林煙草NsylCBL10啟動(dòng)子的克隆及功能分析

毛靜靜，王倩，史素娟,3，張鴿,3，許迪之，李書貴,3，劉好寶

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；3 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東省青島市城陽(yáng)區(qū)長(zhǎng)城路700號(hào) 266109

林煙草NsylCBL10啟動(dòng)子的克隆及功能分析

毛靜靜1，王倩2，史素娟1,3，張鴿1,3，許迪之1，李書貴1,3，劉好寶1

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；3 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東省青島市城陽(yáng)區(qū)長(zhǎng)城路700號(hào) 266109

【目的】探究林煙草（Nicotiana sylvestris）類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）基因家族成員NsylCBL10的啟動(dòng)子在煙草不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及光信號(hào)刺激下的活性變化?！痉椒ā靠寺sylCBL10啟動(dòng)子并初步預(yù)測(cè)其順式作用元件；構(gòu)建NsylCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）的融合表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入普通煙草（Nicotiana tabacum），獲得轉(zhuǎn)NsylCBL10pro::GUS的純合材料；利用所獲轉(zhuǎn)基因材料探究NsylCBL10啟動(dòng)子在種子萌發(fā)期、幼苗期和成熟期的組織特異活性和在幼苗下胚軸的光誘導(dǎo)活性。【結(jié)果】預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NsylCBL10啟動(dòng)子含有與組織特異性和響應(yīng)光信號(hào)、植物激素和脅迫等相關(guān)的順式作用元件；組織化學(xué)染色試驗(yàn)表明，NsylCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在種子萌發(fā)期主要在子葉節(jié)區(qū)-根過(guò)渡區(qū)、根尖表達(dá)，子葉伸展期主要在子葉、子葉節(jié)區(qū)-根過(guò)渡區(qū)和根尖表達(dá)，十字期主要在葉片中表達(dá)，成熟期在柱頭、成熟的花藥、側(cè)根根尖和側(cè)根根基部表達(dá)量較高；幼苗下胚軸中，NsylCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS的基因表達(dá)在光下受到抑制，黑暗下被增強(qiáng)?！窘Y(jié)論】NsylCBL10啟動(dòng)子活性在煙草不同發(fā)育期的組織中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。在煙草分生能力強(qiáng)的部位和成熟期的花器官中其啟動(dòng)活性較強(qiáng)，在幼苗下胚軸中的啟動(dòng)子活性受到光信號(hào)的調(diào)控。

林煙草；NsylCBL10；啟動(dòng)子；GUS活性；組織特異性

植物在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期易遭受多種生物或非生物脅迫，因而它們?cè)陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的防御機(jī)制。類鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）家族是一類植物中特有的鈣感受器，在細(xì)胞響應(yīng)外界生物或非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。當(dāng)感應(yīng)到脅迫刺激時(shí)，細(xì)胞通過(guò)增加Ca2+流入使胞內(nèi)的Ca2+濃度驟增[2]，這些Ca2+濃度的改變會(huì)被下游的CBL感知[3]。CBL通過(guò)EF手型結(jié)構(gòu)結(jié)合Ca2+后，構(gòu)象發(fā)生改變并導(dǎo)致分子疏水特性等的改變[4]。通常情況下，這種改變促使CBL與下游CBL互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，CIPK）結(jié)合并使其激活，進(jìn)一步將信號(hào)向下游靶標(biāo)傳遞，最終引起植物對(duì)脅迫的響應(yīng)[5]。

CBL10是CBL蛋白家族中的重要成員，該蛋白參與植物抵抗高鹽、干旱和低溫脅迫、調(diào)節(jié)鉀素營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)對(duì)病菌侵染等功能已在多個(gè)物種中被證實(shí)。擬南芥（Arabidopsis thaliana）編碼AtCBL10的基因AtCBL10缺失后，突變體cbl10在高鹽脅迫下表現(xiàn)出鹽敏感表型，而過(guò)表達(dá)AtCBL10可消除cbl10突變體的鹽敏感表型[6]。研究認(rèn)為，AtCBL10-AtCIPK24蛋白復(fù)合體通過(guò)磷酸化液泡膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)換體，使該轉(zhuǎn)運(yùn)體將細(xì)胞內(nèi)多余的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，從而避免胞內(nèi)Na+濃度過(guò)高造成的生理紊亂[6-7]。過(guò)表達(dá)AtCBL10還可促進(jìn)擬南芥在高鹽脅迫下的結(jié)實(shí)，但該過(guò)程不依賴于AtCIPK24[8]。CBL10增強(qiáng)植物耐鹽能力的功能同樣在白楊（Populus trichocarpa）[9]、胡楊（Populus euphratica）[10-11]和玉米（Zea mays）[12]中得到驗(yàn)證。研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，胡楊PeCBL10轉(zhuǎn)入毛白楊中，可增強(qiáng)后者對(duì)干旱、低溫的抵御能力[11]。AtCBL10可直接作用于鉀離子通道AKT1（Arabidopsis K+transporter），抑制其K+內(nèi)流活性，從而參與細(xì)胞內(nèi)鉀離子平衡的調(diào)節(jié)[13]。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌侵染后，番茄（Solanum lycopersicum）SlCBL10-SlCIPK6蛋白復(fù)合體可激活位于質(zhì)膜上的呼吸爆發(fā)氧化酶（Respiratory burst oxidase，RBOH）家族成員RBOHB，誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，使被侵染部位的組織發(fā)生細(xì)胞程序性死亡從而避免病菌的進(jìn)一步擴(kuò)散[14]。

利用GUS組織化學(xué)染色的方法研究啟動(dòng)子的活性調(diào)控，或采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，可為研究基因的調(diào)控機(jī)理及新功能提供線索。研究表明，擬南芥AtCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因表達(dá)的研究表明，GUS主要在擬南芥萌發(fā)期的子葉與成熟期的莖、葉和花中表達(dá)，在成熟期根中的表達(dá)較弱[6-7]。qRT-PCR測(cè)定結(jié)果與之基本一致[6]。該結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步闡明AtCBL10在耐鹽及高鹽脅迫下的育性提供了數(shù)據(jù)支持[6-8]。對(duì)杜梨（Pyrus betulaefolia）PbCBL10啟動(dòng)子的研究表明，CaCl2、NAA和6-BA處理可提高啟動(dòng)子的活性[15]。qRT-PCR也證明在上述處理下，PbCBL10的表達(dá)上調(diào)。推測(cè)這些信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)PbCBL10啟動(dòng)子活性增強(qiáng)下游基因的表達(dá)[15]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高鹽可誘導(dǎo)林煙草（Nicotiana sylvestris）NsylCBL10的表達(dá)上調(diào)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因顯著增強(qiáng)了植株的耐鹽能力[16]。但NsylCBL10在煙草自身的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及其它信號(hào)刺激下的功能尚不清楚。本研究旨在通過(guò)克隆NsylCBL10的上游啟動(dòng)區(qū)序列并進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析，預(yù)測(cè)NsylCBL10基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，進(jìn)而為研究NsylCBL10的調(diào)控機(jī)理及新功能提供線索。

通過(guò)生物信息學(xué)和GUS化學(xué)染色手段，探究NsylCBL10啟動(dòng)子在煙草生長(zhǎng)發(fā)育不同階段及光信號(hào)刺激下的活性。所獲結(jié)果對(duì)解析NsylCBL10在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)中的作用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：實(shí)驗(yàn)材料為林煙草（Nicotiana sylvestris）和普通煙草（Nicotiana tabacum）中煙100，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源中心提供。

菌株和載體：質(zhì)粒構(gòu)建所用菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，所用載體為pMD19-T載體，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)所用菌株為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105， 轉(zhuǎn) 化 載 體 為 pBI101（GenBank號(hào)：U12639.1），均由本課題組自存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NsylCBL10啟動(dòng)子的克隆及質(zhì)粒構(gòu)建

在 NCBI網(wǎng) 站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上，以本課題組克隆到的NsylCBL10（GeneBank號(hào)：KF667488.1）[16]序 列 進(jìn) 行BLAST分 析， 將NsylCBL10定位到Contig NW_009386659.1上的Sca ff old Nsyl_sca ff old14307。根據(jù)Nsyl_sca ff old14307的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)NsylCBL10-1F/NsylCBL10pro-1R（表1），以林煙草基因組DNA為模版，擴(kuò)增NsylCBL10上游啟動(dòng)子片段。將該片段連入pMD19-T后獲得質(zhì)粒pMD19-T-NsylCBL10pro。以質(zhì)粒pMD19-T-NsylCBL10pro為模版，以NsylCBL10pro-2F/NsylCBL10pro-2R（表1）為引物對(duì)，擴(kuò)增獲得兩端引入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段，片段經(jīng)酶切后連入pBI101載體相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，最終得到NsylCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的表達(dá)載體pBI101-NsylCBL10pro::GUS，測(cè)序無(wú)誤后用于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。

表1 引物目錄Tab.1 Primers design

1.2.2 NsylCBL10啟動(dòng)子序列分析

啟動(dòng)子元件采用PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件和網(wǎng)站SoftBerry（https://www.softberry.com/）中的Nsite工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)錄起始序列采用網(wǎng)站SoftBerry中的Motif Explorer工具進(jìn)行分析。

1.2.3 煙草轉(zhuǎn)NsylCBL10pro::GUS純合株的獲取

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法[17]將NsylCBL10::GUS片段轉(zhuǎn)入中煙100中獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株；用引物對(duì)NsylCBL10pro-3F/GUS-R（表1）對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，收獲PCR鑒定陽(yáng)性材料的自交種（T1代）；對(duì)T1代進(jìn)行硫酸卡那霉素（Kanamycin，Kan）抗性篩選（篩選濃度=50 mg/L，下同；篩選量＞200粒），其中抗性分離比約為3:1（抗：不抗）的材料為單拷貝插入株系；分別收獲T1代單拷貝插入株系材料的單株自交種（T2代），對(duì)T2代進(jìn)行Kan抗性篩選（篩選量＞100粒），其中全部具有Kan抗性的材料為T2代純合轉(zhuǎn)基因植株；收獲T2代純合單株的自交種（T3代），用于GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)。

1.2.4 GUS組織化學(xué)染色方法

GUS染色液的配制參照J(rèn)e ff erson[18-19]的方法并加以調(diào)整。GUS染液配方為：0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），1 mg/mL的X-Gluc（先用DMF將X-Gluc溶解為100 mg/mL溶液），0.05 mmol/L的鐵氰化鉀，0.05 mmol/L的亞鐵氰化鉀，0.1%的Triton X-100。

取NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因純合材料的相應(yīng)組織，在避光條件下加入-20℃預(yù)冷的90%丙酮中，于冰上固定15～20 min，然后轉(zhuǎn)移浸入X-Gluc染液中，37℃避光孵育3～10 h（萌發(fā)期組織染色3 h，其他時(shí)期組織全部染色10 h），然后用乙醇乙酸混合物（75%乙醇+25%冰醋酸）將組織色素漂凈，最后存儲(chǔ)在75%乙醇中。

2 結(jié)果與分析

2.1 林煙草NsylCBL10基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

擴(kuò)增得到的NsylCBL10啟動(dòng)子長(zhǎng)度為2026 bp（圖1），在林煙草基因組中位于起始密碼子ATG上游-2110～-85 bp處（以A堿基位置為“0”）。啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NsylCBL10轉(zhuǎn)錄起始序列位于-177～-148 bp處且-169 bp處存在一個(gè)TATA-box。啟動(dòng)子上有14個(gè)得分（Matrix Score）大于5的增強(qiáng)元件CAAT-box（表2）。通過(guò)與已知真核生物的順式調(diào)控元件比較，共預(yù)測(cè)到5種主要的順式作用元件（表2），分別為：（1）組織特異性元件，包括花器官特異性表達(dá)元件CArG2、胚乳特異性表達(dá)元件Skn-1 motif和分生組織特異性表達(dá)元件CAT-box；（2）光響應(yīng)元件，如I-box、G-box和GT1-motif等；（3）生理周期調(diào)控元件circadian；（4）植物激素響應(yīng)元件，包括與水楊酸相關(guān)的TCA-element和TGA-box，與生長(zhǎng)素相關(guān)的TGA-box和與茉莉酸甲酯相關(guān)的TGACG-motif；（5）脅迫響應(yīng)元件，如與低氧脅迫相關(guān)的ARE以及高低溫響應(yīng)元件HSE。另外，啟動(dòng)子上還有其他一些調(diào)節(jié)元件的存在，如蛋白結(jié)合位點(diǎn)HD-Zip 3和代謝調(diào)節(jié)元件O2-site。以上分析表明，NsylCBL10啟動(dòng)子可能受光調(diào)控，在煙草的花、胚乳及分生組織中有活性，其活性可能還受到一些激素和非生物脅迫的調(diào)控。

圖1 NsylCBL10基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR ampli fi cation result of NsylCBL10 promoter

表2 NsylCBL10啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果匯總Tab.2 Prediction of cis-acting elements of NsylCBL10promoter

續(xù)表2

2.2 煙草純合NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因株系的獲得

按照1.2.3的篩選方法，采用葉盤法將NsylCBL10pro::GUS片段轉(zhuǎn)入普通煙草，經(jīng)基因組水平陽(yáng)性鑒定（圖2A）后共獲得20個(gè)T0代株系，收獲自交種T1代；對(duì)T1代進(jìn)行抗性篩選（圖2B），獲得2個(gè)單拷貝插入的T1株系；T1單株自交后收獲T2代，抗性篩選（圖2C）后，獲得2份不同單拷貝插入的NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因純合材料；自交后收獲T3代，用于GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)。

圖2 煙草NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因純合株的篩選Fig.2 The screening of homozygous NsylCBL10pro::GUS transgenic tobacco lines

2.3 NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的組織化學(xué)染色分析

利用GUS化學(xué)染色方法，對(duì)NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因材料的未成熟種子及幼苗進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，以確定NsylCBL10的表達(dá)定位情況。結(jié)果表明，在未成熟的種子表皮中檢測(cè)到GUS活性（圖3A）；在種子萌發(fā)期，主要在子葉節(jié)區(qū)—根過(guò)渡區(qū)[20]周圍和根尖處檢測(cè)到GUS活性（圖3B-E）；在子葉伸展期，主要在子葉中檢測(cè)到GUS活性，而子葉節(jié)區(qū)-根過(guò)渡區(qū)具GUS活性區(qū)域有所減少，根尖處仍能檢測(cè)到GUS活性（圖3F-G）；在煙草小十字期，煙草葉片中具有很強(qiáng)的GUS活性（圖3H-I）；在煙草大十字期，葉片中具有較強(qiáng)的GUS活性，根部也可檢測(cè)到微弱的GUS活性（圖3J）。

對(duì)NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因材料成熟期的花器官和根部組織進(jìn)行GUS活性檢測(cè)。結(jié)果表明，柱頭在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均有很高的GUS活性；更細(xì)致的觀察發(fā)現(xiàn)，柱頭上的乳突細(xì)胞中GUS活性很強(qiáng)（圖3K-L）。花藥中的GUS活性隨著雄蕊的成熟逐漸增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為：花器官形成初期的花藥中未檢測(cè)到明顯的GUS活性，花藥成熟散粉時(shí)具較強(qiáng)的GUS活性（圖3K）。成熟期的多數(shù)花粉被染成藍(lán)色，僅有個(gè)別無(wú)著色（圖3M）。側(cè)根根尖和側(cè)根根基部也檢測(cè)到較強(qiáng)的GUS活性（圖3N）。

以上結(jié)果說(shuō)明，NsylCBL10啟動(dòng)子在煙草生長(zhǎng)發(fā)育期的不同組織中有不同程度的活性，與順式作用元件的預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。推測(cè)NsylCBL10基因在胚乳、葉片、根尖、柱頭和成熟的花粉中發(fā)揮作用。

2.4 煙草幼苗下胚軸NsylCBL10啟動(dòng)子活性受光信號(hào)調(diào)節(jié)

NsylCBL10啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)表明，該序列上分布有多個(gè)光信號(hào)響應(yīng)元件，如GA-motif、GT1-motif、box4、G-box和DOF1等（表2）。同時(shí)，還含有與晝夜節(jié)律相關(guān)的生理周期調(diào)控元件circadian（表2）。因此，推測(cè)NsylCBL10啟動(dòng)子活性受光信號(hào)的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，分別對(duì)光照和黑暗下萌發(fā)的NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因材料種子進(jìn)行GUS活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在萌發(fā)期，光照條件下的幼苗在根部和子葉節(jié)區(qū)-根過(guò)渡區(qū)都檢測(cè)到GUS活性，子葉和下胚軸中未檢測(cè)到明顯GUS活性（圖3C-E；圖4A-C），黑暗條件下的幼苗各個(gè)部位均有很強(qiáng)的GUS活性（圖4E-G）；在子葉期，光照條件下的幼苗在根尖、子葉節(jié)區(qū)—根過(guò)渡區(qū)、子葉中檢測(cè)到很強(qiáng)的GUS活性，下胚軸中未檢測(cè)到明顯GUS活性（圖3F-G；圖4D），而黑暗條件下的幼苗各個(gè)部位均檢測(cè)到較強(qiáng)的GUS活性（圖4H）。上述結(jié)果初步表明，煙草幼苗下胚軸中NsylCBL10啟動(dòng)子活性可能受到光信號(hào)的調(diào)控，在光下該活性受到抑制。

圖3 不同生育期NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色結(jié)果Fig.3 The GUS staining of NsylCBL10pro::GUS transgenic tobacco plants in different developmental stages

圖4 光照或黑暗條件下萌發(fā)的NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色結(jié)果Fig.4 The GUS staining of light- or dark-germinated NsylCBL10pro::GUS transgenic tobacco plants

為進(jìn)一步探究光照對(duì)NsylCBL10啟動(dòng)子活性的影響，對(duì)連續(xù)光照培養(yǎng)10 d的NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行0 d、2 d、6 d、9 d和12 d的黑暗處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理6 d后下胚軸開(kāi)始檢測(cè)到GUS活性，且該活性具有隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增強(qiáng)的趨勢(shì)，黑暗處理6-12 d啟動(dòng)子活性增強(qiáng)更為明顯（圖5）。12 d后，對(duì)NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因幼苗恢復(fù)光照處理，取恢復(fù)光照后3 h、6 h、9 h和12 h的轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行GUS染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)光照3 h后下胚軸GUS活性開(kāi)始降低，12 h后已經(jīng)檢測(cè)不到明顯的GUS活性（圖5B）。上述結(jié)果初步表明，煙草幼苗下胚軸處NsylCBL10啟動(dòng)子活性受到光信號(hào)調(diào)控，在光照條件下被抑制，在黑暗條件下被激活。

圖5 黑暗處理或恢復(fù)光照處理下NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的GUS染色結(jié)果Fig.5 The GUS staining of dark- or recovered light-grown NsylCBL10pro::GUS transgenic tobacco plants

3 討論

3.1 NsylCBL10啟動(dòng)子在不同生長(zhǎng)期的組織特異活性分析

NsylCBL10啟動(dòng)子包含與分生組織表達(dá)相關(guān)調(diào)控元件CAT-box和生長(zhǎng)素相關(guān)的調(diào)節(jié)元件TGA-box和TGA-element。組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，幼苗期煙草的葉片、子葉節(jié)區(qū)-根過(guò)渡區(qū)、根尖、暗培養(yǎng)條件下的下胚軸成熟期煙草的根尖、側(cè)根根基部GUS活性較高，說(shuō)明該啟動(dòng)子在生長(zhǎng)旺盛或分生能力較強(qiáng)的組織中驅(qū)動(dòng)能力較強(qiáng)。前人結(jié)果也表明，NsylCBL10在腋芽中表達(dá)量較高[16]，PbCBL10在新葉中的表達(dá)量顯著高于老葉[15]。因此，推測(cè)生長(zhǎng)素可能在NsylCBL10啟動(dòng)子活性的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，NsylCBL10可能參與這些分生組織的形成分化。

已有研究表明，AtCBL10的啟動(dòng)子在擬南芥雄蕊的花絲、雌蕊的柱頭和傳導(dǎo)管中可驅(qū)動(dòng)GUS大量表達(dá)[8]，且AtCBL10已被證明在擬南芥的雄蕊和雌蕊的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[8]。在高鹽脅迫下，AtCBL10缺失后導(dǎo)致擬南芥雄蕊不能正常伸長(zhǎng)、花藥無(wú)法正常開(kāi)裂、花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管的伸長(zhǎng)受阻，過(guò)表達(dá)AtCBL10可恢復(fù)cbl10突變體在高鹽條件下的雄蕊和雌蕊的發(fā)育[8]。本研究中，NsylCBL10啟動(dòng)子中含有與花器官發(fā)育相關(guān)的作用元件CarG2[21]，且其在成熟花藥和雌蕊的柱頭中有較強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)活性。因此推測(cè)NsylCBL10啟動(dòng)子可能通過(guò)調(diào)節(jié)NsylCBL10的表達(dá)，參與煙草花器官的發(fā)育過(guò)程。

3.2 NsylCBL10啟動(dòng)子在幼苗下胚軸的光誘導(dǎo)活性分析

NsylCBL10啟動(dòng)子包含多個(gè)光響應(yīng)元件，如I-box[22]、G-box[22]和GT1-motif[23]等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：連續(xù)光照培養(yǎng)下的NsylCBL10pro::GUS轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行黑暗處理6 d后，下胚軸中開(kāi)始檢測(cè)到GUS活性，黑暗處理6～12 d內(nèi)GUS活性逐漸增強(qiáng)；恢復(fù)光照6 h后下胚軸中的GUS活性開(kāi)始減弱，恢復(fù)光照12 h后已經(jīng)檢測(cè)不到GUS活性。這表明幼苗下胚軸中NsylCBL10啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)能力在光照被抑制，黑暗下被激活，且對(duì)光信號(hào)的抑制調(diào)控更加敏感。光照可影響生長(zhǎng)素的分布和極性運(yùn)輸[24]，參與調(diào)節(jié)下胚軸的生長(zhǎng)發(fā)育[25]。推測(cè)光照使下胚軸中生長(zhǎng)素的濃度改變，進(jìn)而激活NsylCBL10啟動(dòng)子上的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，從而增強(qiáng)了下胚軸中NsylCBL10啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)分析NsylCBL10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在煙草中的表達(dá)情況，系統(tǒng)檢測(cè)了該啟動(dòng)子在煙草萌發(fā)期、幼苗期和成熟期組織中的活性及其在幼苗下胚軸的光誘導(dǎo)活性。結(jié)果表明：（1）NsylCBL10啟動(dòng)子在煙草多個(gè)組織中具有驅(qū)動(dòng)活性，且該活性在萌發(fā)期、幼苗期和成熟期中發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。（2）NsylCBL10啟動(dòng)子在幼苗的根尖和子葉節(jié)區(qū)—根過(guò)渡區(qū)、花器官的柱頭和成熟的花藥等組織中具有組織特異活性。（3）NsylCBL10啟動(dòng)子活性在幼苗下胚軸中受到光信號(hào)的調(diào)節(jié)。因此，NsylCBL10啟動(dòng)子是一個(gè)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，可隨生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境因素的變化從轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的精密調(diào)控。在分子育種中，可根據(jù)NsylCBL10啟動(dòng)子對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)和外界環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)合NsylCBL10基因的功能，使NsylCBL10按照人們的意愿在適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段和外界條件的誘導(dǎo)下表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草性狀的精確改良。

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*Corresponding author.Email：liuhaobao@caas.cn

Cloning and functional analysis of NsylCBL10 promoter in Nicotiana sylvestris

MAO Jingjing1, WANG Qian2, SHI Sujuan1，3, ZHANG Ge1，3, XU Dizhi1, LI Shugui1，3, LIU Haobao1*
1 Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Tobacco Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2 Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Tobacco Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;3 Institute of Agriculture and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China

【Objective】The aim of current study was to identify promoter activities of Nicotiana sylvestris Calcineurin B-like Protein family gene NsylCBL10 in the developmental processes and light-responsive processes of tobacco plants. 【Methods】The promoter of NsylCBL10 was cloned and its cis-acting regulatory elements were analyzed. A fusion vector NsylCBL10pro::GUS was constructed and transformed into Nicotiana tabacum. GUS staining of the transgenic plants was conducted to analyze the tissue-speci fi c and lightresponsive characteristics of NsylCBL10 promoter. 【Results】NsylCBL10 promoter was predicted to contain various cis-acting regulatory elements, including tissue-speci fi c elements, light-responsive elements, phytohormone responsive elements and stress-responsive elements.The activity of NsylCBL10 promoter was mainly detected in cotyledon node-root transition section and root tips during germination stage,while the active region expanded to cotyledons during cotyledon extension stage. The activity was detected in leaves of seedlings at crossseedling stage, and in stigma, mature anther, tip and base of lateral root of adult plants. Additionally, it was found that the activity of NsylCBL10 promoter was down-regulated under light condition while up-regulated in the dark. 【Conclusions】The activity of NsylCBL10 promoter varied in temporal and spatial manners in tobacco tissues and was greatly regulated in hypocotyl by the light signal.

Nicotiana sylvestris; NsylCBL10; promoter; GUS activity; tissue speci fi city

毛靜靜，王倩，史素娟，等. 林煙草NsylCBL10啟動(dòng)子的克隆及功能分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2017, 23（2）

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（No. ASTIP-TRIC03）；烤煙優(yōu)質(zhì)輕簡(jiǎn)高效栽培技術(shù)研究（No. SCYC201602）

毛靜靜（1992—），碩士，研究方向?yàn)樽魑镌耘啵琓el：0532-88701031，Email：maojingjing40@163.com

劉好寶（1964—），Tel：0532-88702576，Email：liuhaobao@caas.cn

2017-01-09；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-03-14