急性心肌梗死后心室重構(gòu)相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

牛小偉　張晶晶　彭瑜　白明　張鉦

[摘要] 目的 通過生物信息學(xué)分析探討急性心肌梗死后心室重構(gòu)的相關(guān)基因及功能。 方法 分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中與心梗后心室重構(gòu)有關(guān)的數(shù)據(jù)集。 結(jié)果 在GSE47495數(shù)據(jù)集中共篩選出611個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）。在基因本體論分析中對(duì)DEG按照生物途徑、分子功能、細(xì)胞定位注釋。對(duì)DEG涉及的信號(hào)通路進(jìn)行Pathway分析。蛋白與蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)確定的核心基因有：酰基輔酶A氧化酶1（Acox1）、膜聯(lián)蛋白A1（Anxa1）、凝血因子XⅢ A1鏈（F13a1）。藥物篩選結(jié)果表明棕櫚油、姜黃素可能調(diào)節(jié)這些基因。 結(jié)論 在心肌梗死后心室重構(gòu)的發(fā)生過程中，出現(xiàn)表達(dá)變化的基因功能主要集中在代謝、細(xì)胞外基質(zhì)、炎癥、凝血方面，其中Acox1、Anxa1、F13a1可能發(fā)揮著重要作用，棕櫚油、姜黃素可能調(diào)節(jié)這些基因，發(fā)揮改善心室重構(gòu)的作用。

[關(guān)鍵詞] 急性心肌梗死；心室重構(gòu)；基因；生物信息學(xué)

[中圖分類號(hào)] R54 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（c）-0030-04

Analyzing gene expression profiles in ventricular remodeling after myocardial infarction via bioinformatics methods

NIU Xiaowei1，2 ZHANG Jingjing3 PENG Yu2，4 BAI Ming2，4 ZHANG Zheng2，4

1.The First Clinical Medical College， Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 2.Gansu Key Laboratory of cardiovascular disease， Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 3.Baiyin Second People′s Hospital， Gansu Province， Baiyin 730900， China； 4.The Heart Center， the First Hospital of Lanzhou University， Gansu Province， Lanzhou 730000， China

[Abstract] Objective To identify the molecular mechanisms underlying ventricular remodeling after myocardial infarction using bioinformatics methods. Methods Microarray data about ventricular remodeling after myocardial infarction were searched from GEO database. Results The array data of GSE47495 were obtained. A total of 611 DEG were identified. Gene ontology analysis showed that the DEG significantly enriched in biological processes， molecular function， and cell component. Pathway analysis showed the DEGs were involved in signaling pathways. The top 3 hub genes， Acox1， Anxa1， and F13a1 were identified from protein-protein interaction network. Results from drug screening indicated that palm oil and curcumin may regulate the above genes. Conclusion During post infarction ventricular remodeling， the identified DEG are mainly enriched in metabolism， extracellular matrix， inflammation， and coagulation. The hub genes， Acox1， Anxa1， and F13a1 provid potential targets for treatment of ventricular remodeling. Palm oil and curcumin may improve the ventricular remodeling through the regulation of these genes.

[Key words] Acute myocardial infarction； Ventricular remodeling； Gene； Bioinformatics

有研究表明，急性心肌梗死（簡(jiǎn)稱“心梗”）患者在住院期間的病死率已有所下降[1]。然而，大量患者出院后卻因心力衰竭反復(fù)住院，導(dǎo)致長(zhǎng)期病死率仍處于較高水平[1-2]。心梗后繼發(fā)的心室重構(gòu)是心衰發(fā)生的主要機(jī)制[3-5]，表現(xiàn)為梗死區(qū)心肌壞死產(chǎn)生膨出，非梗死區(qū)心肌肥大、間質(zhì)纖維化、心室壁增厚擴(kuò)張[3-5]。既往研究表明，細(xì)胞凋亡、代謝障礙、神經(jīng)激素系統(tǒng)紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)異常是心室重構(gòu)發(fā)生過程中的重要機(jī)制[3-5]。盡管針對(duì)上述機(jī)制的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β受體阻滯劑等藥物，已在一定程度上改善了心室重構(gòu)，但仍有相當(dāng)比例的患者并發(fā)心力衰竭[2]。因此，繼續(xù)深入認(rèn)識(shí)心梗后心室重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。生物信息學(xué)分析能系統(tǒng)了解不同組織在不同時(shí)間、不同生命狀態(tài)的基因表達(dá)差異，并全面理解基因間的相互關(guān)系，從中找出關(guān)鍵治療靶點(diǎn)[6]。本次研究擬從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）[7]中獲取與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)的基因表達(dá)譜，篩選出重要差異表達(dá)基因（differentially-expressed genes，DEG），并進(jìn)行功能分析，以期為心室重構(gòu)的防治提供新思路。endprint

1 材料與方法

1.1 基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE47495數(shù)據(jù)集。采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈的方法制作急性心梗的心室重構(gòu)模型[8]，術(shù)后2個(gè)月根據(jù)纖維瘢痕面積≥40%分組，超聲心動(dòng)圖檢查證實(shí)與無心室重構(gòu)組（n=12）相比，心室重構(gòu)組（n=5）的左室舒張末壓增高[（21.0±0.5） mmHg]（1 mmHg=0.133 kPa）、射血分?jǐn)?shù)降低（23±3）%。按照Affymetrix公司的檢測(cè)方法對(duì)左心室組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析。基因芯片的探針注釋信息來自GPL6247 [RaGene-1_0-st] Affymetrix Rat Gene 1.0 ST Array平臺(tái)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及DEG篩選

首先通過R 3.3.1軟件中的Bioconductor程序包對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)使用robust multiarray average法進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和匯總，然后繪制箱線圖評(píng)估芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量，最后對(duì)合格數(shù)據(jù)采用limma包進(jìn)行差異表達(dá)值計(jì)算，并根據(jù)貝葉斯檢驗(yàn)以及Benjamini-Hochberg算法進(jìn)行顯著性分析[8]。以變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>1.3且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）< 0.05為閾值選取DEG[9]。

1.3 基因本體論和通路分析

在注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）中[10]，根據(jù)基因本體論（gene ontology，GO）分析，按照生物途徑（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞定位（cellularcomponent，CC）對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類[11]。同時(shí)根據(jù)京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）進(jìn)行通路（Pathway）分析[12]。所有富集分析根據(jù)FDR值依次排序，分別列出前5名的基因注釋信息。FDR值越小，越有理由相信該差異基因顯著性地富集到某個(gè)注釋中[8]。

1.4 蛋白相互作用分析

運(yùn)用相互作用基因搜索工具數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING）構(gòu)建DEG的蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）[13]。選取可信度分?jǐn)?shù)高于0.4的互作對(duì)導(dǎo)入Cytoscape 3.4.0軟件[14]，使用MCODE插件對(duì)PPI進(jìn)行基因簇劃分[參數(shù)：節(jié)點(diǎn)度（degree cutoff）>5，鄰節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)（K-core）>2]，依據(jù)每個(gè)基因簇的評(píng)分篩選核心基因，并采用Pathway分析基因簇的功能[15]。

1.5 作用于分子靶點(diǎn)的藥物篩選

在比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD）中篩選能影響基因簇的藥物，F(xiàn)DR值越小，表明藥物對(duì)基因影響的可信度越高。

2 結(jié)果

2.1 DEG的篩選

對(duì)GSE47495數(shù)據(jù)預(yù)處理后，箱線圖顯示各樣本中值基本保持在同一條直線上，說明數(shù)據(jù)已標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)預(yù)先制定的閾值共篩選出611個(gè)DEG，其中上調(diào)448個(gè)，下調(diào)163個(gè)，聚類分析熱圖提示兩組間的基因整體表達(dá)模式存在明顯差異，同組之間各樣本間的重復(fù)性較好（圖1，封四）。

2.2 GO分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)分別從分子功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化描述，即對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了功能分類注釋。DEG在BP中，主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)（GO_BP：0030198）、創(chuàng)傷反應(yīng)（GO_BP：0009611）、脂肪酸代謝過程（GO_BP：00066 31）、藥物反應(yīng)（GO_BP：0042493）、細(xì)胞黏附（GO_BP：0007155）；在MF中，主要富集在結(jié)合模式（GO_MF：0001871）、多糖結(jié)合（GO_MF：0030247）、碳水化合物結(jié)合（GO_MF：0030246）、黏多糖結(jié)合（GO_MF：0005539）、鈣離子結(jié)合（GO_MF：0005509）；在CC中，主要富集在細(xì)胞外區(qū)域（GO_CC：0005576）、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（GO_CC：0005578）、細(xì)胞外基質(zhì)（GO_CC：0031012）、胞外區(qū)組分（GO_CC：0044421）、胞外基質(zhì)組分（GO_CC：0044420）。

2.3 Pathway分析

Pathway分析能明確顯著改變的代謝通路。DEG涉及代謝通路主要有：細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（KEGG_ pathway： rno04512）、脂肪酸代謝（KEGG_pathway：rno00071）、黏著斑（KEGG_pathway：rno04510）、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)（KEGG_pathway：rno04610）、不飽和脂肪酸生物合成（KEGG_pathway：rno01040）。

2.4 PPI分析

PPI分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因簇（圖2），包括40個(gè)節(jié)點(diǎn)，連接度為185，核心基因分別為?；o酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，Acox1）、膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1，Anxa1）、凝血因子ⅩⅢ A1鏈（coagulation factor ⅩⅢ A1 chain，F(xiàn)13a1）。對(duì)基因簇的功能富集顯示：3個(gè)基因簇分別主要參與脂肪酸代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等通路。

2.5 針對(duì)基因簇的藥物篩選

對(duì)上述3個(gè)基因簇采用CTD篩選，結(jié)果表明棕櫚油和姜黃素對(duì)ACADM、ACADVL、ADCY7、ANXA1、F13A1、CYBB、DECR1、APLN、C1QC、C3AR1、TGFB2、EHHADH、CD68、HADHA、ECHDC2、TYROBP、VWF、FN1、ACOX1、CTSS、C1QA、C1QB、TIMP1具有調(diào)控作用（FDR < 0.05）（圖3）。endprint

3 討論

心梗后心室重構(gòu)是近年越來越受關(guān)注的學(xué)術(shù)熱點(diǎn)問題[3-5]。既往已有研究收集了心衰與非心衰患者的心臟組織標(biāo)本，采用基因芯片方法進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)果提示與心衰相關(guān)的基因主要集中在線粒體功能、氧化磷酸化、細(xì)胞外基質(zhì)方面[16-18]。然而這些研究結(jié)果大多來源于已進(jìn)展至終末期心衰階段的擴(kuò)張型心肌病患者，采用的心臟標(biāo)本也經(jīng)過了長(zhǎng)期大量的藥物干預(yù)，難以準(zhǔn)確反映心室重構(gòu)自然發(fā)生過程中的基因表達(dá)譜變化。大鼠心梗模型具有良好的可重復(fù)性以及與人類疾病相似的變化過程，已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的研究[19]。在本次研究中，按照是否發(fā)生心室重構(gòu)將急性心梗大鼠重新分組，有利于在較為自然的狀態(tài)下，探索心室重構(gòu)發(fā)生的相關(guān)基因表達(dá)譜，從而為早期防治提供參考。此外，通過R軟件調(diào)用了標(biāo)準(zhǔn)limma包進(jìn)行DEG篩選[8]，隨后對(duì)DEG繪制熱圖，結(jié)果提示DEG能夠?qū)颖景凑帐欠癜l(fā)生心室重構(gòu)進(jìn)行聚類，這些均說明本次研究對(duì)DEG的篩選過程可靠。綜合GO分析和Pathway分析結(jié)果，本次研究發(fā)現(xiàn)DEG功能主要富集在代謝、細(xì)胞外基質(zhì)、炎癥、凝血方面。

STRING是目前使用最廣泛的蛋白-蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，可基于已有的研究知識(shí)與信息進(jìn)行模型構(gòu)建，展示數(shù)據(jù)的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)與機(jī)制。MCODE通過利用網(wǎng)絡(luò)中蛋白之間固有的關(guān)系尋找基因簇，進(jìn)而確定網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。在PPI分析中，本次研究通過共發(fā)現(xiàn)3個(gè)核心基因，即Acox1、Anxa1、F13a1。ACOX1是脂肪酸氧化的重要限速酶[20]。ANXA1是一種磷脂酶A2抑制蛋白[21]。F13A1是凝血因子ⅩⅢ的功能亞單位[22]。鑒于這些PPI分析中的基因簇可能成為改善心室重構(gòu)的治療靶點(diǎn)，本次研究繼續(xù)使用CTD篩選治療藥物，結(jié)果提示棕櫚油、姜黃素與這些基因簇的聯(lián)系最密切。其中姜黃素對(duì)心室重構(gòu)的保護(hù)作用已被較多研究支持[23]，但其機(jī)制仍未闡明，本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的相互作用基因，可能為其提供了新的機(jī)制思路。棕櫚油是一種具有調(diào)節(jié)脂肪酸代謝紊亂的食用植物油[24]，其與心室重構(gòu)的關(guān)系研究尚少，有待于未來研究證實(shí)，從而為心室重構(gòu)的防治提供更多措施。

本次研究還存在以下局限性：首先，在GO分析和Pathway分析中，僅列出排在前5名的基因注釋信息。雖然對(duì)其它FDR < 0.05的結(jié)果未能詳細(xì)說明，但由于FDR值大小本身能反映出基因功能的重要性程度，對(duì)富集程度越高的生物學(xué)過程進(jìn)行研究，可能會(huì)起到更好地效果[6]。其次，本次研究結(jié)果主要基于生物信息學(xué)分析，未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由于生命系統(tǒng)的復(fù)雜性以及各數(shù)據(jù)庫(kù)的局限性，使得某些數(shù)據(jù)的解釋可能會(huì)存在一定不足。

綜上所述，本次研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，從系統(tǒng)水平揭示了在心梗后心室重構(gòu)的發(fā)生過程中，出現(xiàn)表達(dá)變化的基因功能主要集中在代謝、細(xì)胞外基質(zhì)、炎癥、凝血方面，其中Acox1、Anxa1、F13a1可能發(fā)揮著重要作用，棕櫚油、姜黃素可能通過調(diào)節(jié)這些基因，成為改善心室重構(gòu)的治療藥物。

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（收稿日期：2017-07-17 本文編輯：李岳澤）endprint