鯉魚源嗜水氣單胞菌FAH5分離鑒定及其對寄主感染的解剖病理學(xué)研究

余文杰，陳觀水

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建農(nóng)林大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350001)

鯉魚源嗜水氣單胞菌FAH5分離鑒定及其對寄主感染的解剖病理學(xué)研究

余文杰1，陳觀水2*

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建農(nóng)林大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350001)

【目的】對具有典型溶血性病征的染病鯉魚進(jìn)行病原菌分離純化鑒定，并研究其對寄主感染的解剖病理學(xué)特征?！痉椒ā坎捎脿I養(yǎng)瓊脂平板劃線方法從染病鯉魚肝臟樣本中分離得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行其生理生化特性探討，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。然后，采用嗜水氣單胞菌FAH5人工感染健康鯉魚，并通過解剖分析其器官病變情況?！窘Y(jié)果】感染嗜水氣單胞菌FAH5后，鯉魚體表粘液增加，分泌物增多，鰭部和腹部泛紅，鰓部出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，并充血發(fā)黑。解剖后腹腔和內(nèi)臟有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環(huán)障礙，血管擴(kuò)張為主，嚴(yán)重感染時這些器官有充血、出血和溶血現(xiàn)象，活性細(xì)胞經(jīng)感染病變至彌散性壞死?！窘Y(jié)論】有溶血性病征的染病鯉魚分離純化得到了嗜水氣單胞菌FAH5，人工感染健康鯉魚后出現(xiàn)相同癥狀，解剖病理學(xué)特征為腹腔和內(nèi)臟有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病變以血液循環(huán)障礙，血管擴(kuò)張為主。

鯉魚；嗜水氣單胞菌；分離鑒定；解剖病理

【研究意義】鯉魚是亞洲原產(chǎn)的溫帶淡水魚，喜歡生活在平原地區(qū)氣候溫暖的湖泊，并且喜歡生活在水流緩慢的河川里。很早以前中國和日本就把鯉魚當(dāng)做觀賞魚或食用魚養(yǎng)殖，而在德國等歐洲國家主要作為食用魚被養(yǎng)殖[1]。鯉魚背鰭比較長，沒有脂鰭，通?？谶呌许?，一般為2根，但也有的沒有須。鯉魚肉質(zhì)鮮白，營養(yǎng)價值很高，其中的魚籽加工成的魚籽醬產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價值很高?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中國地區(qū)的鯉魚產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖在20世紀(jì)80年代中后期不斷發(fā)展，隨后不斷壯大[2]。鯉魚生長適應(yīng)力強(qiáng)，生長迅速，遺傳穩(wěn)定，飼料品質(zhì)豐富，產(chǎn)量高。近些年，養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和養(yǎng)殖數(shù)量提高以后，養(yǎng)殖戶忽視了疾病預(yù)防措施，導(dǎo)致鯉魚的疾病品種增加，特別是一些機(jī)會污染菌引發(fā)的疾病[3]。鯉魚疾病的深入研究現(xiàn)如今處于起始階段，大部分研究人員局限在鯉魚疾病的分類和防治方法的簡單探討上面[4-5]，鯉魚病原菌的研究主要集中在嗜水氣單胞菌、鏈球菌和乳球菌分類上面[6-8]，很少涉及到致病性因子和致病機(jī)理的研究。迄今為止，鯉魚受到嗜水氣單胞菌感染后的解剖病理學(xué)研究還沒有研究人員涉及。2015年7月份，福建省閩侯縣泰富鯉魚養(yǎng)殖場的鯉魚爆發(fā)群體性疾病，死亡率達(dá)到80 %以上，造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬對染病鯉魚進(jìn)行病原菌分離純化和鑒定，并且開展此病原菌人工感染健康鯉魚的解剖病理學(xué)觀察。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在探討該病原菌的致病機(jī)制和有效預(yù)防控制措施，為鯉魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染病鯉魚收集與病原菌的分離純化

養(yǎng)殖場的染病鯉魚經(jīng)觀察患典型敗血癥，其主要癥狀為反應(yīng)遲鈍，不攝食，嚴(yán)重者口鼻充血、出血。冷藏樣本帶回實驗室解剖后，觀察可見其肝臟腫大，有點狀出血，腎臟、腸道充血。在無菌條件下從染病鯉魚的肝、腎，皮膚和血液取樣，營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落純化培養(yǎng)，經(jīng)分離純化后的菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)菌鑒定

經(jīng)細(xì)菌形狀、革蘭氏染色和生理生化檢測，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性細(xì)菌鑒定試劑條進(jìn)行檢測，而后使用VITEK-32 全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定。

1.3 試驗用健康鯉魚

人工感染所使用的健康鯉魚體長為6～8 cm，體重量為25～35 g，購買自福建省農(nóng)科院鯉魚養(yǎng)殖場，在實驗室養(yǎng)殖溫室正常飼養(yǎng)7 d后用于人工感染病原菌試驗。

1.4 試驗方法

1.4.1 人工感染病原菌試驗 設(shè)定嗜水氣單胞菌FAH5感染組和生理鹽水注射對照組，每組鯉魚30尾。將前述分離純化的嗜水氣單胞菌FAH5在營養(yǎng)瓊脂上30 ℃培養(yǎng)18 h,然后以無菌生理鹽水稀釋成8×106cells/mL的菌液。感染組的鯉魚腹腔使用一次性針筒注射菌液，劑量150 μl/尾，對照組注射150 μl/尾的無菌生理鹽水。鯉魚飼養(yǎng)池水溫為25 ℃，24 h持續(xù)充氣，每天換水1次，換水量約為1/3。試驗以14 d為1個周期，每天記錄鯉魚的發(fā)病以及死亡情況，并且固定典型特征死亡鯉魚，用于后續(xù)解剖病理學(xué)分析。

1.4.2 解剖病理切片的制備 分別收集5尾人工感染組鯉魚和3尾對照組鯉魚的肝臟、脾臟、腎臟，解剖后使用波恩氏液和體積分?jǐn)?shù)為2.5 % 的戊二醛進(jìn)行固定。固定后的解剖塊使用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，最后使用萊克2180切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為5 μm。切片完成后使用蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，使用奧林帕斯顯微鏡進(jìn)行病理圖像拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生理生化反應(yīng)及其鑒定

病原菌菌株FAH5經(jīng)分離純化后，使用VITEK-32 全自動細(xì)菌分析儀鑒定為嗜水氣單胞菌，生理生化特性具體見表1。

2.2 鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后臨床學(xué)特性研究

從圖1可以看出，健康鯉魚體表和解剖后內(nèi)臟均無典型病癥。鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，其體表出現(xiàn)粘液增加的現(xiàn)象，可見斑狀血點，鰭部和腹部泛紅; 鰓部出現(xiàn)腐爛充血發(fā)黑(圖2～3)。解剖后腹腔和內(nèi)臟器官有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環(huán)障礙，血管擴(kuò)張為主，嚴(yán)重感染時這些器官有充血、出血和溶血現(xiàn)象(圖4～5)。鯉魚人工感染嗜水氣單胞菌FAH5試驗結(jié)果表明，感染初期, 鯉魚就開始出現(xiàn)疾病和出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，7 d后死亡率高達(dá)70 %，相比較，對照組在實驗期內(nèi)均未出現(xiàn)死亡，也無典型病征(表2)。

2.3 解剖病理學(xué)研究

2.3.1 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚肝臟發(fā)病情況 鯉魚感染病原菌程度輕度時，肝臟病理變化主要出現(xiàn)血液循環(huán)降低，肝臟中央靜脈擴(kuò)張，引發(fā)紅細(xì)胞腫脹，嚴(yán)重感染時肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致血管腔溶血，肝臟血管周圍引發(fā)出血，引起含鐵血紅素沉積。早期病變肝臟細(xì)胞界限比較清楚，細(xì)胞稍微腫脹，胞質(zhì)中出現(xiàn)少量空泡，這些空泡隨后逐漸合并后出現(xiàn)明顯的變性空泡。隨著病情加重，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)彌散性壞死灶。大部分壞死肝臟細(xì)胞中心核消失，或者出現(xiàn)核固縮和核碎裂。伴隨血紅細(xì)胞的溶血，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)貧血現(xiàn)象。肝臟細(xì)胞被膜透明變性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖6)。

2.3.2 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚脾臟發(fā)病情況 鯉魚感染病原菌程度輕度時，脾臟病理變化主要是可以明顯區(qū)別脾臟紅白髓細(xì)胞，其中含有豐富的淋巴細(xì)胞。脾腔中紅細(xì)胞數(shù)量少，血液循環(huán)較為順暢。脾臟周圍觀察到紅細(xì)胞腫脹現(xiàn)象，其紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含少量粉紅色細(xì)顆粒，脾竇稍微擴(kuò)張，動脈和靜脈血管中紅細(xì)胞開始腫脹。隨著病情加重，脾臟細(xì)胞內(nèi)貧血，血管中紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血，在毛細(xì)管血管周圍出現(xiàn)紅細(xì)胞壞死。壞死細(xì)胞其核內(nèi)結(jié)構(gòu)慢慢消失，導(dǎo)致細(xì)胞核消失，或者核碎裂和核固縮(圖7)。

表1 菌株FAH5生理生化特性

圖1 鯉魚未感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片對照Fig.1 Anatomical slice of carp without infection of Aeromonas hydrophila FAH5

圖2 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5體表皮膚出血Fig.2 Skin hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

實驗組類別Experimentalgroupcategory實驗鯉魚數(shù)量Experimentalcarpnumber人工感染后不同時間段鯉魚死亡數(shù)量Mortalityofcarpatdifferenttimeafterartificialinfection1d2d3d4d5d6d7d8d9d死亡鯉魚數(shù)量NumberofdeadcarpFAH5感染組3034552110021生理鹽水對照組300000000000

圖3 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5體表尾鰭出血Fig.3 Tail fin bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

圖4 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片肝臟出血Fig.4 Hepatic hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

圖5 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片腸道出血Fig.5 Intestinal bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

2.3.3 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚腎臟發(fā)病情況 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5后其腎臟的病變主要是腎間質(zhì)出現(xiàn)腫脹和充血現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，腎臟細(xì)胞出現(xiàn)貧血現(xiàn)象；腎小體和腎小管影響程度較小，腎小管出現(xiàn)少量顆粒沉淀，從而喪失排水能力；腎小體毛細(xì)血管出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞囊腔變大(圖8)。

圖6 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5肝臟器官切片(400倍)Fig.6 Liver organ slice of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

圖7 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5脾臟器官切片(500倍)Fig.7 Splenic biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (500×)

圖8 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5腎臟器官切片(400倍)Fig.8 Renal biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

3 討 論

采用營養(yǎng)瓊脂平板劃線方法從染病鯉魚肝臟樣本中分離得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行其生理生化特性探討，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。這和前人的研究比較相似，如嗜水氣單胞菌感染鯉魚后產(chǎn)生敗血癥和出血性水腫，氣單胞菌感染鯉魚產(chǎn)生腹水疾病[4-5]。儲衛(wèi)華等從患病鯉魚中可以分離到病原菌嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌[7]。

將分離純化的嗜水氣單胞菌FAH5人工感染健康鯉魚后，感染組和自然發(fā)病魚體癥狀一致，因此認(rèn)為自然發(fā)病魚體的病原菌為嗜水氣單胞菌。鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后的臨床癥狀表現(xiàn)為，體表粘液出現(xiàn)增加，分泌物增多，以典型敗血癥為特征，鰭部和腹部泛紅，鰓部出現(xiàn)腐爛，充血發(fā)黑。解剖后腹腔和內(nèi)臟器官有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環(huán)障礙，血管擴(kuò)張為主，嚴(yán)重感染時這些器官有充血、出血和溶血現(xiàn)象，活性細(xì)胞經(jīng)感染病變至彌散性壞死。

染病鯉魚解剖病理研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的毒素是通過血液循環(huán)作用進(jìn)入到各內(nèi)臟器官，從而損傷各個內(nèi)臟器官的功能。肝臟，脾臟，腎臟的病理變化是從血管及血紅細(xì)胞產(chǎn)生病變，然后引發(fā)各個內(nèi)臟器官充血、出血和溶血。內(nèi)臟器官解剖切片研究表明，鯉魚的肝臟，脾臟和腎臟在發(fā)病初期，均表現(xiàn)為局部血液循環(huán)障礙，微血管腫脹擴(kuò)張，引發(fā)臟器充血、出血、溶血和貧血現(xiàn)象，最后引發(fā)活性細(xì)胞顆粒變性和空泡變性，再發(fā)展后出現(xiàn)彌散性壞死灶。引發(fā)鯉魚產(chǎn)生這些病變的原因主要是致病性嗜水氣單胞菌分泌各種毒素，包括溶血素、腸毒素和細(xì)胞毒素，這些毒素引發(fā)血紅細(xì)胞裂解，活性細(xì)胞滲透性變大，損傷毛細(xì)血管，引起鯉魚敗血癥[9-10]。本研究的結(jié)果表明，對于鯉魚的養(yǎng)殖，在疾病產(chǎn)生初期，內(nèi)臟器官還未出現(xiàn)實質(zhì)病變的時候，采取預(yù)防措施可以使鯉魚恢復(fù)健康，但如果疾病嚴(yán)重并且爆發(fā)時間較長時，就會出現(xiàn)鯉魚器官壞死，無法進(jìn)行治療。

[1]Janda J, Abbott S L. The genus Aeromonas：taxonomy, pathogenicity and infection[J]. Clin Microbiol Rev, 2010, 23(1)：35-73.

[2]Sunee K, Suwat D, Rungrawan C, et al. Didtribution of Aeromonas hydrophila Serogroups in different clinical samples and the development of polyclonal antibodies for rapid identification of the genus Aeromonas by direct agglutination[J]. Microbiol Immunol, 2002, 46(12)：875-879.

[3]Grim C J, Kozlova E V, Sha J, et al. Characterization of Aeromonas hydrophila wound pathotypes by comparative genomic and functional analyses of virulence genes[J]. Microbiology, 2013, 4(2)：64-73.

[4]Ansary A, Haneef R M, Torres J L, et al. Plasmids and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from healthy and diseased fish[J]. J Fish Dis, 1992, 15(2)：191-196.

[5]González-Serrano C J, Santos J A, García-López M L, et al. Virulence markers in Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii biovar sobria isolates from freshwater fish and from a diarrhoea case[J]. J Appl Microbiol, 2002, 93(3)：414-419.

[6]Subashkumar R, Thayumanavan T, Vivekanandhan G, et al. Occurrence of Aeromonas hydrophila in acute gasteroenteritis among children[J]. Indian J Med Res, 2006, 123(1)：61-66.

[7]儲衛(wèi)華，陸承平. PCR 擴(kuò)增特異性 16S rDNA 和溶血素基因檢測致病性嗜水氣單胞菌[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2005，29(1)：79-82.

[8]Chen Q，Yan Q，Wang K，et al．The portal of entry for pathogenic Vibrio alginolyticus into Pseudosciaene crocea and characteristic of the bacterial adhesion to the mucus[J]. Dis Aqu Organ，2008，80：181-188.

[9]毛 寧，王志明，鄭 鶯，等. 嗜水氣單胞菌與其拮抗菌R-15的生長曲線研究[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，24(1)：82-85.

[10]Shemesh M，Tam A，Steinberg D．Differential gene expression profiling of Streptococcus mutans cultured under biofilm and planktonic conditions[J]. Microbiology，2007，153：1307-1317.

DetectionofAeromonashydrophilaFAH5andPathologicalObservationofCyprinuscarpioInfectedwithStrain

YU Wen-jie1, CHEN Guan-shui2*

(1.Zhangzhou Vocational and Technical College, Department of Food and Biological Engineering, Fujian Zhangzhou 363000,China；2.Fujian Agriculture and Forestry University, College of Life Sciences, Fujian Fuzhou 350001,China)

【Objective】The pathogenic bacteria were isolated, purified and identified from the infectedCyprinuscarpiowith typical hemolytic symptoms, and the anatomical and pathological features of the infection were studied.【Method】The pathogen FAH5 was isolated from infectedCyprinuscarpioliver samples, its physiological and biochemical characteristics by VITEK-32 automatic analyzer were studied, which was identified asAeromonashydrophila. Then, the healthyCyprinuscarpiowere infected withAeromonashydrophilaFAH5, and their anatomical pathological changes were analyzed.【Result】After the infection withAeromonashydrophilaFAH5,Cyprinuscarpiomucus increased, secretions increased, fins and abdomen became red, and gills appeared rotten.The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the blood circulation disorders and vascular dilatation of the liver, kidney, spleen and other organs were found.Serious infections in these organs were found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.【Conclusion】TheAeromonashydrophilaFAH5 was isolated from theCyprinuscarpiowith hemolytic disease symptoms. The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the liver, kidney, spleen and other organs were found blood circulation disorders and vascular dilatation. Serious infection in these organs was found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.

Cyprinuscarpio;Aeromonashydrophila; Detection; Anatomical pathology

1001-4829(2017)10-2388-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.038

2016-11-10

國家自然科學(xué)基金(30900915)；福建省科技廳科學(xué)研究項目(JK2012012)

余文杰(1977-)，男，福建漳州人，講師，碩士，從事生物科學(xué)的教學(xué)及科研工作，E-mail：1527076860@qq.com；*為通訊作者：陳觀水，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：主要從事基因克隆與功能相關(guān)研究工作，水產(chǎn)動物繁育及病害防治，E-mail：2085404947@qq.com。

S965.116

A

(責(zé)任編輯 陳 虹)