獨正桿接骨膏外用對家兔骨折愈合過程中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達的影響?

黃 瓊，向 陽

(湖北民族學院醫(yī)學院,湖北 恩施 445000)

【實驗研究】

獨正桿接骨膏外用對家兔骨折愈合過程中BMPR-1A、BMPR-1BmRNA表達的影響?

黃 瓊，向 陽

(湖北民族學院醫(yī)學院,湖北 恩施 445000)

目的：探討獨正桿接骨膏外用對家兔骨折愈合過程中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表達的影響，分析其促進骨折愈合的作用機理。方法：建立30只家兔橈骨骨折模型按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組各15只。實驗組在其患處外敷獨正桿接骨膏并用小夾板固定，對照組不使用藥物僅常規(guī)消毒后進行小夾板固定。分別于治療后第3、6、10周每組隨機抽取5只行X線觀察骨折愈合情況。處死家兔取患處組織標本，采用實時熒光定量PCR方法測定家兔骨組織中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的含量，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果：實時熒光定量PCR檢測結果顯示，實驗組家兔第3、10周患處骨組織標本中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。結論：獨正桿接骨膏外用可在骨折愈合早期促進骨組織中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的表達，同時可以維持晚期的表達量，延緩衰減趨勢，促進骨折愈合。

獨正桿接骨膏；骨折；愈合；家兔

獨正桿接骨膏(鄂藥制字Z20110140)是湖北民族學院附屬民大醫(yī)院治療四肢骨折、跌打損傷、筋骨疼痛等多種骨傷疾病的自制膏劑，具有活血化瘀、接骨療傷、通絡止痛等功效。臨床應用40多年來，其療效確切、副作用小、廉價方便，治愈大量骨折及筋傷患者，在恩施州及周邊地區(qū)具有較高的社會知名度。早在 1978 年該藥就獲得了全國衛(wèi)生醫(yī)藥科技成果獎，此后部分學者對其部分藥效機制、制劑工藝等方面進行了一些探索[1]。本研究旨在前人研究的基礎上，探討獨正桿接骨膏外用對家兔骨折愈合過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1 A(BMPR-1 A)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(BMPR-1B) mRNA表達的影響，分析其促進骨折愈合的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通成年日本大耳白兔30只，5～8月齡，平均體質量(2.0±0.5) kg/只，雌雄各半，購于湖北省實驗動物研究中心(許可證號SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 實驗藥物

獨正桿接骨膏由湖北民族學院附屬民大醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(鄂藥制字Z20110140，生產(chǎn)批號20100406)。

1.3 主要實驗試劑

TRIZOL試劑(Invitrogen公司，批號15596-018)，cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas公司，批號#K1622)；SYBR Green/Flouresceinq PCR Master Mix(2X)(Fermentas公司，批號#K0242)；Ex TaqTM(TAKARA公司，批號DRR100 A)；DL2000 DNA Marker(TAKARA公司，批號D502 A)；引物合成(南京金斯瑞生物技術有限公司)。

1.4 主要實驗儀器及設備

實時熒光定量PCR儀(ABI公司，型號Viia7)，分光光度計(上海舜宇恒科學儀器有限公司，型號752)，電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表有限公司，型號HW-SY11-K P2)，水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY300)，紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY02S)，電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號DHG 9203 A)，PH計(德國Metter-Toledo GmbH公司，型號LP115)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號EDC-810)。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分組 動物適應性飼養(yǎng)1周，術前禁食8 h。固定于兔架，腹腔注射麻醉，無菌條件下在橈骨前內(nèi)側中下1/3交界處縱行依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜約3 cm，鈍性分離肌肉充分暴露橈骨，用不銹鋼鋸造成左側橈骨中段3 mm的橫行骨缺損。生理鹽水沖洗傷口，皮膚消毒后逐層縫合，無菌紗布包扎，自由飲食、一般飼料、分籠飼養(yǎng)，術后3 d每天給予青霉素鈉40萬單位預防感染，肌肉注射每天1次[2-4]。按隨機數(shù)字表法將造模成功后的30只家兔分成實驗組和對照組各15只。

1.5.2 干預方法 實驗組家兔每只按照5 g/kg的標準[5]將獨正桿接骨膏均勻地涂抹在無菌紗布塊上，并將紗布塊覆蓋切口上下5 cm左右的范圍，采用夾板外固定，每2 d換藥1次；對照組僅用碘伏常規(guī)消毒后普通無菌紗布塊包扎，夾板固定。

1.5.3 標本取材及處理 分別于給藥后第3、6、10周，每批每組隨機抽取5只，行X線攝片觀察骨折愈合情況后處死動物，無菌條件下以患處為中心，兩端各取長約1 cm骨組織為標本，液氮保存。

1.5.4 PCR法檢測BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達水平 取液氮中保存的新鮮冰凍骨組織，質量約為100 mg研成粉末，采用Invitrogen公司TRIZOL試劑，按照說明書提取動物組織中總RNA，分光光度計測定RNA濃度。表1顯示，參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。基因參考序列信息用Primer premier 5.0軟件設計引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以兔β-actin 作為內(nèi)參。反應體系：依次加入上游引物(10 μmmol/L)×0.5 μL，下游引物(10 μmol)×0.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)×μL 2，Ex Taq×0.25 μL，10×Ex Taq E buffer×2.5 μL，cDNA×1μL，加雙蒸水至25，反應條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30 cycles，72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA有無降解，取2 μLRNA溶液加1 μL上樣，緩沖液混勻，樣品加入樣品孔，接通電源80 V電壓電泳30 min，紫外燈下觀察結果并照相掃描，將結果存入電腦進行數(shù)據(jù)分析。Real time Q-PCR檢測：cDNA做10倍稀釋。反應體系：cDNA(10×稀釋)×4，上游引物(100 μmol/L)×0.4，下游引物(100 μmol/L)×0.4，H2O×5.2，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)× 10，反應條件： 50℃2 min 1個循環(huán)，95℃10 min，隨后40個循環(huán)，95℃30 s，60℃30 s。對實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法進行計算。

表1 BMPR-1 A/BMPR-1B及Rabbit β-actin引物序列表

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況及X線片觀察結果

術后第1天各組實驗家兔能在籠中自如活動，正常進食及飲水。術后1周實驗組家兔傷口紅腫情況逐漸消退、無滲液；對照組組織紅腫未見明顯改善，無滲液，呈一期愈合，提示獨正桿接骨膏外用在骨折愈合過程中具有促進創(chuàng)傷愈合的作用。

圖1顯示，術后3周2組家兔骨折患處均可見到的骨缺損，實驗組可見云霧狀陰影；術后6周2組均可見到骨痂形成，實驗組骨缺損被骨痂填滿且周圍有大量外骨痂形成，對照組骨缺損處可見低密度骨痂填充，無外骨痂；第10周實驗組骨缺損消失、骨皮質重建、骨干外形已恢復、骨髓腔已通，對照組骨缺損模糊，有少量外骨痂，髓腔未通。

圖1 2組家兔左側橈骨骨折處X線影像注：第一行依次為對照組3、6、10周，第二行依次為實驗組3、6、10周

2.2 BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達水平檢測結果

表2圖2、3顯示，與對照組比較，實驗組第3、10周家兔骨組織標本中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第6周家兔骨組織標本中BMPR-1 A、BMPR-1BmRNA的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

表2 2組實驗動物各時間點BMPR-1AmRNA、BMPR-1BmRNA表達量

注：與對照組比較:*P<0.05

圖2 不同時間點家兔骨折患處骨組織中BMPR-1AmRNA RT-PCR電泳結果注：泳道1：DL2000;泳道2-4：對照組3、6、10周；泳道5-7：實驗組3、6、10周

圖3 不同時間點家兔骨折患處骨組織中BMPR-1BmRNA RT-PCR電泳結果注：泳道1-3：對照組3、6、10周；泳道4-6：實驗組3、6、10周;泳道7：DL2000

3 討論

骨折愈合是骨折斷端間的組織修復反應，是成骨細胞、破骨細胞及其他多種細胞和細胞因子參與的復雜過程。研究認為，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)為骨折愈合的啟動因子，被公認為是目前最強的骨誘導分化因子。BMPs并不直接作用于靶基因，而是通過BMPs受體、信號途徑和靶細胞基因組成的一個較為完整的信號系統(tǒng)，并發(fā)揮成骨誘導作用[6]。BMPs誘導成骨的機理主要是先與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)結合，BMPR分為I型、Ⅱ型受體，主要介導細胞內(nèi)BMP信號的傳導。其過程為BMP首先與II型受體和I型受體結合，I型受體磷酸化細胞內(nèi)Smad蛋白，在細胞內(nèi)Smad1、5、8能被I型受體激活后形成異聚體，與共同介質型Smad蛋白(Co-Smads)形成復合體，進入細胞核并與轉錄活化物或阻遏物形成復合物，調節(jié)靶基因轉錄，實現(xiàn)BMP信號由細胞外經(jīng)細胞質向細胞核內(nèi)靶基因的傳遞過程，然后再通過下游核心結合因子α1(Cbfα1)、成骨細胞特異性轉錄因子Osterix、遠端缺失基因5(Dlx5)、同源域基因c8(Hoxc8)和肌肉片段同源盒2(Msx2)等正向轉錄調控因子，與相應的OB特異蛋白ALP、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)等基因啟動子連接，促進細胞向成骨方向分化，其中I型受體包括BMPR1A、BMPR1B，決定了信號傳遞的特異性[7]。BMPR 是 BMP 信號通路的重要環(huán)節(jié)，當BMP受體表達受到抑制時就會在一定程度上阻斷BMP的信號通路，從而抑制細胞的生長分化[8]。有研究表明，在胚胎早期軟骨雛形形成過程中 BMPR-1B 表達增加，隨后在軟骨膜內(nèi)成骨時其表達迅速下降，而此時BMPR-1 A表達增加，提示BMPR-1B在軟骨雛形形成過程中發(fā)揮重要作用，BMPR-1 A則主要參與骨的進一步生長發(fā)育[9-10]。

獨正桿接骨膏由獨正桿、刺五加、刺老苞3味土家族藥物調和蜂蜜配制而成，主治跌打損傷、筋骨疼痛、閉合性骨折等多種病癥[1]。方中獨正桿性涼、味辛甘，具有活血散瘀、消腫止痛之功。刺五加[11]性溫、味辛，功能祛風濕、補肝腎、強筋骨；刺老苞[12]性平、味苦，有小毒，功能祛風除濕、散瘀消腫、止血止痛，三藥合用共奏接骨療傷、活血化瘀、通絡止痛之功[13]。作為一個優(yōu)秀的民族醫(yī)藥制劑，獨正桿接骨膏臨床用于治療腳踝部閉合性骨折療效顯著，同時對于急性軟組織損傷、類風濕關節(jié)炎、膝骨關節(jié)炎等疾病具有良好的治療效果[1]。前期研究結果表明，獨正桿接骨膏外敷給藥可對多項骨折愈合相關因子產(chǎn)生影響，如促進BMP-2、BMP-7、BMP-9、Smad1/5基因的表達，抑制Smad-6基因的表達[14-17]。

本實驗結果顯示，實驗組家兔第3周骨組織中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表達量明顯高于同期對照組的表達量，提示在骨折愈合早期過程中接骨膏可促進該受體的表達，加速介導細胞內(nèi)BMP信號的傳導過程，促進骨折愈合；而實驗組第6周的表達水平與對照組相當，提示在骨折愈合中期獨正桿接骨膏可能通過其他信號途徑加速骨折的愈合，有待進一步研究；實驗組第10周的表達水平顯著高于對照組同期水平，提示接骨膏在骨折晚期運用可維持BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表達量，延緩衰減趨勢，促進骨折的全面愈合。據(jù)此可以推測，獨正桿接骨膏促進BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA在患處骨組織中的表達可能是其良好療效的作用機制之一。

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EffectofExternalApplicationofDuzhengJieguPasteontheExpressionofBMPR-1AandBMPR-1BmRNADuringFractureHealinginRabbits

HUANG Qiong1,XIANG Yang

(MedicalCollegeofHubeiInstituteforNationalities,Hubei,Enshi445000,China)

Objective: To investigate the effect of expression of BMPR-1B mRNA and BMPR-1A in the healing process of Duzheng Jiegu Paste on rabbit fracture, and to analyze the mechanism of promoting fracture healing. Methods: 30 rabbits were randomly divided into experimental group and control group, with 15 rabbits in each group. The experimental group in the affected area with Duzheng Jiegu Paste and small splint fixation, The control group without of drugs, only after routine disinfection of small splint fixation. On 3rd and 6, 10 weeks after the treatment, respectively, each group of 5 randomly selected, x-ray observation of fracture healing. Death affected area from the tumor specimens of rabbits, rabbit bone tissue was determined by real-time fluorescent quantitative PCR method in the BMPR-1A and BMPR-1B mRNA content, statistical analysis of the data. Results: Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of rabbits of BMPR-1A and BMPR-1B mRNA were higher than those in the control group in the experimental group third and tenth weeks, the affected area of bone tissue specimens, the difference was statistically significant. Conclusion: Duzheng Jiegu Paste can also promote fracture healing in the early expression of BMPR-1A and BMPR-1BmRNA in bone tissue, it can maintain the expression of late, slow attenuation trend, promote fracture healing.

Duzhenggan Jiegu Paste; Fracture; Heal; Rabbits

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1391-03

國家自然科學基金資助項目(81360570)-土家族藥接骨膏對骨折愈合過程中BMP/VEGF表達調控的機理研究

黃 瓊(1975-)，女(土家族)，湖北恩施人，副教授，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)基礎理論與土家族驗方開發(fā)應用研究。

2017-04-06