蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定?

姜霽航，彭霞薇，顏振鑫，何不為，朱昌雄，國(guó) 輝**，耿 兵**

（1．北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定?

姜霽航1，彭霞薇1，顏振鑫1，何不為1，朱昌雄2，國(guó) 輝1**，耿 兵2**

（1．北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

為探明蘋果樹根際解鉀菌的種群特征和解鉀性能，從蘋果樹根際土壤中分離獲得解鉀能力較強(qiáng)的高效解鉀菌。本研究以鉀長(zhǎng)石為唯一鉀源，分離獲得118株具有解鉀活性的菌株，重復(fù)片段 PCR基因指紋分析（Repetitive-element PCR, rep-PCR）聚為29個(gè)類群。利用火焰分光光度法測(cè)定菌株解鉀能力，獲得5株高效解鉀菌，平均解鉀活性達(dá)到41.47mg·L-1，其中K105的解鉀能力最強(qiáng)，有效態(tài)鉀增長(zhǎng)23.09%。采用H2O2消煮后測(cè)得的 K+濃度升高，有效態(tài)鉀增長(zhǎng)最高達(dá) 31.22%。采用形態(tài)特征觀察、生理生化特性檢測(cè)和基于 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)高效解鉀菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：K1為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、K98、K105和K115為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、K168為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。研究結(jié)果可為開辟新型高效解鉀菌，為連作土壤的改良和蘋果專用微生物菌肥的開發(fā)提供依據(jù)。

解鉀菌；重復(fù)片段PCR基因指紋分析；篩選；鑒定

鉀是植物的三大元素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)起著十分重要的作用。鉀元素在植物體內(nèi)主要以K+的狀態(tài)存在于細(xì)胞液中，是很多酶的催化劑。在植物生長(zhǎng)的過程中有近60種酶需要鉀加以活化，鉀元素間接決定了植物的生長(zhǎng)速度。土壤中鉀元素一般可分為水溶性鉀、交換性鉀、非交換性鉀和礦物質(zhì)鉀，能直接被植物吸收利用的有效鉀約占總量的2%，有95%的鉀以緩效態(tài)形式存在于鉀長(zhǎng)石或云母等硅酸鹽礦物中，不能被植物直接吸收利用[1]。因此，研究如何將這些土壤礦物中的鉀釋放出來(lái)，成為作物能吸收利用的可給態(tài)鉀，具有理論和實(shí)踐意義。

中國(guó)土壤中可溶性鉀資源匱乏，但是以鉀長(zhǎng)石為主的難溶性硅鋁酸鉀資源存儲(chǔ)豐富，分布廣泛，南方儲(chǔ)存尤為豐富[2]。土壤中的鉀礦物主要以穩(wěn)定的硅酸鹽形式存在，而解鉀菌是從土壤中分離出的一種能利用鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細(xì)菌，可作為微生物肥料，分解鉀長(zhǎng)石、磷灰石等不溶性的硅鋁酸鹽無(wú)機(jī)礦物質(zhì)，促進(jìn)難溶性的鉀、磷、硅、鎂等養(yǎng)分元素轉(zhuǎn)化成可溶性養(yǎng)分，增加土壤速效養(yǎng)分的含量，促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育，提高產(chǎn)量[3]。研究表明，生物有機(jī)質(zhì)可改良土壤質(zhì)量，減少土壤中氮磷鉀等養(yǎng)分淋失[4]。目前利用土壤中的解鉀微生物，有效開發(fā)鉀長(zhǎng)石資源，從中提取鉀，制造鉀肥是解決中國(guó)可溶性鉀資源緊缺現(xiàn)狀的重要途徑[5]。而根際解鉀微生物比普通解鉀菌具有更顯著的優(yōu)勢(shì)，不但能轉(zhuǎn)化土壤中難溶性鉀，改造土壤結(jié)晶構(gòu)造，還能分泌促生物質(zhì)，活化根際土壤微生物態(tài)環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6]。由于不同植物根際的解鉀細(xì)菌的種類和數(shù)量存在差異，不同種類的解鉀菌或不同菌株之間的解鉀能力存在較大差異，所以從特定植物根際篩選高效解鉀細(xì)菌的工作顯得尤為重要。

近年來(lái)，隨著蘋果品種更新?lián)Q代和密植的發(fā)展，新老果園的重茬，常常導(dǎo)致蘋果再植病的發(fā)生，表現(xiàn)為植株矮小，生長(zhǎng)衰弱，果實(shí)品質(zhì)低下等癥狀[6]。許多高產(chǎn)果園蘋果種植模式均為多年連作，這種種植模式下土壤鉀素輸出量大，有效鉀虧缺嚴(yán)重[7]。在連作模式下，土壤中根際有益菌的種類和數(shù)量降低，有害真菌逐漸富集。微生物的“解鉀”作用，是由于微生物代謝過程中所產(chǎn)生的無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的作用結(jié)果，它能明顯提高連作土壤中速效鉀的含量，有效降低土壤中蘋果連作病原菌鐮刀菌的發(fā)生率[8]。研究表明，根際促生菌在改善蘋果樹連作中扮演著重要的角色[9]。解鉀菌是常用的促生根際菌（PGPR）之一，通過在植物根際定殖，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)利用率[1-2,10-12]。國(guó)內(nèi)外研究表明，目前研究較為廣泛的解鉀菌多為膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和克霍爾德菌（Burkholderia sp.）[13-15]，解鉀微生物多樣性還有待開發(fā)，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)解鉀細(xì)菌的研究與應(yīng)用主要集中在農(nóng)作物上，從多年生作物上篩選應(yīng)用解鉀細(xì)菌的報(bào)道鮮見，國(guó)內(nèi)外鮮有蘋果樹根際解鉀菌的相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過蘋果樹根際高效解鉀微生物的篩選，對(duì)促進(jìn)解鉀微生物多樣性，利用生物途徑改善缺鉀現(xiàn)狀，緩解土壤連作障礙具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以鉀長(zhǎng)石為唯一鉀源，從蘋果樹根際土壤中分離出解鉀分離株，rep-PCR基因指紋分析聚類，通過發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵液中速效鉀含量進(jìn)行測(cè)定，獲得高效解鉀菌，并對(duì)解鉀菌進(jìn)行解鉀能力測(cè)定和菌種鑒定，重點(diǎn)探討連作蘋果樹根際解鉀菌的解鉀能力，并試圖比較合理評(píng)估解鉀菌的解鉀作用。旨在開辟新型高效解鉀菌，充分利用土壤鉀素資源，為連作土壤的改良和蘋果專用微生物菌肥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品取自山東省泰安市多年生蘋果園，分別采集多年生果樹和栽植后表現(xiàn)出連作障礙的幼苗根際土，土壤理化性質(zhì)如表1，每個(gè)區(qū)隨機(jī)抽取6個(gè)點(diǎn)采樣，共12份樣品，取5-10cm土層，把根際土壤連同樹根一起裝入無(wú)菌袋，貼上標(biāo)簽編號(hào)。抖掉根際附著的土壤，將同一蘋果園區(qū)的6個(gè)樣品混合，用于解鉀菌的分離。帶回實(shí)驗(yàn)室放置于冰箱4℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，H2O 1000mL。

表1 蘋果樹根際土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil properties of the apple rhizosphere region

LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉 15g，其它成分同 LB液體培養(yǎng)基。

解鉀菌分離液體培養(yǎng)基：蔗糖 5g，MgSO4·7H2O0.5g，Na2HPO42g，CaCO30.1g，F(xiàn)eCl30.005g，鉀長(zhǎng)石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（150 目）1.0g，H2O 1000mL。

解鉀菌分離固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15g，其它成分同解鉀菌分離液體培養(yǎng)基。

K標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：KCl 0.19g（110℃烘2h）溶于蒸餾水中，定容至1000mL，即為100mg·L-1的K標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、2、5、10、20、30、40mL至容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，配置成0、2、5、10、20、30、40mg·L-1的 K 標(biāo)準(zhǔn)溶液[16]。

1.2 方法

1.2.1 解鉀菌分離篩選

稱取10g新鮮土樣置于裝90mL無(wú)菌水的250mL錐形瓶中，利用28℃、180rpm全溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩，充分混勻制成土壤懸浮液，按梯度稀釋為10-3、10-4、10-5濃度，各取0.1mL稀釋液涂布于以鉀長(zhǎng)石為唯一鉀源的解鉀菌分離培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度 3個(gè)重復(fù)，放入 28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～4d。從中篩選較大的、圓形透明、表面粗糙黏稠的單菌落[2]進(jìn)行四分體劃線純化，反復(fù)進(jìn)行3次，同時(shí)用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 rep-PCR分析及聚類圖構(gòu)建

采用天根生化試劑盒，按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行樣品DNA的提取。對(duì)各解鉀菌分離株的基因組進(jìn)行基因外重復(fù)回文序列（repetitive-element PCR,rep-PCR）DNA指紋分析，用軟件CORSS CHECKER進(jìn)行凝膠分析、SAS9.0進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建蘋果樹根際解鉀細(xì)菌的rep-PCR聚類分析圖。

rep-PCR 采用引物為 BOX-AIR（5′-CTACGGC AAGGCGACGCTGACG-3′）[16]。rep-PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol·L-1dNTP 2μL，25mmol·L-1MgCI21.5μL，10μmol·L-1引物 2μL，模板1μL，Taq酶0.15μL，補(bǔ)加雙蒸水至30μL。rep-PCR反應(yīng)條件為：95℃、7min—94℃、1min— 53℃、1min—65℃、8min，共 35個(gè)循環(huán)，再 65℃、16min—4℃、Pause。PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1%的瓊脂糖凝膠電泳，電解液為1×TAE，Marker選用Trans 2KTMPlusⅡDNA Marker。

1.2.3 解鉀能力測(cè)定

（1）鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制好的鉀標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用含 K+0mg·L-1的鉀標(biāo)準(zhǔn)液將火焰光度計(jì)上檢流計(jì)讀數(shù)調(diào)整為0，用40mg·L-1質(zhì)量濃度的鉀標(biāo)準(zhǔn)液將火焰光度計(jì)上檢流計(jì)調(diào)為滿度（100），然后按鉀的質(zhì)量濃度從稀到濃依次測(cè)定不同質(zhì)量濃度下的鉀離子含量（mg·L-1），記錄檢流計(jì)讀數(shù)。以檢流計(jì)讀數(shù)為縱坐標(biāo)，鉀的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

（2）細(xì)菌的培養(yǎng)

將篩選獲得的解鉀菌在解鉀菌分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種于解鉀菌分離液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm全溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72h，獲得處理組（接菌）發(fā)酵液。在250mL三角瓶中裝入50mL培養(yǎng)液，高壓滅菌鍋121℃高溫滅菌20min，冷卻至室溫。處理組（接菌）按 4% 的接種量接種發(fā)酵液，28℃、180rpm全溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h測(cè)定速效鉀含量。以對(duì)照組（不接菌）中速效鉀含量為基準(zhǔn)計(jì)算獲得菌株的解鉀能力。

（3）鉀離子的測(cè)定

取步驟（2）中培養(yǎng) 72h后的培養(yǎng)液 20mL，6000r·min-1離心20min，取上清液用火焰分光光度計(jì)（棱光FP6410式）測(cè)定其中K+含量；另取20mL培養(yǎng)液，加4%H2O2，高壓滅菌鍋121℃高溫滅菌處理20min，6000r·min-1離心 20min，測(cè)上清液中 K+的含量[17]。

（4）解鉀活性的測(cè)定

將步驟（3）中得到的上清液與鉀標(biāo)準(zhǔn)系列溶液一起在火焰分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出待測(cè)上清液相對(duì)應(yīng)的K+含量。

1.2.4 菌株鑒定

（1）菌種形態(tài)與生理生化分析

采用革蘭氏染色法對(duì)菌株的形態(tài)進(jìn)行顯微鏡觀察，并結(jié)合生理生化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)初步確定菌株種屬。參照Shirking等[18]的方法對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

分別在25℃、28℃、30℃、37℃、45℃共5個(gè)溫度梯度下，180r·min-1條件下振蕩培養(yǎng) 48h，不同溫度的處理各設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定各發(fā)酵液600nm下0D值。

用 HCl和 NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在5個(gè)pH梯度下，30℃、180r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48h，不同pH的處理各設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定各發(fā)酵液600nm下0D值。

（2）16Sr RNA基因序列分析

根據(jù)解鉀能力測(cè)定和聚類結(jié)果，選取具有高效解鉀能力的解鉀菌進(jìn)行菌株鑒定。

TaqDNA聚合酶、2×GC Buffer1、dNTPs試劑由北京某公司提供；采用擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的一對(duì)保守通用引物，由北京某生物技術(shù)有限公司提供。正向引物27F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）；反向引物 1492R（5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'）。PCR 體系為 2×GC Buffer one25μL，dNTPs1.25μL，10pmol 引物各 2.5μL，5U·μL-1Taq 酶 0.5μL，無(wú)菌水 17.25μL[19]。反應(yīng)程序[12]如表 2。

表2 16S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系Table 2 16S rRNA polymerase chain reaction system

將測(cè)得的菌株序列上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中挑選相似性較高菌株的16S rRNA基因序列，通過Clustal X進(jìn)行多重序列比對(duì)，并用MEGA5. 0軟件，以Neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中解鉀菌的分離與篩選

從蘋果樹根際中共分離得到 118株具有解鉀能力的細(xì)菌分離株，菌株編號(hào)為“K”和“分離順序”。菌落形態(tài)呈近圓形或橢圓形、白色或灰白色、半透明或不透明、大部分邊緣規(guī)則、生長(zhǎng)速度中等。

將分離獲得的 118個(gè)解鉀分離株進(jìn)行 rep-PCR基因指紋分析，構(gòu)建其DNA指紋聚類圖，如圖1。將118個(gè)解鉀菌聚為29個(gè)類群，其中K1、K10、K13、K17、K22、K24、K28、K32、K48、K49、K50、K55等分離株具有完全一致的電泳 DNA指紋圖譜（圖2），被聚為同一類群，其余的28種分離株相異百分?jǐn)?shù)為0.4水平上，都有各自獨(dú)立的特征譜帶，說(shuō)明各分離株的基因組之間存在顯著異質(zhì)性，表現(xiàn)出豐富的基因型多態(tài)性。

圖1 蘋果樹根際解鉀菌的rep-PCR DNA指紋聚類圖Fig. 1 Cluster analysis of apple rhizospheric potassiumsolubilizing bacteria based on the rep-PCR DNA fingerprints

圖2 部分解鉀分離株的rep-PCR凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 The result of rep-PCR gel electrophoresis of part potassium-solubilizing bacterial isolates

2.2 土壤中解鉀菌菌株解鉀能力的測(cè)定

對(duì)照組（CK）鉀離子含量為31.73mg·L-1，以此為基準(zhǔn)計(jì)算得到所有菌株的解鉀能力，結(jié)果見圖3。由圖可見，29個(gè)菌株培養(yǎng)液其K+含量與CK差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。與 CK相比，培養(yǎng) 72h后未加 H2O2滅菌的處理中，各株菌的鉀增加4.71%～23.09%，不同菌株解鉀能力存在顯著差異，其中K1、K98、K105、K115、K168的解鉀能力最強(qiáng)，有效態(tài)鉀分別增加18.43%、15.62%、23.09%、20.79%、21.79%。培養(yǎng)液中 K+含量＜35mg·L-1的有 4株，占13.79%，35～40mg·L-1的有 6株，占 20.69%，＞40mg·L-1的有19株，占65.51%，培養(yǎng)液中K+含量越高說(shuō)明菌株的解鉀能力越強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，大部分菌株培養(yǎng)液加4%H2O2消化后溶液中的鉀離子濃度高于未加的處理，與未經(jīng)處理組得到的結(jié)果差異顯著，鉀含量增加量最高可達(dá)12.26倍。這可能是因?yàn)?，H2O2的消化對(duì)鉀長(zhǎng)石有一定的溶解作用；也可能是解鉀細(xì)菌在分解鉀長(zhǎng)石粉時(shí)，一部分溶解后存在于發(fā)酵液中，還有一部分鉀在菌體中積累起來(lái)，供細(xì)菌自身生長(zhǎng)繁殖需要，某些解鉀菌具有莢膜結(jié)構(gòu)，例如芽單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬，莢膜的黏附作用可以吸附礦物釋放的鉀離子，培養(yǎng)液經(jīng)4%H2O2溶液高溫消煮后，細(xì)菌莢膜被氧化分解，莢膜吸附的鉀離子被釋放出來(lái)。

圖3 29個(gè)解鉀類群培養(yǎng)液中鉀離子含量的比較Fig. 3 Comparision of K+ content in culture medium of 29 potassium-solubilizing groups

2.3 5株解鉀能力較強(qiáng)的蘋果樹根際解鉀菌的分類鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

選取 5株高效解鉀菌的菌落，其形態(tài)和菌落特征見表3。由表可見，其中K1、K115、K105、K98菌株均為革蘭氏陰性菌，為無(wú)芽孢的桿菌，K168菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌；菌落顏色有乳白色、淡黃色；除 K115、K105外其它菌落表型均呈濕潤(rùn)黏稠狀。

2.3.2 生理生化性質(zhì)

由表4可知，5株菌落在溫度為28℃、pH為7.0～8.0的條件下生長(zhǎng)最適宜；篩選獲得的5株解鉀菌生理生化性質(zhì)如表5所示，5株細(xì)菌均可利用葡萄糖，可水解明膠，除K98外均不能分解吲哚。

表3 形態(tài)鑒定結(jié)果Table 3 The morphology colony and basic characteristics of morphological

表4 5株解鉀菌在不同溫度梯度和pH梯度下的OD600值Table 4 OD600 value of 5 potassium-solubilizing bacteria under different temperature and pH gradient

表5 生理生化性質(zhì)Table 5 Physiological and biochemical characteristics

2.4 土壤中解鉀菌菌株鑒定

2.4.1 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)

測(cè)序所得的5株功能菌株16SrRNA基因序列長(zhǎng)度均在1500bp左右，將5株菌株序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比較，同時(shí)與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，獲取同源性較高的相鄰種、屬的16SrRNA序列，比對(duì)結(jié)果如表6所示，其中假單胞菌屬在整個(gè)樣品中屬于優(yōu)勢(shì)屬。

表6 5株高效解鉀菌的16S rRNA基因序列比對(duì)Table 6 16S rRNA gene sequence blast of 5 potassium-solubilizing bacteria

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育及同源性分析

對(duì)解鉀能力最強(qiáng)的5株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的16SrRNA基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，選取同源性較高的菌株，利用MEGA5.0軟件的Alignment Explorer程序進(jìn)行多序列同源性分析，并通過該軟件的 Neighbor-Joining法構(gòu)建根際促生細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4、圖5、圖6。由圖可見，K1菌株與不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）的遺傳進(jìn)化距離最近，與已知菌株Acinetobacter sp.（GQ369439.1）的16S rRNA的基因序列同源性達(dá)到99%。菌株K98、K105、K115均屬假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其中菌株 K98與已知菌株P(guān)seudomonas sp.48XA（DQ103513.1）的16S rRNA的基因序列同源性最大，高達(dá)到99%；菌株K105與已知菌株熒光假單胞菌Pseudomonas rhodesiae strain（KF147019.1）的16S rRNA的基因序列同源性最大，達(dá)到99%；菌株K115與已知菌株P(guān)seudomonas sp.（GU784937.1）的16S rRNA的基因序列相似性達(dá)到99%。菌株K168與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的遺傳進(jìn)化距離最近，與已知菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（KP261025.1）的16S rRNA的基因序列相似性達(dá)到 99%。結(jié)合各菌株的菌體形態(tài)、菌落特征和生理生化性質(zhì)，初步確定菌株K1為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），菌株K98、K105、K115均為假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.），菌株K168為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。因此，可在這3個(gè)屬內(nèi)挖掘高效解鉀微生物，開發(fā)高效解鉀微生物資源。

圖4 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of the strain K1 based on 16S rRNA gene sequence

圖5 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K98、K105、K115的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of the strains K98, K105, K115 based on 16S rRNA gene sequence

圖6 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K168的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of the strain K168 based on 16S rRNA gene sequence

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

解鉀菌又稱硅酸鹽細(xì)菌（Silicate bacteria），是一類能夠分解鉀長(zhǎng)石、云母等硅酸鹽類礦物，把土壤中難溶性鉀分解、轉(zhuǎn)化成為可以被作物直接吸收的有效鉀并能分泌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)的微生物[17，20]。大多數(shù)解鉀菌都是從土壤中分離得到的，而根際土壤中更容易分離得到高效解鉀菌[21]。根際解鉀菌不僅可以改良土壤結(jié)構(gòu)、降解有毒物質(zhì)，還可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，防治植物病害[1]。近年來(lái)有研究表明，包括根際解鉀菌在內(nèi)的根際土壤功能菌可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生生長(zhǎng)激素，增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的忍耐力及對(duì)病原菌的抗性，從而起到促生作用[22]。國(guó)內(nèi)外研究表明，目前發(fā)現(xiàn)的鉀礦物分解菌主要有硅酸鹽細(xì)菌，包括環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus nutcilaginosus）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）3個(gè)種[13-15]。但本研究中獲得的5株高效解鉀菌中，K1為不動(dòng)桿菌屬，K168為解淀粉芽孢桿菌，K105為熒光假單胞菌，K98和 K115為假單胞菌屬。不同的土壤或作物其根際引起硅酸鹽細(xì)菌種群的分布存在一定差異，針對(duì)蘋果樹相關(guān)根際解鉀菌的報(bào)道很少。本研究從山東泰安蘋果園獲得土壤樣品，得到118株具有解鉀能力的細(xì)菌，占分離總細(xì)菌數(shù)（3.15×107個(gè)·mL-1）的 37.46%，說(shuō)明采集的土壤樣品中解鉀菌的數(shù)量占較高比例。118株解鉀菌株通過rep-PCR聚類分析聚為29個(gè)類群，測(cè)定解鉀活性后獲得5株高效解鉀菌，經(jīng)16Sr RNA基因測(cè)序分析，結(jié)合其菌體形態(tài)和菌落特征、生理生化特征，將K1鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），K98、K105、K115鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），K168 鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

研究表明，鉀長(zhǎng)石與菌體相互作用的第一步是吸附，絕大多數(shù)微生物包括微生物細(xì)胞或酶，以及微生物在生長(zhǎng)代謝或殘?bào)w分解過程中釋放出的小分子有機(jī)酸和大分子物質(zhì)，以吸附態(tài)的形式與土壤礦物作用，形成細(xì)菌-礦物復(fù)合體[23]。本研究中，與對(duì)照組相比，有些菌株培養(yǎng) 72h后培養(yǎng)液中鉀含量反而降低，這可能是由于菌體與鉀長(zhǎng)石形成復(fù)合體，對(duì)培養(yǎng)液中本來(lái)存在的鉀元素有一定的吸附作用。

關(guān)于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的解鉀活性已有報(bào)道[22,24-26]，Bhattacharya在鹽田中發(fā)現(xiàn)1株具有解鉀活性的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）[27]，是一類稀有解鉀菌，楊紹周等[28]曾發(fā)現(xiàn)一株不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）屬具有解磷活性，而目前對(duì)該類菌解鉀活性的研究報(bào)道較少, 對(duì)其進(jìn)一步研究有助于緩解鉀肥短缺的現(xiàn)狀和開發(fā)新一代穩(wěn)定的功能菌種。

本研究發(fā)現(xiàn)，4%H2O2消煮處理的發(fā)酵液中的鉀離子濃度明顯高于未消煮處理的發(fā)酵液，這可能是由于解鉀細(xì)菌在分解鉀長(zhǎng)石粉時(shí)，一部分鉀溶解在發(fā)酵液中，還有一部分鉀在菌體中積累起來(lái)，供細(xì)菌自身生長(zhǎng)繁殖需求；有些細(xì)菌具有莢膜結(jié)構(gòu)，細(xì)菌莢膜也可吸附鉀離子，經(jīng)H2O2消煮處理，莢膜多糖被氧化分解，使吸附的鉀離子釋放出來(lái)。經(jīng)過H2O2處理后所檢測(cè)到的鉀離子包括溶液中游離態(tài)的鉀、菌體吸附的鉀和部分細(xì)胞內(nèi)的鉀，這樣計(jì)算得到的解鉀效率是最貼近真實(shí)情況的[29]。而培養(yǎng)基中鉀長(zhǎng)石中的鉀僅包括溶液中游離態(tài)的鉀和菌體所吸附的鉀兩部分，研究表明被菌體所吸附的鉀只占一小部分[29]，Eisenstadt[30]利用高特異性42K的泄漏間接檢測(cè)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長(zhǎng)、產(chǎn)芽胞過程中鉀含量的變化，在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期鉀元素含量?jī)H占細(xì)胞干重的2.5%～3%，大部分通過解鉀菌的分解作用變成游離態(tài)鉀離子。從土壤中篩選的菌株具有一定解鉀能力，但未經(jīng)處理的菌株解鉀能力并不高，通過加長(zhǎng)對(duì)菌的浸出時(shí)間和對(duì)菌細(xì)胞膜的破壞可以提高培養(yǎng)液鉀離子濃度，這可為高效解鉀菌的篩選提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

解鉀細(xì)菌的生長(zhǎng)和解鉀性能受光照、水分、溫度等外界環(huán)境條件的影響，因此，解鉀菌在田間的施用效果有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)植物根際促生菌中研究較多的細(xì)菌類群是固氮細(xì)菌、解磷細(xì)菌[9]，對(duì)解鉀菌的研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)在探討根際高效解鉀菌的篩選及解鉀活性的同時(shí)，獲得一些具有研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力的根際促生細(xì)菌，以期為改善蘋果樹根際微生態(tài)環(huán)境，研制開發(fā)蘋果樹微生物菌肥提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 結(jié)論

解鉀菌解鉀能力的強(qiáng)弱是作為評(píng)價(jià)其性能的重要指標(biāo)。本研究從蘋果樹根際分離出118個(gè)解鉀分離株，rep-PCR聚為29個(gè)解鉀類群，通過解鉀活性的測(cè)定獲得 5株高效解鉀菌，具有明顯解鉀優(yōu)勢(shì)，鉀離子含量最高達(dá)41.47mg·L-1，菌株K105的解鉀能力最強(qiáng)，有效態(tài)鉀增長(zhǎng) 23.09%。5株高效解鉀菌最適生長(zhǎng)pH范圍為7.0～8.0，最適生長(zhǎng)溫度為28℃。經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定，篩選獲得的解鉀菌分別屬于不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter sp.，假單胞菌屬Pseudomonas sp.，芽孢桿菌屬Bacillus sp.，其中假單胞菌屬Pseudomonas sp.為優(yōu)勢(shì)菌屬。4%H2O2處理后的培養(yǎng)液中可溶性鉀濃度明顯高于未經(jīng) 4%H2O2處理的培養(yǎng)液，經(jīng)處理得到的鉀離子含量更接近培養(yǎng)液中鉀離子的實(shí)際含量。

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Isolation and Identification of Potassium-Solubilizing Bacteria from Rhizosphere Soil of Apple Tree

JIANG Ji-hang1, PENG Xia-wei1, YAN Zhen-xin1, HE Bu-wei1, ZHU Chang-xiong2, GUO Hui1, GENG Bing2
(1.College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081)

In order to detect the population properties and potassium-dissolving characteristics of potassium-dissolving bacteria existing in apple rhizosphere soil, the highly efficient potassium-dissolving bacterial isolates were gained from the rhizosphere soil of apple trees. 118 strains with the ability of potassium-dissolving were isolated with potassium feldspar as the sole potassium source, then the strains were clustered into 29 populations by analysis of repetitive-element PCR (rep-PCR) genomic DNA fingerprinting. Flame spectrophotometer was used to determine the potassium-dissolving capacity, and 5 highly efficient potassium-dissolving bacteria was obtained, whose average soluble potassium content of culture medium reached to 41.47mg·L-1. K105 performed the highest potassiumdissolving ability, and the available potassium increased by 23.09%. The available potassium increased after being digested by H2O2solution, the maximum was up to 31.22%. After identifying the isolated 5 strains of efficient potassium-dissolving bacteria by bacterial morphology, physiology and biochemical characteristics, and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences, 5 strains were classified into 4 bacterial genera. K1 belongs to Acinetobacter sp., K98, K105 and K115 belong to Pseudomonas sp., and K168 belongs to Bacillus sp.. It provided basis for exploration of new efficient potassium-solubilizing bacteria, contributing to improve apple replanted soil and develop microbial fertilizer special for apple trees.

Potassium-solubilizing bacteria; Rep-PCR DNA fingerprinting; Isolation; Identification

10.3969/j.issn.1000-6362.2017.11.006

姜霽航,彭霞薇,顏振鑫,等.蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2017,38(11):738-748

2017-03-07**

。E-mail：guohuiya@126.com; gengbing@caas.cn

北京林業(yè)大學(xué)青年科技啟動(dòng)基金（BLX2014-25）；流域農(nóng)業(yè)面源污染防控整裝技術(shù)與農(nóng)業(yè)清潔流域示范（2015ZX07103-007）

姜霽航（1992-），碩士生，主要研究資源與環(huán)境微生物。E-mail：13121201177@163.com