人工繁育藏酋猴血液學(xué)及血液生化部分指標(biāo)正常參考值測(cè)定

楊 鋒 陳 輝 謝曉娟 曾 雅 余曉君

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，成都，610212)稿件運(yùn)行過(guò)程

人工繁育藏酋猴血液學(xué)及血液生化部分指標(biāo)正常參考值測(cè)定

楊 鋒 陳 輝 謝曉娟 曾 雅 余曉君

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，成都，610212)稿件運(yùn)行過(guò)程

藏酋猴；血液學(xué)；血液化學(xué)；正常參考值

目的：了解在人工繁育條件下，不同性別和年齡藏酋猴血液學(xué)和血液化學(xué)部分指標(biāo)的正常參考值范圍，為藏酋猴標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖及實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用提供參考數(shù)據(jù)。方法：利用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀和全自動(dòng)血液生化分析儀，測(cè)定119只健康藏酋猴血液學(xué)和血液生化值，并對(duì)不同性別、不同年齡段藏酋猴檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果：按年齡分組，成年組的LYM、RBC、HGB、HCT、BUN、Alb、TC等指標(biāo)，老年組WBC、BASO、RDW、MCHC、Na、CL等指標(biāo)與青年組比較有明顯差異(P<0.05)；老年組HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、Crea、Na等指標(biāo)與成年組比較有明顯差異(P<0.05)；按性別分組，成年組和老年組與青年組比較，有明顯差異的指標(biāo)更多。結(jié)論：本研究對(duì)人工飼育的健康藏酋猴建立了常用指標(biāo)的參考范圍，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用提供了參考的依據(jù)，同時(shí)，對(duì)藏酋猴背景數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供了有效的支撐。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被公認(rèn)為“活的試劑”、“活的精密儀器”，在生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的運(yùn)用日趨廣泛，其發(fā)展和應(yīng)用的程度對(duì)衡量一個(gè)國(guó)家和地區(qū)科學(xué)技術(shù)水平的能力起著越來(lái)越重要的作用，很多具有獨(dú)特價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被作為“戰(zhàn)略資源”被嚴(yán)格控制，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物因其在許多生物學(xué)特性方面都與人類較為接近，運(yùn)用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他品種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，受到更嚴(yán)格的管控。目前國(guó)內(nèi)外常用的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為獼猴(Macacamulatta)和食蟹猴(Macacafascicularis)。其體型適中，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，多用于藥物毒理學(xué)研究，而藏酋猴(Macacathibetana)因其體型較大、耐受力強(qiáng)、代謝穩(wěn)定等特點(diǎn)，正逐漸引起國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注。2013年第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院利用藏酋猴完成了國(guó)際首例“轉(zhuǎn)基因豬-藏酋猴異種異位脾窩輔助性肝部分移植術(shù)”實(shí)驗(yàn)，受體動(dòng)物(藏酋猴)打破了異種移植中移植物和受體存活時(shí)間的世界紀(jì)錄，為科研人員在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的使用有了新的選擇方向。

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所自2005年開(kāi)始從事藏酋猴人工培育和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化研究工作，經(jīng)過(guò)10余年的人工繁育，目前藏酋猴數(shù)量接近500只，基本形成老、青、幼三代繁育體系，為藏酋猴運(yùn)用于科研試驗(yàn)、新藥開(kāi)發(fā)及安全性評(píng)價(jià)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究利用全自動(dòng)血液生化分析儀及全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀，針對(duì)新藥臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則涉及的相關(guān)指標(biāo)，對(duì)藏酋猴血液學(xué)及血液生化學(xué)部分參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)不同年齡、性別進(jìn)行分析，初步建立正常參考區(qū)間，為藏酋猴的基本生理數(shù)據(jù)指標(biāo)的累積和分析提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次實(shí)驗(yàn)藏酋猴由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所養(yǎng)殖研究室提供。根據(jù)牙齒更新情況進(jìn)行年齡判斷[1]，分為青年組、成年組、老年組(表1)。所選動(dòng)物外觀正常，非生理周期，無(wú)懷孕個(gè)體，活動(dòng)自如，每日飼育2次，輔以水果及青飼料，自由飲水，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB 14922.1》、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級(jí)及檢測(cè)GB 14922.2》相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行篩查，挑選滿足要求的個(gè)體進(jìn)行樣本采集，完成檢測(cè)。

表1 藏酋猴年齡、體重分組情況

Tab.1 Tibetan macaque group based on different age and weight

注：*青年組與成年組和老年組比較，P<0.05；#青年組雄性與成年組和老年組雄性比較，P<0.05，與老年組雌性比較，P<0.05；△青年組雌性與成年組和老年組雄性比較，P<0.05

Note：Comparation between the youth and the old groups，as for *，P<0.05；in the male，for #，P<0.05；in the old，P<0.05；comparetion with the female in the youth group and the male in the adult and old group，as for △，P<0.05

1.2 主要儀器、試劑

1.2.1 儀器

全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(Sysmex-XN 20)，全自動(dòng)生化儀(日立LABOSPECT-008)。

1.2.2 試劑

均為儀器配套試劑。

1.3 檢測(cè)方法及指標(biāo)[2]

1.3.1 血常規(guī)檢測(cè)

利用阻抗法、化學(xué)染色法及光散射法對(duì)血液樣本的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析，指標(biāo)包括白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)、淋巴細(xì)胞(LYM)、單核細(xì)胞(MONO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比(RET%)。

1.3.2 血液生化檢測(cè)

尿素氮BUN(紫外-谷氨酸脫氫酶法)、肌酐Crea(肌氨酸氧化酶法)、總膽紅素Tbil(釩酸鹽氧化法)、總蛋白TP(雙縮脲法)、白蛋白Alb(溴甲酚綠法)、葡萄糖GLU(葡萄糖氧化酶法)、總膽固醇TC(氧化酶法)、甘油三酯TG(氧化酶法)、鉀離子K(離子選擇電極法)、氯離子Cl(離子選擇電極法)、鈉離子Na(離子選擇電極法)。

1.4 血液樣本采集

藏酋猴禁食14～16 h，工作人員利用吹管將采集個(gè)體麻醉，移入采集室，固定在保定架上5 min，采集后肢靜脈血，其中，EDTA抗凝管(紫色)采集2 mL用于血常規(guī)檢測(cè)，非抗凝管(紅色)采集3 mL用于血液生化檢測(cè)。

1.5 樣本處理

1.5.1 血液生化樣本

非抗凝管采集后在室溫放置10 min，對(duì)稱放入高速離心機(jī)3 000 r/min，離心5 min，小心分離清亮血清，避光備用。

1.5.2 血液常規(guī)樣本

抗凝管準(zhǔn)確接取2 mL血樣后，輕微顛倒搖勻2～3次，放入試管架備用。

1.5.3 所有樣本在離體后4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.6 分析方法

利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，描述參考值范圍(極小值～極大值)，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 年齡及體重

藏酋猴成年組和老年組體重高于青年組(P<0.05)，從整體分布趨勢(shì)觀察，不同年齡段雌性藏酋猴體重增長(zhǎng)穩(wěn)定，基本符合正常的發(fā)育趨勢(shì)(表1)。

2.2 血液常規(guī)檢測(cè)

成年組和老年組的WBC、LYM、BASO、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、BUN、Alb、TC、Na、Cl等指標(biāo)與青年組比較有明顯差異(P<0.05)，老年組HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、Crea、Na、Cl等指標(biāo)與成年組比較有明顯差異(P<0.05)(表2，表4)。

2.3 血液生化檢測(cè)

青年組雌性WBC、NEU、LYM、MONO、RET%、BUN、Crea、Alb、TG、CL，成年組雄性BUN，成年組雌性NEU、BASO、RBC、HGB、HCT、MCHC、RET%、BUN、Crea、TP、Alb、TBIL、TC、TG，老年組雄性Alb、K，老年組雌性RET%、TG、Na等指標(biāo)與青年組雄性比較，有明顯差異(P<0.05)；成年組雄性WBC、LYM、MONO、PLT、RET%、Crea、TG、CL，成年組雌性LYM、MONO、HGB、HCT、TP、Alb、GLU，老年組雄性WBC、LYM、BASO、MCV、RDW、RET%、K，老年組雌性WBC、NEU、MONO、BASO、Na、Cl等指標(biāo)與青年組雌性比較，有明顯差異(P<0.05)(表3，表5)。

表2 藏酋猴不同年齡段血液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果及范圍

Tab.2 Hematological detection at different age

續(xù)表2

注：*與青年組比較，P<0.05；△與成年組比較，P<0.05

Note：* Comparation with the youth groups，P<0.05；as for △，P<0.05

表3 藏酋猴不同性別各年齡段血液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

Tab.3 Hematological detection at different age based on sex

注：*與青年組雄性比較，P<0.05；△與青年組雌性比較，P<0.05

Note：* Comparation with the male in youth group，P<0.05；as for △，P<0.05

表4 藏酋猴不同年齡段血液生化檢測(cè)結(jié)果及范圍

Tab.4 Blood biochemical detection at different age

注：*與青年組比較，P<0.05；△與成年組比較，P<0.05

Note：Comparation with the male in youth group，as for *，P<0.05；as for △，P<0.05

表5 藏酋猴不同性別各年齡段血液生化檢測(cè)結(jié)果

Tab.5 Blood biochemical detection at different age based on sex

注：*與青年組雄性比較，P<0.05；△與青年組雌性比較，P<0.05

Note：Comparation with the male in youth group，as for *，P<0.05；as for △ in the female youth group，P<0.05

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)常用的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是獼猴、食蟹猴，針對(duì)獼猴、食蟹猴血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)的研究較多[3-6]，參考范圍也基本確定。藏酋猴作為四川特有的非人靈長(zhǎng)類資源，其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的開(kāi)發(fā)具有較大的科研潛力，但國(guó)內(nèi)關(guān)于藏酋猴血液學(xué)及血液生化學(xué)檢測(cè)指標(biāo)報(bào)道較少[7]，無(wú)可靠的檢測(cè)結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)的選擇依據(jù)，本研究全部采用標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖條件下的藏酋猴血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

血液學(xué)指標(biāo)是反映機(jī)體狀況的重要參數(shù)，是衡量營(yíng)養(yǎng)吸收、機(jī)體代謝、生理狀態(tài)的重要指標(biāo)，也是在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行動(dòng)物篩選、結(jié)果評(píng)價(jià)的重要因素，本研究對(duì)青年、成年、老年三代藏酋猴15項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)和11項(xiàng)血液生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，了解其不同年齡、性別各指標(biāo)的差異，并首次羅列了各指標(biāo)的分布范圍。

從本次檢測(cè)結(jié)果觀察中我們發(fā)現(xiàn)：

3.1 按年齡分組，血液學(xué)指標(biāo)WBC、RBC、HGB、HCT、MCHC、RDW等多項(xiàng)參數(shù)，青年組與成年組或老年組比較有明顯的差異，從列舉的范圍區(qū)間發(fā)現(xiàn)，老年組的藏酋猴多數(shù)指標(biāo)的分布范圍低于成年組和青年組，說(shuō)明青年組和成年組由于年齡增長(zhǎng)、成長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)吸收等多種因素，導(dǎo)致的血液學(xué)指標(biāo)波動(dòng)較大；血液生化指標(biāo)BUN、Crea、ALb、TC、Na、Cl等多項(xiàng)指標(biāo)，老年組與成年組、青年組比較有明顯差異，從列舉的范圍區(qū)間發(fā)現(xiàn)，BUN、Crea、GLU、Cl等參數(shù)，老年組與中、青年組比較呈上升趨勢(shì)，Alb、TBIL、TG、K等參數(shù)，老年組呈與中、青年組比較下降趨勢(shì)，從藏酋猴行為觀察及數(shù)據(jù)分析，應(yīng)為個(gè)體差異造成，應(yīng)屬正常范圍內(nèi)波動(dòng)。

3.2 按性別分組，血液學(xué)指標(biāo)WBC、NEU、LYM、MONO、BASO、RBC、HGB、HCT、MCHC、RET%，青年組雄性與青年組、成年組雌性比較有明顯差異；而WBC、NEU、LYM、MONO、BASO、RBC、HGB、HCT、MCV、RDW、RET%，青年雌性與青年雄性、成年雄性和雌性、老年雄性和雌性比較有明顯差異；血液生化指標(biāo)BUN、Crea、TP、Alb、TBIL、TC、TG、K、Na、Cl等多項(xiàng)指標(biāo)，青年組雄性與青年組雌性、成年組雌性和雄性、老年雌性和雄性比較有差異；Crea、TP、Alb、GLU、TG、K、Na、Cl等多項(xiàng)指標(biāo)，青年組雌性與青年組雄性、成年組雌性和雄性、老年雌性和雄性比較有差異。

3.3 從整體數(shù)據(jù)的波動(dòng)范圍觀察，并與已報(bào)道的其他非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物比較，多數(shù)指標(biāo)與其他非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比一致性較好。但藏酋猴體型較大，利于進(jìn)行器官移植等科研實(shí)驗(yàn)，具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

本次研究對(duì)藏酋猴進(jìn)行合理的篩選，采集樣本的個(gè)體均為繁育種群的健康動(dòng)物，采血過(guò)程、樣本處理、檢測(cè)方法及結(jié)果處理?xiàng)l件一致，檢測(cè)結(jié)果的可信度較高。通過(guò)對(duì)藏酋猴基礎(chǔ)指標(biāo)的檢測(cè)，了解各項(xiàng)指標(biāo)的分布范圍，對(duì)藏酋猴標(biāo)準(zhǔn)化繁育、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立有著重要意義。

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Tibetan macaque；Hematological index；Blood biochemical index；Normal inference range；Establishment

Reference on Hematological and Blood Biochemical Normal Index in Captive-Bred Tibetan Macaque

Yang Feng Chen Hui Xie Xiaojuan Zeng Ya Yu Xiaojun

(Experimental Animals of Sichuan Provincial People’s Hospital，Medical Sciences Academy of Sichuan Province，Chengdu，610212，China)

To understand the normal index reference of hematological and blood biochemistry of tibetan macaque of various age and both sexes，and to provide reference for the standard breeding and application in laboratory，we tested 15 hematological indexes and 11 blood biochemical indexes of 119 healthy Tibetan macaques，and compared the data by age and sex.Lymphocyte，red blood cell count，hemoglobin，hematocrit，blood urea nitrogen，albumin and total cholesterol of adult group and white blood cell count，basophil，red blood cell volume distribution width，mean corpuscular hemoglobin concen tration，natrium and chlorine of older macaques differed significantly from those of young macaques(P<0.05).Hemoglobin，hematocrit，mean corpuscular volume，mean corpuscular hemoglobin，mean corpuscular hemoglobin concen tration，creatinine and natrium of the old group differed significantly from those of the adult group.More indexes of the adult and old group differed from those of young group when compared by sex.This research provided a normal inference range for breeding Tibetan macaque，which could be applied in biomedicine，and supported the Tibetan macaque foundation databases.

2017-04-22

修回日期：2017-05-23

發(fā)表日期：2017-11-10

Q959.8 Q592.1

A

2310-1490(2017)04-587-06

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃：異種肝臟移植免疫耐受機(jī)制及誘導(dǎo)(2015CB554100)

楊鋒，男，44歲，助理研究員；現(xiàn)從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制工作。E-mail：410583808@qq.com