秋水仙素對非洲菊單倍體加倍效果研究

單芹麗,王繼華,李紳崇,瞿素萍，汪國鮮,楊春梅*,蔣海玉

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟信息研究所，云南 昆明 650205)

秋水仙素對非洲菊單倍體加倍效果研究

單芹麗1,2,王繼華1,李紳崇1,瞿素萍1，汪國鮮1,2,楊春梅1,2*,蔣海玉3*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟信息研究所，云南 昆明 650205)

【目的】研究非洲菊單倍體的加倍方法?！痉椒ā坎捎们锼伤夭煌幚矸绞?、不同處理時間和濃度對非洲菊單倍體(2n=x=25)進行加倍效果研究。【結(jié)果】和單倍體相比，雙單倍體(2n=2x=50)株型較大，葉片較寬，氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)較多。培養(yǎng)基添加秋水仙素法加倍效果最好，全株浸泡法次之，莖尖浸泡法最差。全株或莖尖在0.02 %的秋水仙素溶液中浸泡1 d，對單倍體植株無加倍效果；0.1 %的秋水仙素添加至增殖培養(yǎng)基處理7 d對植株造成的傷害最大，死亡率達80 %，但加倍率只有4 %?！窘Y(jié)論】0.05 %的秋水仙素添加至增殖培養(yǎng)基處理4 d，非洲菊單倍體植株的加倍效果最好(42 %)。

非洲菊；單倍體；秋水仙素；加倍效果

【研究意義】非洲菊(GerberajamesoniiBolus)又名扶郎花，為世界五大切花之一。目前，生產(chǎn)中迫切需要耐低溫、耐弱光、抗病蟲害的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)非洲菊新品種。然而，非洲菊屬于典型的異花授粉植物[1]，基因組高度雜合[2]，并且部分品種自交不親和[3]，致使后代純合體選育極度困難，影響了優(yōu)良品種選育效率。通常情況下，要獲得純合的自交系，需進行多代(4～6代)，甚至10代以上的自交，花費6～7年甚至8～9年的時間。單倍體植株經(jīng)染色體加倍后，可快速成為純合二倍體植株，提高育種效率[4]。同時，DH群體即加倍單倍體的特點是群體中的每一個系都是完全同質(zhì)純合, 所含信息量小, 無遺傳變異, 是數(shù)量性狀位點分析的良好群體[5]?！厩叭搜芯窟M展】云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所自2007年起先后對非洲菊單倍體開展了相關(guān)研究[6-10]，獲得并保存了一批非洲菊單倍體株系。非洲菊單倍體加倍技術(shù)國外已有相關(guān)研究[11-12]，但中國研究非洲菊單倍體起步較晚，還未見有關(guān)報道?！颈狙芯壳腥朦c】單倍體的育性一般較低[13]，影響了進一步的研究應(yīng)用，一般需要加倍才能恢復(fù)育性。因此，研究非洲菊單倍體的加倍方法具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗以非洲菊品種胚珠誘導(dǎo)的單倍體株系為材料，以未經(jīng)過化學(xué)藥劑處理的植株為對照，研究秋水仙素處理方式、處理時間和處理濃度對非洲菊單倍體植株加倍效果的影響，為推進非洲菊單倍體植株在育種中的研究有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自云南省農(nóng)科院花卉研究所在玉溪的非洲菊育種資源圃，將非洲菊品種‘紅極星’胚珠誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的單倍體株系qH25(2n=x=25)的組培繁殖苗切成單株后，選用株高約為1 cm的植株備用。

1.2 試驗設(shè)計

以未經(jīng)過秋水仙素處理的非洲菊單倍體植株為對照，采用秋水仙素不同處理方式、不同處理時間和濃度對單倍體植株進行化學(xué)誘變處理。每個處理接種6瓶，每瓶5株。秋水仙素的處理濃度分別為0.02 %、0.05 %和0.1 %，處理時間分別為1、4和7 d，按如下3種方法進行處理。

全株浸泡法：將單株完全浸泡于濃度為0.02 %～0.1 %的秋水仙素溶液中，處理1～7 d，期間搖動多次，處理完畢后，用無菌水浸泡20 min后，漂洗3次，轉(zhuǎn)入MS+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加食用白糖30 g/L ，瓊脂7g/L，pH 值5.5～5.8的繁殖培養(yǎng)基。

莖尖浸泡法：將滅菌后的藥劑用無菌針管注入繁殖培養(yǎng)基瓶內(nèi)，每瓶10 mL，然后放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，處理1～7 d后用無菌水清洗3次，轉(zhuǎn)入上述繁殖培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基添加秋水仙素法：將單株接種在添加了秋水仙素濃度為0.02 %～0.1 %的上述繁殖培養(yǎng)基中，處理1～7 d后，沒用無菌水漂洗，直接轉(zhuǎn)入無秋水仙素的繁殖培養(yǎng)基。

1.3 培養(yǎng)方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各處理置于溫度(22±2) ℃，光照強度40～50 μmol/m·s的培養(yǎng)室中，光照時間為10 h/d 。每30 d用相同的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接1次(即30 d為1個繼代周期)。處理植株培養(yǎng)30 d后，記錄處理材料的死亡數(shù)量，采用目測方法觀察剩余植株的受害情況。處理植株培養(yǎng)90 d后，以未處理的單倍體株系為對照，采用形態(tài)學(xué)特征、根尖染色體計數(shù)法和氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法對各處理進行倍性鑒定[10]，以3種鑒定方法得到的加倍率平均值作為該處理的加倍率。死亡率(%)=死亡株數(shù)/處理總株數(shù)×100，加倍率(%)=變異株數(shù)/總株數(shù)×100。計算各處理植株死亡率和加倍率。

2 結(jié)果與分析

2.1 非洲菊倍性變異植株鑒定情況

以未處理的單倍體株系為對照，采用根尖染色體計數(shù)法、形態(tài)學(xué)特征和氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法對各處理植株進行倍性鑒定。經(jīng)秋水仙素處理后，非洲菊單倍體株系的部分植株發(fā)生了變異，根尖染色體數(shù)目、組培苗形態(tài)特征和氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目都發(fā)生了變化(圖1～2)：單倍體的染色體數(shù)為2n=x=25，變異株雙單倍體的染色體數(shù)為2n=2x=50；和單倍體相比，雙單倍體的株型較大，葉片較寬；雙單倍體的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目比單倍體的氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)多。

A:單倍體2n=x=25；B：雙單倍體2n=2x=50A: haploid 2n=x=25; B: double haploid 2n=2x=50圖1 單倍體和雙單倍體根尖染色體鑒定Fig.1 Identification of haploid and double haploid apical chromosome

A:單倍體和雙單倍體株型；B：單倍體和雙單倍體葉片；C：單倍體氣孔保衛(wèi)細胞及葉綠體；D：雙單倍體氣孔保衛(wèi)及葉綠體A: Plant types of haploid and double haploid; B: Leaves of haploid and double haploid;C: Stomatal guard cells and its chloroplasts of haploid; D: Stomatal defense and its chloroplast of double haploid圖2 單倍體和雙單倍體植株形態(tài)特征、氣孔保衛(wèi)細胞和葉綠體Fig.2 The morphological characteristics, stomatal guard cells and its chloroplasts in haploid and double haploid

2.2 全株浸泡法的加倍效果

處理植株培養(yǎng)30 d后，用相同濃度的秋水仙素溶液浸泡全株，浸泡時間越長，單倍體植株受害越嚴重(表1)，死亡率越高；相同的處理時間，秋水仙素濃度越大，單倍體植株受害也越嚴重，死亡率也越高。處理植株培養(yǎng)90 d后，由于受死亡株數(shù)的影響，濃度為0.05 %和0.1 %的秋水仙素溶液浸泡植株4 d的加倍率反而比浸泡時間為7 d的植株加倍率高。

2.3 莖尖浸泡法的加倍效果

將非洲菊組培繁殖苗切成單株后，莖尖浸泡于不同濃度的秋水仙素溶液中，處理植株培養(yǎng)30 d后，濃度為0.02 %的秋水仙素溶液浸泡植株1 ～7 d，均無死亡率(表2)，但加倍率較低，甚至無加倍。濃度為0.1 %的秋水仙素浸泡植株莖尖7 d，植株受害最嚴重，死亡率最高，達46 %。處理植株培養(yǎng)90 d后，濃度為0.1 %的秋水仙素溶液浸泡植株莖尖4 d，加倍率最高，達15 %。

2.4 培養(yǎng)基添加秋水仙素法的加倍效果

將非洲菊組培繁殖苗切成單株后，接種在添加了秋水仙素濃度為0.02 %～0.1 %的繁殖培養(yǎng)基中，處理植株培養(yǎng)30 d后，濃度為0.02 %的秋水仙素處理1 d對植株無任何傷害(表3)，無死亡率；濃度為0.1 %的秋水仙素處理7 d對植株傷害最嚴重，死亡率達80 %。處理植株培養(yǎng)90 d后，濃度為0.05 %的秋水仙素處理4 d，單倍體的加倍率最高，達42 %。

表1 全株浸泡法加倍效果

表2 莖尖浸泡法加倍效果

表3 培養(yǎng)基添加秋水仙素法加倍效果

3 討 論

植物單倍體的染色體加倍的化學(xué)藥劑大多為秋水仙素，不同作物秋水仙素誘變處理的方法一般都不同，對秋水仙素的耐受性也不同，倍性誘變效果也不同。姜龍等應(yīng)用秋水仙素為誘變劑加倍甜玉米單倍體，用秋水仙素浸芽和針刺生長點對植株的傷害較嚴重，存活率低于50 %，浸種法處理效果最好，針刺生長點法次之[14]。趙翠榮等室溫下以0. 20 %的秋水仙素浸根處理單倍體小麥3～4 h，期間持續(xù)通入空氣并進行遮光處理的效果最佳，加倍率可達90 %[15]。張?zhí)煜璧仍陔x體培養(yǎng)條件下，以秋水仙素浸泡法和培養(yǎng)基添加秋水仙素法處理蘆筍單倍體幼苗的莖尖，培養(yǎng)基添加法的誘變效果較好，在培養(yǎng)基中添加0.30 %秋水仙素處理7 d時，染色體加倍率可達82.50 %[16]。本研究采用培養(yǎng)基添加秋水仙素法、全株浸泡法和莖尖浸泡法，研究不同秋水仙素處理濃度和處理時間對非洲菊單倍體的倍性誘變效果，認為采用培養(yǎng)基添加秋水仙素法，0.05 %的秋水仙素處理非洲菊單倍體4 d，加倍率達42 %(表3)是非洲菊單倍體加倍的最佳方案。

秋水仙素濃度及處理時間是影響倍性誘變的關(guān)鍵因素。秋水仙素能夠阻止細胞有絲分裂中紡錘體的形成，使分生細胞復(fù)制的染色體不能分向兩極，導(dǎo)致新生細胞染色體加倍[16]。同時，秋水仙素對植株有毒害作用，抑制植株生長，甚至導(dǎo)致植株直接死亡。所以，最佳的秋水仙素濃度和處理時間，既要考慮加倍效果，也要考慮對植株的損害程度。本實驗研究非洲菊單倍體的加倍效果時，充分考慮了上述因素，因此以變異株數(shù)占試驗總株數(shù)的百分比，而不是以變異株數(shù)占倍性鑒定總株數(shù)的百分比來計算加倍率。為了降低倍性鑒定誤差，試驗同時采用形態(tài)學(xué)特征、根尖染色體計數(shù)法和氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法對各處理進行倍性鑒定，以3種鑒定方法得到的加倍率平均值作為該處理的加倍率，倍性鑒定結(jié)果更加可靠。

李涵等[17]以非洲菊‘陽光海岸’和‘白馬王子’(2n=2x=50)品種為供試材料，秋水仙素處理濃度和處理時間分別為0.02 %、0.05 %、0.10 %和24、36、48 h，采用全株浸泡法對組培叢生芽進行加倍，0.10 %的秋水仙素處理24 h的倍性誘變率為2 %。本試驗采用全株浸泡法對非洲菊單倍體(2n=x=25)進行倍性誘變，0.1 %的秋水仙素處理24 h的倍性誘變率為11 %(表1)。采用相同秋水仙素處理方法、處理濃度和處理時間，二者由于試驗材料的倍性和基因型不同，誘變率存在較大差異，其原因還需進一步研究。

4 結(jié) 論

秋水仙素的處理濃度分別為0.02 %、0.05 %和0.1 %，處理時間分別為1、4和7 d，采用培養(yǎng)基添加秋水仙素法、全株浸泡法和莖尖浸泡法3種方法對非洲菊單倍體(2n=x=25)進行誘變處理。倍性鑒定結(jié)果表明，變異株雙單倍體的染色體數(shù)為2n=2x=50，和單倍體相比，雙單倍體株型較大，葉片較寬，氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)較多。培養(yǎng)基添加秋水仙素法加倍效果最好，全株浸泡法次之，莖尖浸泡法最差。0.05 %的秋水仙素添加至增殖培養(yǎng)基處理4d加倍效果最好，加倍率達42 %；0.02 %的秋水仙素溶液浸泡全株或莖尖1 d，對單倍體植株無加倍效果；0.1 %的秋水仙素添加至增殖培養(yǎng)基處理7 d，植株的死亡率達80 %，而加倍率僅為4 %。

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EffectofColchicineonGerberajamesoniiHaploidDoubling

SHAN Qin-li1,2, WANG Ji-hua1, LI Shen-chong1, QU Su-ping1, WANG Guo-xian1,2,YANG Chun-mei1,2*, JIANG Hai-yu3*

(1. Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture, Yunnan Kunming 650205, China; 2. Yuxi Yunxing Biotechnology Co., Ltd., Yunnan Yuxi 652604, China；3. Agricultural Economics Information Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China)

【Objective】Doubling method ofGerberajamesoniihaploid was studied. 【Method】The doubling effect of colchicine onGerberajamesoniihaploid (2n=x=25) was studied by different treatments method, time and concentration. 【Result】The plant type of double haploid was larger than that of haploid, the leaf was wider, and the number of chloroplasts was higher in stomatal guard cells. Addition of colchicines into the culture medium gave the best doubling effect, the whole plant immersion method gave satisfactory results, stem tip soaking method has the worst double effect. The whole plant or stem tip was treated in 0.02 % colchicine liquid for 1 day did not cause damage to haploid plants, but no doubling effect, 0.1 % colchicine was added to the culture medium for 7 days to cause the greatest damage to the plant, and the mortality rate was 80 %, but the rate was only 4 %. 【Conclusion】0.05 % colchicine was added to the culture medium for 4 days, the doubling effect ofGerberajamesoniihaploid plants was the best (42 %).

Gerberajamesonii; Haploid; Colchicine; Doubling effect

1001-4829(2017)10-2230-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.012

2017-01-13

云南省科技廳技術(shù)創(chuàng)新暨產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目(2015XB015)；云南省科技廳科技人才引進與培養(yǎng)專項—科技領(lǐng)軍人才培養(yǎng)(2016HA005)；國家科技支撐計劃項目(2015BAD10B00) ；云南省科技廳重大科技專項(2016ZA005)

單芹麗(1973-)，女，云南祥云人，研究員，觀賞園藝育種及種苗繁育技術(shù)研究，E-mail: shqli2008@126.com ，*為通訊作者：楊春梅，E-mail: 1577225885@qq.com，蔣海玉，E-mail: 1249087008@qq.com。

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(責(zé)任編輯 王家銀)