生鮮羅非魚(yú)片專用復(fù)合天然防腐劑工藝優(yōu)化

摘 要：以總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和菌落總數(shù)為指標(biāo)，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)比較研究8 種不同天然防腐劑對(duì)生鮮羅非魚(yú)片中腐敗菌生長(zhǎng)的影響，并根據(jù)8 種天然防腐劑抑菌譜互補(bǔ)的原則配制出羅非魚(yú)片專用的復(fù)合天然防腐劑，配方為20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚(yú)精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖。按此配方配制的復(fù)合天然防腐劑能夠有效抑制羅非魚(yú)片中腐敗菌的生長(zhǎng)，使貯藏在4 ℃有氧冷藏條件下的生鮮羅非魚(yú)片的保質(zhì)期延長(zhǎng)至15 d以上，而不使用防腐劑的生鮮羅非魚(yú)片保質(zhì)期僅為9 d。

關(guān)鍵詞：羅非魚(yú)片；天然防腐劑；變性梯度凝膠電泳；菌落總數(shù)；總揮發(fā)性鹽基氮

Optimization of the Formulation of Natural Preservative Mixtures for Fresh Tilapia Fillets

MENG Xiaohua

（School of Food Engineering， Hebi Polytechnic， Hebi 458030， China）

Abstract： In this experiment， polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was adopted to evaluate the effect of eight different natural preservatives on the growth of spoilage microorganisms in fresh tilapia fillets and the effect on total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and aerobic plate count （APC） was also investigated. Taking into account their synergism， a preservative mixture was formulated containing 20% ginger juice， 20% garlic juice，

0.6 g/100 mL protamine， and 1.2 g/100 mL chitosan. This mixture could effectively inhibit the growth of spoilage microorganisms in tilapia fillets and prolong the shelf life to over 15 days compared to only 9 days for samples without any preservative treatment stored at 4 ℃.

Key words： tilapia fillets； natural preservative； denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； bacterial population；

total volatile basic nitrogen （TVB-N）

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708004

中圖分類號(hào)：TS254.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）08-0018-05

防腐劑保鮮技術(shù)是借助天然或合成化學(xué)成分的殺菌或抑菌作用，單獨(dú)或與其他保鮮方法相結(jié)合的保鮮方法。在生鮮魚(yú)片中添加合成防腐劑一般不易被消費(fèi)者接受，近年來(lái)，乳酸鏈球菌素（nisin）[1-2]、茶多酚[3-5]、殼聚糖[6-7]等安全、有營(yíng)養(yǎng)的生物保鮮劑得到了廣泛關(guān)注，但目前的研究多單獨(dú)將某種天然防腐劑應(yīng)用于魚(yú)肉制品中，或?qū)追N天然防腐劑復(fù)合使用，且全部基于經(jīng)驗(yàn)或根據(jù)傳統(tǒng)的抑菌譜實(shí)驗(yàn)（濾紙片法、稀釋法、杯碟法、濁度法等）確定配方。上述方式具有明顯的缺陷，例如由于魚(yú)肉制品中的大部分微生物是不可培養(yǎng)的[8]，用傳統(tǒng)的微生物分離及培養(yǎng)方法不可能確知魚(yú)肉制品體系的腐敗菌菌相，且上述抑菌譜實(shí)驗(yàn)對(duì)目前可分離、培養(yǎng)的微生物并沒(méi)有完全涵蓋，因此不能全面了解配方中各成分的防腐效果，也不能配制出針對(duì)性強(qiáng)、效力高的復(fù)合天然防腐劑。以基因（組）多樣性反映物種多樣性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，

PCR-DGGE）技術(shù)可靠性和重現(xiàn)性較好、方便快捷[9-10]，

可以比較全面客觀地展現(xiàn)整個(gè)菌群多樣性的動(dòng)態(tài)變化。國(guó)內(nèi)外已有研究將該方法用于鯽魚(yú)[11]、三文魚(yú)[12]、

草魚(yú)[13]及其他魚(yú)肉制品[14-16]中微生物的分析，但我國(guó)對(duì)于生鮮羅非魚(yú)片防腐保鮮方面的研究鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究8 種天然防腐劑對(duì)生鮮羅非魚(yú)片上腐敗菌生長(zhǎng)代謝的影響，合理組合不同防腐劑，針對(duì)性地抑制羅非魚(yú)片中微生物的生長(zhǎng)，研制生鮮羅非魚(yú)片專用天然防腐劑，以延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮羅非魚(yú)片 茂名市海名威水產(chǎn)科技有限公司。

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 廣州東盛生物科技有限公司；DNA Marker DL2000 德國(guó)Newgene Biotechnology公司；Go Taq Green Master Mix（2×） 美國(guó)Promega公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、6×上樣緩endprint

沖液 北京中生瑞泰科技有限公司；Goldview染料（含量≥95%） 上海范柏實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2001-220DGGE電泳儀 美國(guó)CBS Scientific公司；Gel-Dol 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；T196DNA擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；DYCP-31CN水平電泳儀 北京六一儀器廠；TPX-20MC紫外觀測(cè)臺(tái) 法國(guó)Vilber Lourmat公司；DSHZ-300A旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TL-MM-1微量振蕩器 廣州云薈貿(mào)易有限公司；SW-CJ-1FDA超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YX-280A手提式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；E-201-C-9復(fù)合電極 上海精密科學(xué)儀器有限公司；7250紫外分光光度計(jì) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 8 種天然防腐劑的配制

新鮮大蒜、生姜榨汁，過(guò)濾后得清液為原汁，用無(wú)菌蒸餾水稀釋原汁，分別配制成體積分?jǐn)?shù)為20%和60%的溶液；稱取殼聚糖0.4、1.2、2.0 g，分別用1%醋酸溶液溶解、定容至100 mL，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2；稱取茶多酚、Nisin、魚(yú)精蛋白、ε-聚賴氨酸各0.2、0.6、1.0 g，分別用無(wú)菌蒸餾水溶解、定容至100 mL；稱取溶菌酶0.1、0.3、0.5 g，分別用無(wú)菌蒸餾水溶解、定容至100 mL。

1.3.2 8 種天然防腐劑最佳防腐濃度的確定

將生鮮羅非魚(yú)片分別浸泡在不同濃度的8 種天然防腐劑溶液中5 min，瀝干后置于4 ℃冰箱中，定期取樣進(jìn)行菌落總數(shù)和總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測(cè)定，確定不同防腐劑的最佳防腐濃度。以浸泡無(wú)菌蒸餾水的魚(yú)片作為對(duì)照。

1.3.3 生鮮羅非魚(yú)片的PCR-DGGE分析

用最佳防腐濃度的8 種天然防腐劑分別浸泡生鮮羅非魚(yú)片5 min，瀝干后置于4 ℃冰箱中，冷藏6 d時(shí)取樣進(jìn)行PCR-DGGE分析。以浸泡無(wú)菌蒸餾水的魚(yú)片作為對(duì)照。

1.3.4 復(fù)合天然防腐劑的防腐效果研究

根據(jù)抑菌譜結(jié)果，針對(duì)性地將幾種天然防腐劑按一定比例進(jìn)行復(fù)配，將生鮮羅非魚(yú)片在復(fù)合天然防腐劑中浸泡后，4 ℃貯藏，定期取樣分析。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

菌落總數(shù)測(cè)定：按照GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[17]；TVB-N值測(cè)定：按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[18]中的微量擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 PCR-DGGE分析

DNA提?。涸跓o(wú)菌操作臺(tái)用無(wú)菌剪刀剪取魚(yú)肉10 g于滅菌錐形瓶（內(nèi)有10 g 玻璃珠和90 mL生理鹽水）中，搖床振蕩30 min，靜置后取20 mL上清液于無(wú)菌離心管中，10 000 r/min離心20 min，得菌體沉淀。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增：參照孟曉華等[19]的方法，采用巢氏PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA的16S rDNA的V3可變區(qū)。第1輪擴(kuò)增大小約為800 bp的細(xì)菌16S rDNA序列，引物為8F/798R，由上海捷瑞生物工程有限公司合成[20]。擴(kuò)增體系：Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。第2輪擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)片段，引物為GC 338F/518R[21-22]，以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：Go Taq Green Master Mix（2×）25 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后使用降落PCR程序[23]，20 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性1 min；退火溫度從65 ℃到55 ℃，退火30 s；72 ℃延伸3 min），再于恒定退火溫度下進(jìn)行10 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min），最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DGGE分析：采用質(zhì)量濃度為80 g/L的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為40%～60%（100%變性劑：7 mol/L尿素+

體積分?jǐn)?shù)40%的甲酰胺），在1×TAE（三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸，tris base-acetic acid-EDTA，TAE）緩沖液中，60 ℃、150 V條件下電泳5 h。膠片用含0.5 mg/L EB的1×TAE緩沖液染色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和圖像分析。

條帶回收和測(cè)序：參照Toffin等[24]的方法，在紫外觀測(cè)臺(tái)上切下膠片各泳道的主要條帶，溶于30 μL ddH2O中，搗碎、混勻，置于4 ℃條件下過(guò)夜。以10 μL回收DNA溶液為模板，用338F（無(wú)GC夾）/518R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定產(chǎn)物的產(chǎn)量及特異性。采用割膠純化法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆株進(jìn)行測(cè)序。DNA測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測(cè)序后獲得的細(xì)菌16S rDNA序列，登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行查詢和比對(duì)[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，SAS軟件進(jìn)行方差分析。樣品均平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的8 種天然防腐劑的防腐效果比較

由表1可知，經(jīng)不同濃度和種類防腐劑處理的羅非魚(yú)片冷藏過(guò)程中的菌落總數(shù)和TVB-N值均低于對(duì)照組，說(shuō)明8 種天然防腐劑對(duì)羅非魚(yú)片均有一定的防腐效果，且8 種天然防腐劑的最佳防腐濃度分別為生姜溶液20%、大蒜溶液60%、溶菌酶0.5 g/100 mL、茶多酚0.6 g/100 mL、nisin 1.0 g/100 mL、魚(yú)精蛋白0.6 g/100 mL、殼聚糖1.2 g/100 mL、ε-聚賴氨酸0.6 g/100 mL。

2.2 生鮮羅非魚(yú)片上腐敗菌的PCR-DGGE分析

1. 對(duì)照；2. Nisin；3. 茶多酚；4. ε-聚賴氨酸；5. 魚(yú)精蛋白；

6. 殼聚糖；7. 生姜溶液；8. 大蒜溶液；9. 溶菌酶。

DGGE圖譜上的不同條帶代表不同的細(xì)菌，條帶的亮度則反映細(xì)菌的數(shù)量，條帶越亮表示細(xì)菌的數(shù)量越多[21]。由圖1可知，不同種類的天然防腐劑對(duì)羅非魚(yú)片上細(xì)菌生長(zhǎng)的影響不同。切割圖1中各電泳條帶進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果如表2所示，8 種不同種類的天然防腐劑對(duì)DGGE條帶對(duì)應(yīng)相似菌株生長(zhǎng)情況的影響如表3所示。

2.3 復(fù)合天然防腐劑的防腐效果

根據(jù)8 種天然防腐劑抑菌譜互補(bǔ)的原則，優(yōu)選生姜、大蒜、殼聚糖和魚(yú)精蛋白4 種天然防腐劑，按比例復(fù)配（20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚(yú)精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖）后，浸泡羅非魚(yú)片，研究復(fù)合天然防腐劑的防腐效果。以浸泡無(wú)菌蒸餾水的魚(yú)片作為對(duì)照。

1. 對(duì)照組，貯藏0 d（未腐敗）；2. 對(duì)照組，貯藏9 d（開(kāi)始腐?。?；3. 對(duì)照組，貯藏15 d（嚴(yán)重腐敗）；4. 復(fù)合天然防腐劑處理組，貯藏9 d（未腐敗）；5. 復(fù)合天然防腐劑處理組，貯藏15 d（開(kāi)始腐敗）；6. 復(fù)合天然防腐劑處理組，貯藏21 d（嚴(yán)重腐敗）。

由圖2可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)復(fù)合天然防腐劑處理的魚(yú)片感官品質(zhì)下降較為緩慢。對(duì)照組魚(yú)片的TVB-N值和菌落總數(shù)顯著高于復(fù)合天然防腐劑處理組（P<0.05），冷藏9 d時(shí)對(duì)照組魚(yú)片的TVB-N值達(dá)21.2 mg/100 g，超過(guò)國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/100 g）[26]，而冷藏15 d時(shí)復(fù)合天然防腐劑處理組魚(yú)片的TVB-N值僅為18.69 mg/100 g。冷藏9 d時(shí)對(duì)照組魚(yú)片的菌落總數(shù)和冷藏15 d時(shí)復(fù)合天然防腐劑處理組基本持平?？梢?jiàn)，復(fù)合天然防腐劑能有效抑制羅非魚(yú)片TVB-N值和菌落總數(shù)的升高，從而有效延長(zhǎng)羅非魚(yú)片的保質(zhì)期。

由圖3和表4可知，與1號(hào)泳道相比，4號(hào)泳道沒(méi)有a、b條帶；與2號(hào)泳道相比，5號(hào)泳道沒(méi)有b、d條帶，且e、f、g條帶亮度較弱；與3號(hào)泳道相比，6號(hào)泳道各條帶亮度較弱；1、2、3號(hào)泳道的c、d、e、f、g條帶亮度依次增強(qiáng)，4、5、6號(hào)泳道的c條帶亮度依次增強(qiáng)，a條帶從無(wú)到有。這表明復(fù)合天然防腐劑處理組羅非魚(yú)片與對(duì)照組相比，其菌相構(gòu)成在冷藏的各個(gè)階段均存在較大差異。對(duì)照組魚(yú)片中細(xì)菌種類較多，且各類細(xì)菌的數(shù)量隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多，而復(fù)合天然防腐劑處理組魚(yú)片的假單胞菌數(shù)量明顯比對(duì)照組少，且菌相構(gòu)成較為單一。研究表明，有氧低溫冷藏（0～15 ℃）淡水魚(yú)的特定腐敗菌是假單胞菌，而寒帶和溫帶海域魚(yú)類有氧冷藏過(guò)程中的特定腐敗菌是耐冷的革蘭氏陰性假單胞菌和（或）希瓦氏菌[27-28]。本研究結(jié)果表明，復(fù)合天然防腐劑能有效抑制羅非魚(yú)片中的大部分細(xì)菌，且對(duì)導(dǎo)致羅非魚(yú)片腐敗的特定腐敗菌假單胞菌也有一定的抑制作用。綜合感官品質(zhì)、TVB-N值和菌落總數(shù)的變化可知，復(fù)合天然防腐劑能夠有效地將生鮮羅非魚(yú)片的保質(zhì)期延長(zhǎng)至15 d以上，而不使用防腐劑的生鮮羅非魚(yú)片保質(zhì)期僅為9 d。

3 結(jié) 論

本研究以TVB-N值和菌落總數(shù)為指標(biāo)，結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究8 種天然防腐劑對(duì)生鮮羅非魚(yú)片中腐敗菌生長(zhǎng)的影響，并根據(jù)8 種天然防腐劑抑菌譜互補(bǔ)的原則配制出羅非魚(yú)片專用的復(fù)合天然防腐劑，配方為20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL魚(yú)精蛋白、1.2 g/100 mL殼聚糖，按此配方配制的復(fù)合天然防腐劑能夠有效抑制羅非魚(yú)片中腐敗菌的生長(zhǎng)，使貯藏在4 ℃有氧冷藏條件下的生鮮羅非魚(yú)片的保質(zhì)期延長(zhǎng)至15 d以上。本研究中的復(fù)合天然防腐劑能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品中腐敗菌的靶向抑制，且能夠快速?gòu)?fù)配，高效、安全。

參考文獻(xiàn)：

[1]鞠健， 胡建中， 廖李， 等. Nisin結(jié)合輻照處理對(duì)冷藏鱸魚(yú)品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2016， 37（21）： 280-284. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.045.

[2]鞠健， 汪超， 李冬生， 等. 茶多酚和迷迭香結(jié)合Nisin對(duì)冷藏鱸魚(yú)品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)， 2017， 35（1）： 70-75.

[3]吳樂(lè)樂(lè)， 周軍輝， 劉春娥， 等. 茶多酚對(duì)三文魚(yú)保鮮效果研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2016， 37（13）： 173-175. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.041.

[4]于林， 陳舜勝， 王娟娟， 等. 茶多酚改性膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合膜對(duì)冷藏斜帶石斑魚(yú)的保鮮效果[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38（3）： 220-226. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703036.

[5]畢海丹， 崔旭海， 王占一， 等. 茶多酚和乳清蛋白對(duì)冷藏魚(yú)糜保鮮效果的影響[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（10）： 272-277. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201610046.endprint

[6]周強(qiáng)， 劉蒙佳， 蔡倩敏， 等. 殼聚糖復(fù)合膜在草魚(yú)保鮮中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（3）： 159-162. DOI：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.03.045.

[7]陳林林， 李偉， 張偉. 響應(yīng)面法優(yōu)化鯉魚(yú)魚(yú)糜復(fù)合保鮮工藝[J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38（2）： 307-312. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.051.

[8]TATSADJIEU N L， MA?WOR? J， HADJIA M B， et al. Study of the microbial diversity of Oreochromis niloticus of three lakes of Cameroon by PCR-DGGE： application to the determination of the geographical origin[J]. Food Control， 2010， 21（5）： 673-678. DOI：10.1016/j.foodcont.2009.10.006.

[9]PENNACCHIA C， ERCOLINI D， VILLANI F. Spoilage-related microbiota associated with chilled beef stored in air or vacuum pack[J]. Food Microbiology， 2011， 28（1）： 84-93. DOI：10.1016/j.fm.2010.08.010.

[10]DING Xiaofei， WU Chongde， HUANG Jun， et al. Eubacterial and archaeal community characteristics in the man-made pit mud revealed by combined PCR-DGGE and FISH analyses[J]. Food Research International， 2014， 62（8）： 1047-1053. DOI：10.1016/j.foodres.2014.05.045.

[11]李秀秀， 曾維偉， 陸兆新， 等. 鯽魚(yú)貯藏過(guò)程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38（5）： 274-280. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201705045.

[12]張新林， 謝晶， 錢韻芳， 等. PCR-DGGE法結(jié)合傳統(tǒng)技術(shù)研究4 ℃冷鏈貯運(yùn)條件下三文魚(yú)菌相變化[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（24）： 271-277. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624043.

[13]王建輝， 楊晶， 劉永樂(lè)， 等. 基于PCR-DGGE技術(shù)對(duì)冷藏過(guò)程中草魚(yú)肌肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2014， 14（10）： 203-209.

[14]儀淑敏， 王雪琦， 勵(lì)建榮， 等. 魚(yú)糜制品細(xì)菌菌群多樣性的PCR-DGGE方法建立[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2014， 14（7）： 192-198.

[15]涂宗財(cái)， 馬達(dá)， 王輝， 等. PCR-DGGE技術(shù)分析不同包裝條件下魚(yú)肉表面優(yōu)勢(shì)菌的菌群變化[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（20）： 143-147. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201420029.

[16]陳勝軍， 蔡秋杏， 李來(lái)好， 等. 應(yīng)用PCR-DGGE研究液熏羅非魚(yú)片貯藏過(guò)程中的菌相變化[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2014（9）： 49-54.

[17]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 4789.2—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

[18]上海市食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. GB/T 5009.44—2003 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2003.

[19]孟曉華， 段杉. 生鮮羅非魚(yú)片在冷藏過(guò)程中細(xì)菌群落演替的PCR-DGGE分析[J]. 食品工業(yè)科技， 2012（11）： 343-347； 351.

[20]LI Zhiyong， HE Liming， WU Jie， et al. Bacterial community diversity associated with four marine sponges from the South China sea based on 16S rDNA DGGE fingerprinting[J]. Journal Experimental Marine Biological Ecology， 2006， 329（1）： 75-85. DOI：10.1016/j.jembe.2005.08.014.

[21]AMPE F， OMAR N B， MOIZAN C. Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in Mexican pozol， a fermented maize dough， demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1999， 65（12）： 5464-5473.endprint

[22]MUYZER G， WAAL E C D， UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology， 1993， 59（3）： 695-700.

[23]AMPE F， MIAMBI E. Cluster analysis， richness and biodiversity indexes derived from denaturing gradient gel electrophoresis fingerprints of bacterial communities demonstrate that traditional maize fermentations are driven by the transformation process[J]. International Journal of Food Microbiology， 2000， 60（1）： 91-97. DOI：10.1016/S0168-1605（00）00358-5.

[24]TOFFIN L， WEBSTER G， WEIGHTMAN A J， et al. Molecular monitoring of culturable bacteria from deep-sea sediment of the Nankai trough， Leg 190 Ocean Drilling Program[J]. FEMS Microbiology Ecology， 2004， 48（3）： 357-367. DOI：10.1016/j.femsec.2004.02.009.

[25]ALTSCHU S F， MADDEN T L， SCHAFFER A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402. DOI：10.1093/nar/25.17.3389.

[26]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). GB 2733—2015 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2015.

[27]DALGAARD P. Qualitative and quantative characterization of spoilage bacteria from packed fish[J]. International Journal of Food Microbiology， 1995， 26（3）： 319-333. DOI：10.1016/0168-1605（94）00137-U.

[28]許振偉， 楊憲時(shí). 魚(yú)類腐敗菌腐敗能力的研究進(jìn)展[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（19）： 130-133. DOI：10.3969/j.issn.1006-060X.2010.19.043.endprint