針刺時間窗對TBI腦組織Bax表達影響的實驗研究?

郭新榮，王瑞輝，馬小衛(wèi)，吳 濤，郭 義

(1. 天津中醫(yī)藥大學針灸推拿學研究中心, 天津 300193； 2. 陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046)

【針灸研究】

針刺時間窗對TBI腦組織Bax表達影響的實驗研究?

郭新榮1,2，王瑞輝2，馬小衛(wèi)2，吳 濤2，郭 義1

(1. 天津中醫(yī)藥大學針灸推拿學研究中心, 天津 300193； 2. 陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046)

目的：探討不同時間點針刺介入治療TBI的效果，揭示針刺干預對腦神經(jīng)元的保護作用及療效機制，為臨床針刺治療TBI的最佳介入時間提供實驗依據(jù)。方法：將大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組和針刺1、針刺2、針刺3組，使用eCCI儀造模，取百會、人中、內關和足三里，分別在造模后第1天、第3天、第5天開始針刺治療，各組治療持續(xù)10次，在造模后第15天取材并檢查腦皮質Bax含量。結果：針刺組神經(jīng)運動功能評價、腦皮質中Bax蛋白及相應基因mRNA含量明顯變化，且針刺1組優(yōu)于針刺2組和針刺3組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義。結論：TBI后針刺早期介入更有利于保護損傷的腦組織。

顱腦損傷；針刺；時效；Bax

在現(xiàn)代工業(yè)社會中，顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)發(fā)生逐年增多，患者病情變化較快，致死率和傷殘率較高，嚴重威脅人類生命和生存質量，已成為危害公民健康的主要公共問題之一。針刺對TBI患者的康復具有一定的臨床療效，前期我們對32例住院患者進行了臨床觀察[1]，發(fā)現(xiàn)針刺有利于患者運動功能的改善，能夠提高患者的FMA、MBI評分，國內也有相關文獻報道[2]。然而針刺TBI介入治療的時機各不相同，最佳介入時機存在爭議。為探討針刺治療TBI的最佳介入時間窗及部分療效機制，課題組前期較好地建立了動物模型[3-4],部分揭示了針刺能夠調節(jié)血清及腦組織中SOD、MDA[5]的含量，能夠調整腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF[6-7]含量。本研究進一步選用Bax凋亡蛋白作為切入點進行實驗觀察，為臨床應用針刺介入治療TBI的時間窗及療效機制提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 動物與分組

SD大鼠由西安交通大學實驗動物中心提供(許可證20121023)，體質量220～240 g，適應性飼養(yǎng)3 d，按隨機數(shù)字表法分為空白 (A)、 模型 (B)、針刺1 (C)、針刺2(D)和針刺3(E)5組。

1.2 主要實驗儀器

冷凍高速離心機(eppendorf centrifuge 5417R)；PH酸度計(德國Sartorius PB-10)；微型脫色搖床(TY-80S型)；電泳槽(BIO-RAD小型垂直電泳槽)；轉印槽(BIO-RADMini Trans-Blot? Cell小型轉印槽)；NanoDrop微量核酸定量儀(Thermo Fisher Scientific，Inc)；熒光定量PCR設備(伯樂IQ5)；圖像分析系統(tǒng)(Motic images Advanced 3.0)。

2 方法

2.1 造模方法

術前禁食8 h，2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉動物，俯臥固定腦立體定向儀上。頭頂皮膚消毒，正中切開暴露右頂骨，處理掉結締組織，用微型磨鉆以冠狀縫后3 mm、中線右旁2.5 mm處為中心，開直徑為2 mm的骨窗，去掉骨瓣保持硬腦膜完整。將顱腦損傷儀(eCCI-6.3，弗吉尼亞大學造)參數(shù)(速度4 m/s、深度3 mm)設置好，從立體定位儀上取下大鼠，對B、C、D和E組動物全部進行打擊造模，撞擊桿撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變。打擊完成后，向傷口內滴注 4萬單位硫酸慶大霉素 4～5 滴，縫合頭皮，外涂抹紅霉素軟膏完成造模。課題組前期研究[3-4]提示，本造模方法成功率高，效果可靠。

2.2 針刺方法

穴位為“百會”“人中”、左側“內關”和“足三里”。取穴定位參照《實驗針灸學》。A、B組正常飼養(yǎng)，每日按針刺組方法固定1次； C、D、E組分別于造模后1、3、5 d開始針刺，每日1次，連續(xù)10次。操作方法：選28號0.5寸華佗牌毫針常規(guī)消毒，75%乙醇棉球消毒穴位，百會向前斜刺、人中直刺、內關(左側)直刺、足三里(左側)直刺，刺入深度均為2～3 mm，各穴均行捻轉手法、平補平瀉、前后捻轉各360°左右為1次，共捻轉30次完成治療。

2.3 指標檢測方法

2.3.1 神經(jīng)功能及運動功能評價 參考Faden等使用的大鼠實驗性顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)功能行為評分標準[8]。具體評價標準：大鼠在30°傾斜板上保持位置的能力(包括垂直、左右兩側水平3種方向)；懸吊大鼠尾部，左右前肢屈曲能力；對抗左右兩側牽拉的能力。每項0～5分(重傷-正常)，正常大鼠計分應為15分；大鼠平衡功能試驗[8]和大鼠行走試驗[8]。在造模后和動物治療結束后對全部動物進行評價。

2.3.2 蛋白和基因檢測 在打擊造模后第15天，所有動物結束針刺治療進行取材，分別進行相應檢測。

表2顯示，熒光定量PCR檢測：Trizol提取總RNA；使用NANO核酸核糖測定儀測定RNA濃度，調整RNA濃度至10ug/ul；反轉錄為DNA(按試劑盒說明操作)，測定純度、濃度，調整DNA濃度至20 ng/μl；熒光定量PCR反應，Bax上游引物：5’>CACCAGCTCTGAACAGATCATGA<3’,下游引物：5’>TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT<3’；β-actin上游引物：5’>TCATGAAGTGTGACGTGGACATC<3’,下游引物：5’>TGTTGCATTTGCGGGGACGATG<3’。 95℃5 min預熱，95℃10S、30℃30S、72℃30S，循環(huán)40次、72℃5 min、55℃30S，溫度梯度為0.5 ℃，Melt crave共81個循環(huán)。抗體、試劑均由北京全式生物技術有限公司提供。熒光定量檢測結果以β-actin的循環(huán)閾值為內參，計算目標基因與內參差值ΔCT(ΔCT=β-actinCT-target gene CT)，數(shù)據(jù)采用2-ΔCT法計算出mRNA的水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能及運動功能評價結果

表1顯示，針刺組較模型組在各方面均有明顯改善(P<0.05)，針刺1組與針刺2組、針刺3組比較有明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.2 各組大鼠腦皮質Bax蛋白、基因檢測結果

表2圖1顯示，模型組Bax蛋白含量上調(P<0.05)，經(jīng)電針治療Bax蛋白含量下調，且針刺1組較針刺2組、針刺3組下調明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表2結果顯示，腦皮質中Bax基因含量變化，模型組Bax基因含量明顯上調(P<0.05)，經(jīng)電針治療后Bax基因含量下調，且針刺1組較針刺2組、針刺3組下調明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 神經(jīng)功能及運動功能的評價

注：與本組造模后比較:★P<0.05；與動物取材前模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與針刺1組比較:▲P<0.05

表2 SD大鼠腦皮層Bax蛋白WB檢測灰度值及Bax mRNA含量比較

注：與空白組比較：★P<0.05；與模型組比較:##P<0.01；與針刺1組比較:▲▲P<0.01

圖1 Bax的Western-blot典型條帶

4 討論

TBI病位在腦，中醫(yī)認為乃氣滯、瘀血、痰濕阻滯經(jīng)絡導致清竅阻蔽或者氣機逆亂而發(fā)病，因此治療原則常采用調理氣機、疏通經(jīng)絡、活血化瘀、化痰開竅法。團隊前期文獻研究[4]揭示，針灸治療TBI多選督脈、手足陽明經(jīng)腧穴,多用百合、人中、足三里、內關穴。其一督脈與腦關系密切。如《難經(jīng)》：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦”的論述。其二督脈為“陽脈之海”，有“總督諸陽”之功，調節(jié)全身陽經(jīng)，對整個經(jīng)脈系統(tǒng)有統(tǒng)帥作用。其三現(xiàn)代研究認為因督脈位居中軸線，能通過雙側神經(jīng)調節(jié)促進腦功能的代償和重組。百會穴居巔頂乃“三陽五會”，屬督脈通于腦，能夠醒腦安神、化濁升清。針刺百會穴能促進受損神經(jīng)元修復，改善大鼠自由基代謝，提高其學習記憶能力和減輕腦水腫，有助于瘀血消散吸收，對腦缺血及再灌注損傷具有一定的調節(jié)作用。另外有研究認為，百會為皮層運動、感覺區(qū)上部的投影區(qū)，針刺百會能改善大腦的前動脈血液循環(huán)，興奮皮層運動區(qū)和感覺區(qū)。人中能清熱開竅、鎮(zhèn)痛寧神、回陽救逆、祛風止痛?，F(xiàn)代研究認為針刺人中能促進腦組織血液循環(huán)，增加腦灌注量，興奮腦神經(jīng)元，整合復雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)。實驗研究也證實，人中對腦損傷后腦電圖的改善及意識障礙優(yōu)于其他穴位。足三里能夠扶正，補益后天氣血生化之源，調和經(jīng)脈，疏通氣血?？傊?，選用百會、人中、內關和足三里穴可達到醒腦開竅、通經(jīng)活絡、調整氣機之效，促進TBI損傷腦組織的恢復。

本研究治療前后對動物神經(jīng)功能及運動功能進行評價，發(fā)現(xiàn)針刺能夠改善TBI大鼠的神經(jīng)、運動功能，且針刺早期介入治療效果更好。進一步探索可能的作用機制，可能與針刺抑制腦損傷后細胞凋亡相關。TBI發(fā)生后，損傷通過炎性介質、細胞因子、Ca2+超載、興奮性遞質、氧自由基等因素誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。如何調控促凋亡和抑凋亡基因在TBI不同階段不同表達決定了神經(jīng)細胞的命運。有人[9]發(fā)現(xiàn)，TBI可導致?lián)p傷周邊區(qū)大腦額皮質及海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)細胞凋亡，凋亡高峰時間分別為損傷后24 h和72 h。細胞凋亡較確定的通路之一為線粒體通路，該通路由含 BH3 結構域的 Bcl-2 家族成員介導，在受到胞內死亡信號激活后啟動[10]。激活的 Bcl-2家族成員與 Bax、Bak 等 Bax 亞家族成員結合后，導致后者的寡聚并插入線粒體膜引起線粒體通透性改變，釋放細胞色素 C 及其他蛋白引起凋亡，故Bax為凋亡的關鍵環(huán)節(jié)之一。

研究[8]揭示，大量神經(jīng)細胞凋亡會發(fā)生在機體發(fā)育的整個階段，甚至多達50%。Bax通過抑制 Bcl-2 的活性而使凋亡易于發(fā)生[11]，進而發(fā)揮促進凋亡的作用。本實驗研究旨在觀察針刺不同時間干預治療對TBI腦神經(jīng)元凋亡的調控作用，采用WB定量檢測大鼠腦皮質蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)針刺能夠下調損傷腦組織皮質中Bax蛋白的含量。這與吳至鳳等[12]發(fā)現(xiàn)針刺能下調宮內缺血腦損傷大鼠腦組織相關蛋白Bax表達的影響，童秀冰等[13]發(fā)現(xiàn)電針施治可使頸椎病大鼠軟骨細胞中Bax蛋白表達含量下調具有一致性。同時本研究檢測了腦組織皮質Bax基因表達的變化情況，發(fā)現(xiàn)針刺能夠下調腦組織損傷皮質中Bax mRNA含量。本實驗也提示，損傷后第1天開始針刺治療效果明顯優(yōu)于第3天、第5天針刺治療，第3天開始針刺治療優(yōu)于第5天開始針刺治療，結果提示TBI發(fā)生后針刺干預治療時間越早，針刺干預對Bax的調節(jié)作用越明顯，越能更好地發(fā)揮針刺對腦神經(jīng)元凋亡的抑制作用，達到保護腦組織神經(jīng)元的作用。

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EffectofAcupunctureatDifferentTime-windowontheExpressionofBaxProteinofBrainTissuesinRatswithTraumaticBrainInjury

GUO Xin-rong1,2, WANG Rui-hui2, MA Xiao-wei2, WU Tao2, GUO Yi1

(1.TianJinUniversityofChineseMedicine，Tianjin300193,China; 2.ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046,China)

Objective: To explore the effect of TBI treated by acupuncture at different time-windows, reveal protective effects and mechanism of the acupuncture to the injured nerve cells, and provide the basis of optical time of acupuncture intervention on TBI. Methods: SD rats were randomly divided into blank control group, acupuncture group 1, acupuncture group 2, acupuncture group 3 and model control group. The TBI animal models were prepared with the eCCI of the speed of 4m/s and the depth of 3mm. Then rats were treated by needling Baihui(GV 20), Renzhong(GV 26), the left Neiguan((PC6)and the left Zusanli(ST36))from the second, the fourth and the sixth day respectively, which was applied 10 times continuously. The specimens were collected at the 15th day to observe and examine the related index signs: By Western-blot to examine the localization and content of Bax protein in the brain tissues, to detect the changes of Bax mRNA by Fluorescence quantitative PCR method. Results: The expression and content of Bax were detected by Western-blot in brain tissue. Acupuncture can down-regulate Bax protein. And by PCR, acupuncture can inhibit the Bax mRNA, and the changes of content in acupuncture treatment group 1 were more obvious than that of content in the other two acupuncture treatment groups(P<0.01). Conclusion: After TBI, Early application of acupuncture treatment could more favorable to protect the injured brain tissues.

Traumatic Brain Injury(TBI); Acupuncture treatment; Time window; Bax protein

R242

B

1006-3250(2017)10-1439-03

中國博士后科學基金資助項目(2014M551038)；陜西省教育廳專項科學研究計劃(16JK1199)

郭新榮(1977-)，男，陜西宜君人，副教授，醫(yī)學博士，從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎研究。

2017-04-23