黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艷 王 妍鞠 銘

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉，133000)稿件運(yùn)行過(guò)程

黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艷 王 妍1鞠 銘

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉，133000)稿件運(yùn)行過(guò)程

東北亞種黑熊；12S rRNA；克?。恍蛄蟹治?/p>

為了解東北長(zhǎng)白山黑熊線粒體基因的遺傳學(xué)特點(diǎn)，本研究利用已報(bào)道的部分熊科動(dòng)物的線粒體基因的保守序列。本文采用PCR技術(shù)，首次從延邊圈養(yǎng)的黑熊的全血總DNA中擴(kuò)增出了線粒體12S rRNA基因，基因長(zhǎng)度為967 bp。將PCR產(chǎn)物純化回收后克隆于 pMD18-T Vector，成功構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒。并與已報(bào)道的四川黑熊、日本黑熊進(jìn)行了序列比較分析，結(jié)果表明，長(zhǎng)白山黑熊與四川黑熊的親緣關(guān)系比較近，在序列上具有較高的相似性。該研究為長(zhǎng)白山黑熊遺傳物種鑒定和多樣性研究提供了重要的參考依據(jù)，也為更深入的研究亞洲黑熊分子生物學(xué)提供了重要的參考。

熊科(Ursidae)動(dòng)物世界上共有6個(gè)屬(不含大熊貓Ailuropodamelanoleuca)，中國(guó)有3個(gè)屬，即棕熊屬(Ursus)，黑熊屬(Selenarctos)和馬來(lái)熊屬(Helarctos)。黑熊屬中，我國(guó)的為亞洲黑熊(Selenarctosthibetanus)，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅰ、國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物及《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》物種 Ⅴ 中，該種全部分布于亞洲，共分 8 個(gè)亞種，中國(guó)有5個(gè)亞種，即指名亞種(S.t.thibetanus)、喜馬拉雅亞種(S.t.laniger)、四川亞種(S.t.mupinensis)、臺(tái)灣亞種(S.t.formosanus)、東北亞種(S.t.ussuricus)[1-3]。延邊地區(qū)位于吉林省東南部，是黑熊資源比較豐富的地區(qū)。目前人工養(yǎng)殖數(shù)達(dá)3 147頭，占全國(guó)養(yǎng)殖數(shù)的27.4%[4]，圈養(yǎng)的黑熊來(lái)源多為長(zhǎng)白山野生黑熊繁殖而來(lái)。

多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)學(xué)者和專家從不同學(xué)科不同領(lǐng)域?qū)谛苓M(jìn)行了廣泛而深入的研究，已經(jīng)在美洲熊類基因組方面做了廣泛的研究，此外對(duì)大熊貓的研究也持續(xù)進(jìn)行著[4-8]，國(guó)內(nèi)亞洲黑熊也逐漸成為研究重點(diǎn)，研究報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)，如血型檢測(cè)、染色體組型分析、COI序列變異及其DNA條碼的應(yīng)用等[9]；在亞洲黑熊四川亞種方面有線粒體 DNA cytb基因、ND3_ND4L和tRNA_Arg基因、細(xì)胞色素 C氧化酶亞基Ⅰ基因、ATP 8和ATP 6序列分析等基因組的序列研究[10-17]，但在東北長(zhǎng)白山黑熊除了流行病學(xué)調(diào)查、黑熊基因 DNA 中部分微衛(wèi)星位點(diǎn)的探討等小數(shù)量的文獻(xiàn)可查，線粒體基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。但是，以這些卓有成效的研究為參考，我們利用哺乳動(dòng)物線粒體基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR 克隆技術(shù)對(duì)東北亞黑熊線粒體的12S rRNA 基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，并分析其序列特點(diǎn)，為長(zhǎng)白山黑熊的遺傳特點(diǎn)及多樣性分析研究提供了基礎(chǔ)資料，也為其他物種線粒體基因的研究提供了可靠的依據(jù)與科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

所用材料為東北黑熊的全血，取自吉林省延邊朝鮮族自治州地區(qū)3家黑熊養(yǎng)殖場(chǎng)(20只東北黑熊的血液樣本)。

1.2 載體與主要試劑

質(zhì)粒pMD 18-T Vector、Trans5a 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、PCR 試劑和所用的Taq酶購(gòu)自Takara工程有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物。

1.3 方法引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已報(bào)道的美洲黑熊(Ursusamericanus)、棕熊(Ursusarctos)和北極熊(Ursusmaritimus)(登錄號(hào)依次分別為：AF303109，AF303110，AF303111)的12S rRNA基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物來(lái)擴(kuò)增東北黑熊的12S rRNA基因(引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成)，其引物如下：

12S-F，5-CAAAGGTTTGGTCCTGGCCTTCCTA-3；12S-R，5-GTTTATCCAAGCACACTTTCCAGTA-3。

1.4 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的擴(kuò)增與鑒定

應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取黑熊血液中線粒體基因組DNA，并以此為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

PCR反應(yīng)體系 50 μL，含dNTPs 0.2 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，ExTaqDNA聚合酶 2.5 U，DNA 提取物2μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min，然后95 ℃變性 1 min，退火溫度60 ℃ 1 min，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min。

1.5 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆與鑒定

將純化的東北亞種黑熊線粒體12S rRNA目的基因片段與pMD18-T Vector 連接，轉(zhuǎn)化至Trans5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素 LB 平板篩選陽(yáng)性克隆重組菌。用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組克隆質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和EoR I、Sell I 雙酶切鑒定。

1.6 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的序列推導(dǎo)與分析

將PCR鑒定和EoR I、Sell I 雙酶切鑒定為陽(yáng)性的對(duì)應(yīng)菌液由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，并應(yīng)用生物學(xué)軟件DNA star 與NCBI 上發(fā)表的序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因的擴(kuò)增

12S rRNA 的預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為967 bp，黑熊樣本擴(kuò)增產(chǎn)物12S rRNA正介于750～1 000之間(圖1)，與預(yù)期結(jié)果大小一致，說(shuō)明 PCR 擴(kuò)增成功。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification注：M.DL 2000 DNA marker；1～2.PCR擴(kuò)增12S rRNA產(chǎn)物；3.PCR陰性對(duì)照Note：M.DL 2000 DNA marker；1-2.PCR amplification of 12S rRNA；3.Negative control

2.2 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因克隆結(jié)果鑒定

克隆后，取菌液2μL進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：所得條帶大小分別在967 bp左右(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明克隆成功；將經(jīng)過(guò)PCR 鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，分別應(yīng)用EoR I、Sell I 進(jìn)行雙酶切。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：分別獲得大小為2 692 bp多和967 bp的條帶(圖3)，說(shuō)明重組質(zhì)粒中均含有目的基因。

圖2 克隆的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of clone identification by PCR注：M.DL 2000 DNA marker；1～5.黑熊樣本的克隆；6.PCR陰性對(duì)照 Note：M.DL 2000 DNA marker；1～5.Clone of black bear’s sample；6.Negative control

圖3 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Enzyme digestion identification注：M.DL 2000 DNA marker；1.PCR陰性對(duì)照；2～6.雙酶切產(chǎn)物Note：M. DL 2000 DNA marker；1.Negative control；2～6.Product of enzyme digestion

2.3 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果

克隆的東北亞黑熊線粒體12S rRNA基因經(jīng)英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)定，東北亞黑熊線粒體

12S rRNA基因序列長(zhǎng)度為967 bp，將GenBank中發(fā)表的美洲黑熊(Ursusamericanus)、眼鏡熊(Tremarctosornatus)、大熊貓、四川黑熊和狗(Canislupusfamiliaris)的12S rRNA與其進(jìn)行比較，分析結(jié)果表明：與GenBank中發(fā)表的四川黑熊(DQ402478)12S rRNA基因的同源性最高，為98.7%(表1)，對(duì)角線以上為同源性比較，對(duì)角線以下為距離矩陣。利用MEGA 5.05 生成進(jìn)化樹(shù)，東北黑熊與四川黑熊的Bootstrap值為91，可以認(rèn)為這個(gè)分支是可靠的(圖4)。

本次測(cè)出的黑熊12S rRNA序列含341 個(gè)A，占35.30%；183 個(gè)G，占18.94%；224 個(gè)T，占23.19%；218 個(gè)C，占22.57%，G+C 含量為41.51%(圖5)。

圖4 6個(gè)物種12S rRNA的進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 12S rRNA gene from six species注：12S-19-2：亞洲東北黑熊；AF303109：美洲黑熊；AY390363：大熊貓；AY729880：狗；DQ402478：亞洲黑熊四川亞種；L21883：眼鏡熊Note：12S-19-2：S.t.ussuricus；AF303109：Ursus americanus；AY390363：Ailuropoda melanoleuca；AY729880：Canis familiaris；DQ402478：S.t.mupinensis；L21883：Tremarctos ornatus

表1 6個(gè)物種的12S rRNA基因同源性比較結(jié)果

Tab.1 Homology comparison of 12S rRNA gene from six species

注：*為同源性最高的一組數(shù)值

Note：*The highest homology of a set of values

圖5 6個(gè)物種的序列比較Fig.5 Sequence comparison of 12S rRNA from six species

3 討論

我們根據(jù)已報(bào)道部分黑熊各亞種的線粒體基因組的信息設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，成功擴(kuò)增出了東北亞種黑熊長(zhǎng)白山黑熊的線粒體12S rRNA基因序列，并成功構(gòu)建了該基因的克隆載體，經(jīng)序列測(cè)定分析，結(jié)果顯示，我們所擴(kuò)增的基因序列與已報(bào)道的四川黑熊12S rRNA基因序列同源性高達(dá)98.7%，聚類于同一支，說(shuō)明東北黑熊與四川黑熊親緣關(guān)系更接近。發(fā)現(xiàn)東北黑熊12S rRNA與四川黑熊基因全序列共有12個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)變異，8個(gè)位點(diǎn)是轉(zhuǎn)換，占變異總數(shù)的66.7%，其中有4個(gè)C?T轉(zhuǎn)換，占總轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的50%；A?G轉(zhuǎn)換有4個(gè)，占總轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的50%，無(wú)顛換位點(diǎn)。此外，有1處堿基缺失，為A 缺失；3處堿基增添，為2個(gè)A 插入和1個(gè)T 插入。

東北黑熊12S rRNA與美洲黑熊基因序列相比共有41個(gè)位點(diǎn)變異，其中36個(gè)位點(diǎn)是轉(zhuǎn)換，A?G轉(zhuǎn)換有20個(gè)，占總轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的55.6%，C?T轉(zhuǎn)換有16個(gè)，占總轉(zhuǎn)換位點(diǎn)的44.4%；1個(gè)位點(diǎn)為A?T顛換。此外，有1處堿基缺失和3處堿基插入。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠，實(shí)驗(yàn)分4次對(duì)圈養(yǎng)的黑熊進(jìn)行采血并提取其總DNA，每次提取5支，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行3次的PCR擴(kuò)增與鑒定，最終選取最為理想的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，所獲得的結(jié)果相同，證明了本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可靠性。

本實(shí)驗(yàn)首次成功克隆出東北黑熊的線粒體12S rRNA的序列，并對(duì)其進(jìn)行了初步的分析，填補(bǔ)本研究領(lǐng)域一項(xiàng)空白的同時(shí)也為探究黑熊線粒體基因組的遺傳特點(diǎn)、物種進(jìn)化關(guān)系及物種多樣性分析提供了科學(xué)參考。

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Black bear；12S rRNA；Cloning；Sequence analysis

Cloning and Sequence Analysis of 12S rRNA Gene of Mitochondria of Asian Black Bear (Selenarctos thibetanus ussuricus)

Yuan Xinhui Yuan Huiyan Wang Yan*Ju Ming

(College of Agriculture，Yanbian University，Yanji，133000，China)

To understand the genetic characteristics of mitochondrial DNA of black bears at Changbai Mountain in northeast China，we designed primers according to published mitochondrial DNA sequences of some ursidae species.We amplified 12S rRNA genes by PCR method for the first time from the whole blood of captive black bears in Yanbian.The amplicon was purified，cloned into pMD18-T vector and sequenced.A 967 bp sequence of 12S rRNA was obtained.We compared the obtained sequences with published sequences of Sichuan and Japan black bears.Results showed that black bears at Changbai mountain have closer genetic relationships and high similarity in sequence with Sichuan black bears.Our results provide a reference for bear species identification，for study of the genetic diversity of the Changbai Mountain ecosystem，and for study of the molecular biology of Asiatic black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-24

發(fā)表日期：2017-11-10

Q959.838

A

2310-1490(2017)04-569-06

袁昕慧，女，24歲，碩士研究生；主要從事寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。E-mail：853786640@qq.com

*通訊作者：王妍，E-mail：2676806621@qq.com