緊密，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間的化學鍵鍵能比較大，并且互相之間還有氫鍵作用，木質(zhì)素作為粘結(jié)劑保護纖維素和半纖維素，對生物酶是有一定的阻抗作用，纖維素酶不能很好的和纖維進行結(jié)合而使其降解為可發(fā)酵的糖類，從而影響發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，所以需對木質(zhì)纖維進行預處理，將木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)打散，提高纖維素酶和纖維的可及度。杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.）是一種氣候適應(yīng)能力強，成材時間短的人工林優(yōu)勢樹種，在我國南方有大面積種植，每年產(chǎn)生的杉木采伐、造材、加工等三剩物的量非常大。本試驗嘗試稀硫酸預處理杉木原料，并進行酶解，以酶解液中的還原糖濃度作為評價標準，研究稀硫酸濃度、處理溫度、處理時間對杉木預處理效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

杉木屑：切片，粉碎，約 20 目（833μm）。

纖維素酶：由湖南華泰生物有限公司提供，依據(jù) QB 2583-2003 測得其濾紙酶活為 100 IU/mL。

實驗藥品：所需主要藥品見表 1。

表1 主要實驗藥品列表Tab.1 Chemicals for the experiment

1.2 實驗儀器

簡易反應(yīng)釜：不銹鋼釜體，聚四氟乙烯釜膽，最高反應(yīng)溫度為 200 ℃，山東省煙臺科立自控設(shè)備研究所。

1.3 方法

1.3.1 杉木纖維化學成分分析 杉木原料和杉木稀硫酸降解殘渣經(jīng)微型植物粉碎機粉碎后，取40 ～ 60 目木粉進行原料化學成分分析。纖維素含量的測定參照硝酸-乙醇法［13］；綜纖維素含量的測定參照 GB/T 2677.10-1995；Klason 木素含量的測定參照 GB/T 2677.8-1994；半纖維素的含量為綜纖維素與纖維素含量之差。

1.3.2 還原糖濃度的測定 還原糖濃度測定采用3,5-硝基水楊酸法（DNS 法）。

1.3.3 杉木稀硫酸預處理 在 100 ml 反應(yīng)釜中，按照表 2 要求，加入 10 g 的杉木屑，再加入相應(yīng)濃度的硫酸 60 ml，攪拌均勻。將反應(yīng)釜放入已達預定溫度的干燥箱內(nèi)，重新達到預定溫度后計時，加熱相應(yīng)時間。取出冷卻，60 ℃ 烘干至絕重，備用。預處理工藝條件見表 2。

表2 杉木纖維預處理工藝條件Tab.2 The pretreatment conditions of Chinese fir fiber

1.3.4 預處理樣品酶解實驗 對于每一個條件的任一水平，平行稱取絕干重 3 g 的杉木纖維酸處理渣三組置于 50 ml 搖瓶中，用稀檸檬酸溶液和稀氫氧化鈉溶液準確調(diào)節(jié)酶解體系 pH 至 4.8，然后將搖瓶置于高溫滅菌鍋滅菌 30 min，防止微生物對纖維素酶的酶解造成影響，冷卻后加入纖維素酶液，纖維素酶的載入量為 30 IU/g（1 g 杉木預處理渣加入 30 IU 酶活力的纖維素酶），最終維持酶解體系固液比為 1 : 10，搖瓶封口后置于 50 ℃ 恒溫搖床內(nèi)，在轉(zhuǎn)速 120 r/min 下酶解 48 h 后離心，取上層清液測酶解液中的還原糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀硫酸濃度對預處理的影響

在溫度為 150 ℃，處理時間為 60 min 不變情況下，不同稀硫酸濃度處理對杉木纖維化學成分的影響見圖 1，由圖可知，稀硫預處理對杉木進行預處理，綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預處理過程中均會降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高，濃度低于0.4% 時，隨著稀硫酸濃度的增大，半纖維素降解程度越來越大，纖維素含量逐漸升高。綜纖維素的降解，使得木質(zhì)素的含量升高。

圖1 不同稀硫酸濃度對杉木纖維化學成分的影響Fig.1Effects of different concentration of dilute sulfuric acid on chemical composition of Chinese fir fiber

不同稀硫酸濃度對酶解液還原糖濃度的影響見圖 2，當稀硫酸濃度低于 0.3% 時，酶解液還原糖濃度隨著硫酸濃度的增大而增大。而當濃度高于 0.3%，酶解液還原糖隨著硫酸濃度的增大而減小，稀硫酸濃度為 0.3% 時，酶解液還原糖濃度最大為 36.71 mg/mL，酶解效果最好。

圖2 不同稀硫酸濃度對酶解還原糖濃度的影響Fig.2Effect of different dilute sulfuric acid concentration on the concentration of enzymatic hydrolysis reducing sugar

2.2 處理溫度對預處理的影響

在硫酸濃度為 0.3%，處理時間為 60 min 不變情況下，不同處理溫度對杉木纖維化學成分的影響見圖 3，預處理對綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預處理過程中均會降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高。隨著處理溫度的逐漸增大，綜纖維素的降解程度增大，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解程度都有所增大，為了獲得更高的纖維素和半纖維素收率，為酶解提供原料，應(yīng)盡量在較低溫度下對杉木進行預處理。

圖3 不同處理溫度對杉木纖維化學成分的影響Fig.3Effects of different treatment temperature on the chemical composition of Chinese fir fiber

不同處理溫度對酶解液還原糖濃度的影響見圖 4，由圖可知，酶解液中的還原糖濃度隨著溫度的升高而增大，從 140 ℃ 到 160 ℃，隨著溫度的升高還原糖濃度增幅比較大，160 ℃ 后還原糖濃度增幅比較小，在 180 ℃ 時，還原糖濃度達到最大 38.63 mg/mL，由于溫度越高，會產(chǎn)生大量的發(fā)酵抑制物，不利于后續(xù)的酶解發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，在預處理效果接近時，應(yīng)盡量選擇較低溫度對杉木纖維進行預處理。

圖4 不同處理溫度對酶解還原糖濃度的影響Fig.4Effect of different treatment temperature on the concentration of enzymatic hydrolysis reducing sugar

由不同溫度對杉木纖維化學成分的影響和不同溫度對酶解液中還原糖濃度的影響可知，溫度的升高，預處理樣品的酶解效果越好，升高溫度會使得預處理樣品中綜纖維素收率越低，但且還會產(chǎn)生大量的發(fā)酵抑制物，從而不利于酶解發(fā)酵，因此溫度 160 ℃ 為最佳。

2.3 處理時間對預處理的影響

在硫酸濃度為 0.3%，溫度為 150 ℃ 不變情況下，不同保溫時間對杉木纖維化學成分的影響見圖 5，杉木綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預處理過程中均會降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高。隨著保溫時間的逐漸延長，半纖維素的降解程度越來越大，纖維素的降解不明顯，說明保溫時間的延長能促進半纖維素的降解，對纖維素的降解影響不大。在酸性環(huán)境下，高溫高壓處理時間越長，木質(zhì)素的未出現(xiàn)明顯的降解。

圖5 不同處理時間對杉木纖維化學成分的影響Fig.5Effects of di fferent treatment time on c hemical composition of Chinese fir fiber

不同保溫時間對酶解液中還原糖濃度的影響見圖 6，酶解液中的還原糖濃度隨著保溫時間的延長而先增大后減小，從 40 min 到 50 min，酶解液中還原糖濃度從 24.56 mg/mL 增大到最大值 34.81 mg/mL，保溫時間從 50 min 到 60 min 時，還原糖濃度減小，再延長保溫時間，酶解液中的還原糖濃度變化幅度不大。

圖6 不同處理時間對酶解還原糖濃度的影響Fig.6Effect of different treatment time on the concentration of enzyme hydrolysis reducing sugar

由不同保溫時間對杉木纖維化學成分的影響和不同保溫時間對酶解液中還原糖濃度的影響可知，保溫時間的延長，纖維素和半纖維素的收率降低，木質(zhì)素降解程度增大，在 50 min 時預處理效果最好，酶解還原糖濃度最高。

根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果表明，稀硫酸濃度、處理溫度、保溫時間等對稀硫酸預處理杉木屑均具有不同程度的影響。其中溫度影響最明顯，其次是處理時間，硫酸濃度在考察范圍內(nèi)有一定影響，但不明顯。

木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)乙醇，主要包括原料預處理、纖維素酶水解糖化和 C 5/C 6 糖發(fā)酵等工藝［14］。稀酸處理是常見的一種預處理方法［15］。原料經(jīng)稀酸預處理和纖維素酶水解后，水解糖液中除糖分外，還存在一些對微生物的生理特性和發(fā)酵特性有抑制作用的物質(zhì)，包括糠醛、乙酸、單寧等，可通過萃取、中和、蒸發(fā)、吸附等方式可去除［16］，但成本較高。本試驗只是針對杉木屑預處理效果進行的，如果要綜合考慮能耗，發(fā)酵抑制物的產(chǎn)生和其他操作費用等因素，最佳預處理條件可能須作出適當調(diào)整。

3 結(jié)論

（1）通過對杉木原料、預處理后樣品的化學成分進行測定分析可知，稀硫酸對杉木纖維進行預處理，半纖維素降解明顯，說明稀硫酸預處理，主要以半纖維素的降解為主，纖維素和木質(zhì)素降解程度不大。

（2）通過條件優(yōu)化，探討了不同預處理條件對預處理樣酶解液中還原糖濃度的影響，得出每個預處理條件各水平對酶解液中還原糖濃度的影響變化曲線圖，初步確定最佳工藝條件，為后續(xù)的杉木講解為降解單糖，并進行高效利用具有一定借鑒作用。

［1］王 聞，莊新姝，袁振宏，等.纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與展望［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2014，34（4）：144-150.

［2］靳勝英，張禮安，張福琴.纖維質(zhì)原料制乙醇的關(guān)鍵技術(shù)［J］.化學工業(yè)與工程技術(shù)，2009，30（2）：32-37.

［3］盛曉曉，周如金，唐玉斌.纖維素原料制取燃料乙醇的研究概述［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（1）：138-142.

［4］楊明明，陳玉林.纖維素酶及纖維素酶多酶復合體的研究進展［J］.家禽生態(tài)學報，2013（5）：1-5.

［5］朱順妮，王 聞，亓 偉，等.纖維素酶的研究進展［J］.新能源進展，2013，1（1）：45-52.

［6］屈海峰，白殿國，于占春，等.中心組合響應(yīng)面優(yōu)化里氏木霉 B4 菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基組成研究［J］.化工科技，2016（6）：29-33.

［7］涂宗財，江國忠，劉益東，等.枯草芽孢桿菌 BS-05 產(chǎn)纖維素酶條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010（5）：181-183.

［8］孟凡輝，蔣緒愷，劉 琳，等.纖維素酶解速度的可視化表征與限制因素分析［J］.生物化學與生物物理進展，2015，42（3）：201-210.

［9］張 強，冀 偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株選育的研究進展［J］.化工進展，2013，32（1）：151-157.

［10］趙鵬翔.玉米秸稈纖維乙醇聯(lián)產(chǎn)轉(zhuǎn)化過程及機理研究［D］.北京：北京林業(yè)大學，2016.

［11］顧 陽，蔣 宇，吳 輝，等.生物丁醇制造技術(shù)現(xiàn)狀和展望［J］.生物工程學報，2010，26（7）：914-923.

［12］唐 勇，蘇肇秦，趙丹青，等.木質(zhì)纖維素生物煉制及乳酸制備研究進展［J］.綠色科技，2011（1）：169-173.

［13］王林風，程遠超.硝酸乙醇法測定纖維素含量［J］.化學研究，2011，22（4）：52-55.

［14］?hgren，K，Vehmaanper? J，Siikaaho M，et al.H igh temperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated corn stover for ethanol production.［J］.Enzyme & Microbial Technology，2007，40（4）：607-613.

［15］馬德勇，張愛聯(lián)，高建明，等.稀硫酸預處理王草的研究［J］.草業(yè)學報，2011，20（5）：288-293.

［16］Gong C S，Cao N J，Du J，et al.Ethanol production from renewable resources.［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol.1999（65）：207-241.

（文字編校：楊 駿）

Optimization of Chinese fir degradation pretreatment conditions

SHEN Bowen1，ZHANG Lin2
（1.Yali High School，Changsha 410021，China；2.Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

In order to effectively improve the utilization for the residues of Chinese fir，and get the sugars or other products form lignocellulose.The experiment of dilute sulphuric acid pretreatment condition to the fir chips were analyzed，mainly study on the dilute sulphuric acid density，the processing temperature and the process time effected on degeneration of the

holocellulose，the cellulose，hemicellulose，the lignin equi component and the saccharification results.It was discovered that the dilute sulphuric acid pretreatment to the fir chips，mainly by the hemicellulose degeneration， the cellulose and the lignin degeneration was not obviously.Under the pretreatment technological condition is that 0.3% sulphuric acid，160 ℃，pretreat 50 min，and the best effects of reducing sugar reached is 38 mg/mL.It will provided technical date for Chinese fir

degradation to the monosaccharide and effective utilization.

Chinese fir；pretreatment；dilute sulphuric acid；saccharification

S 781.7

A

1003-5710（2017）02-0060-04

10.3969/j.issn.1003-5710.2017.02.012

2016-12-12

國家國際科技合作專項（NO.2015DFA01120）

沈博文（1999-），男，河南省鄲城縣人，高三年級學生，研究方向：生物質(zhì)資源利用；E-mail：68759753@qq.com