一個與煙草TMV 抗性基因N 緊密連鎖的共顯性SSR 標(biāo)記

粟陽萌，童治軍，李梅云，焦芳嬋，耿素祥，李永平

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長沙, 410128;2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,煙草生物技術(shù)育種重點實驗室, 國家煙草基因工程研究中心, 昆明, 650021;3 山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 濟南, 250014

生物技術(shù)

一個與煙草TMV 抗性基因N 緊密連鎖的共顯性SSR 標(biāo)記

粟陽萌1,2，童治軍2，李梅云2，焦芳嬋2，耿素祥3，李永平2

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長沙, 410128;2 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,煙草生物技術(shù)育種重點實驗室, 國家煙草基因工程研究中心, 昆明, 650021;3 山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 濟南, 250014

煙草普通花葉?。═obacco Mosaic Virus, TMV）是煙葉生產(chǎn)的主要病害，為建立煙草抗TMV分子標(biāo)記輔助選擇體系，本研究以高抗TMV烤煙品種Coker176和易感TMV烤煙品種Y3以及它們的BC1F1群體為試材，采用分離集團分組分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA）和簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat, SSR）標(biāo)記技術(shù)，篩選與TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標(biāo)記。通過對18764對SSR引物的分析表明，有396對SSR引物在兩親本間有多態(tài)，選出1對SSR引物TM508-007擴增出的標(biāo)記與TMV抗性的N基因緊密連鎖，遺傳連鎖距離為0.41 cM，證實獲得的與TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標(biāo)記穩(wěn)定可靠，可用于煙草抗TMV分子標(biāo)記輔助選擇。

煙草；煙草花葉?。环蛛x集團分組分析法；共顯性SSR標(biāo)記

煙草普通花葉病是由煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）引起的，TMV是第一個被鑒定的單鏈正義病毒[1]，屬于花葉病毒家族[2]，具有傳染活性[3]?？汕秩景煵菰趦?nèi)的茄科作物，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，選育抗病品種、提高煙草的抗病性是防治TMV的根本途徑。N基因是編碼煙草花葉病毒抗性的顯性單基因[4]，屬TIR-NBS-LRR類抗病基因，通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法從煙草野生種粘毛煙草(Nicotiana glutinosa)克隆得到[5]。N基因很容易進入育種程序且能夠很快在選育品種中穩(wěn)定下來，僅僅導(dǎo)入N基因就可使煙草具有TMV抗性[6-7]。因此，通過選擇具有N基因的育種材料可選出有抗性的基因型[8]?；跓煵萜胀ɑㄈ~病抗性基因N的基因組序列，國內(nèi)外的研究者成功地開發(fā)出多個用于檢測煙草TMV抗性的分子標(biāo)記[9-13]，同時建立了相應(yīng)的檢測體系[14]，并將其中的部分檢測標(biāo)記及方法申請了以下三個專利：ZL201010140771.2、ZL201110067006.7、ZL201410135454.X[15-17]。但上述所有基于N基因開發(fā)的分子標(biāo)記均是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分材料中N基因的全部基因型，即上述顯性標(biāo)記只能分辨出材料中是否含有抗性基因N，而無法進一步地區(qū)分出純合抗性（NN）和雜合抗性（Nn）。有部分標(biāo)記是基于N基因的全長cDNA進行設(shè)計的，在實際檢測中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及長片段DNA的PCR擴增等過程，檢測體系繁瑣，而SSR標(biāo)記重復(fù)性好、共顯性、易用PCR分析。本研究利用Coker176（抗病親本，其TMV抗性由N基因控制）和Y3（綜合性狀優(yōu)良但易感TMV）構(gòu)建回交一代（BC1F1）作圖群體，采用分離群體分組分析（Bulked Segregant Analysis, BSA）法，篩選與煙草普通花葉?。═MV）N基因連鎖的共顯性SSR標(biāo)記。旨在加速分子標(biāo)記輔助選擇（Marker Assistant Selection，MAS）在煙草TMV抗性品種選育中的利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2014年，以綜合性狀優(yōu)良易感TMV的烤煙Y3為母本，抗TMV烤煙材料Coker176（其抗性由N基因控制）為父本，雜交獲得F1，2015年以Y3為輪回親本，獲得回交一代（BC1F1）群體。2016年種植兩親本、F1和BC1F1世代材料用于群體分析。以上烤煙種質(zhì)資源均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 親本、F1代及BC1F1分離群體TMV抗性鑒定

參試試驗材料成苗后移栽至大田，行株距為100 cm × 50 cm；移栽3周后參照李梅云等方法接種TMV[18]。病害嚴(yán)重度的分級標(biāo)準(zhǔn)按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222-2008[19]，0～1級定為抗病植株，3～9級定為感病植株。

1.3 SSR標(biāo)記分析

煙苗4片真葉時，采用改良的CTAB法提取所有參試材料的基因組DNA[20]，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA提取物濃度和純度。

分離群體分組分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA）：選取BC1F1分離群體中的極端抗?。?級抗病）單株和極端感?。?級感?。﹩沃旮?5株的基因組DNA，等量混合構(gòu)建抗、感池，進行引物多態(tài)性篩選和標(biāo)記連鎖分析。

SSR-PCR的體系配制、產(chǎn)物擴增及擴增產(chǎn)物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（6%-non-PAGE）檢測，參照童治軍等的方法進行[21]。SSR標(biāo)記（引物）由兩部分構(gòu)成，共18764對，其中，PT系列引物5119對[22]，TM系列引物13645對[20,23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用BC1F1群體的123個單株驗證PCR擴增條帶在兩親本、F1和抗、感池之間具有多態(tài)性并且?guī)鸵恢碌囊?。對各個單株的帶型進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，抗病雜合條帶標(biāo)記做“H”，感病條帶標(biāo)記做“A”，條帶不清晰或者無擴增條帶的記做“U”，使用JoinMap 4.0軟件對BC1F1分離群體中TMV抗性基因N和共顯性SSR標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進行遺傳連鎖分析，計算其連鎖距離并繪制連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草TMV抗性N基因DNA池多態(tài)性分析

利用18764對SSR引物對抗病親本Coker176、感病親本Y3、兩親本間雜交子一代（F1）、抗病池和感病池共5份材料進行PCR擴增，高達99%的引物（18570對）能進行有效擴增獲得目的片段，在兩親本間有多態(tài)且在F1上呈共顯性的標(biāo)記有396個，其中與目的基因不連鎖標(biāo)記如TM508-103（圖1A），由此可知，SSR標(biāo)記在該群體的兩親本間的多態(tài)率極低，僅有2.11%（396/18764）。在產(chǎn)生共顯性多態(tài)的396個SSR標(biāo)記中，經(jīng)抗、感池的進一步分析，最終僅獲得1個標(biāo)記在抗、感親本間的多態(tài)性與抗、感池間的多態(tài)性一致（圖1B）。從圖1中可見，引物TM508-007（F: CACCATGGTTTGGCTTTCAT,R:GCAAAATGCAAAAAGGCAAT）在感病池與感病親本中的帶型完全一致，僅出現(xiàn)1條約220 bp的特異性條帶；在抗病池與F1中的帶型完全一致，呈現(xiàn)出共顯性的兩條特異性條帶（同時具有抗、感親本的特異性條帶，既具有抗病親本約228 bp的特異性條帶，又具有感病親本約220 bp的特異性條帶）。該結(jié)果與煙草TMV抗性基因N屬于顯性單基因的事實相吻合。

圖1 不同SSR標(biāo)記在5份材料中的PCR擴增結(jié)果Fig.1 The banding pattern of PCR ampli fi cation products for fi ve tobacco materials by different SSR markers

2.2 連鎖標(biāo)記的群體單株驗證

將獲得的與煙草TMV抗性基因N連鎖的共顯性SSR標(biāo)記對123株BC1F1單株進行驗證（圖2）。其中，有66個單株的抗性鑒定結(jié)果為感病（編號：1～66），剩余的57個單株的抗性鑒定結(jié)果為抗?。ň幪枺?7～123）。標(biāo)記TM508-007的基因型分析結(jié)果為：全部的66個感病單株的基因型均與感病親本Y3一致（擴增出一條約220 bp的特異性條帶）；57個抗病單株中，有56個呈現(xiàn)共顯性條帶（與F1帶型一致，抗、感病帶型同時呈現(xiàn)），而有1個單株（編號：70）則呈現(xiàn)出單交換，即抗性鑒定的結(jié)果為抗性單株，而基因型分析的結(jié)果卻為感病（僅出現(xiàn)感病基因型的特異條帶）。利用Joinmap 4.0 作圖軟件計算得到該共顯性標(biāo)記（TM508-007）與煙草TMV抗性基因N的連鎖距離約為0.41 cM（圖3）。

圖2 共顯性SSR標(biāo)記TM508-007在123個BC1F1單株中的PCR擴增結(jié)果Fig. 2 The results of PCR ampli fi cation products of 123 BC1F1 individuals with the co-dominant SSR marker TM508-007

圖3 共顯性SSR標(biāo)記T508-007與煙草TMV抗性基因N的連鎖關(guān)系Fig.3 Linkage relationship between the TMV resistant gene N of tobacco and co-dominant SSR marker TM508-007

3 討論與結(jié)論

迄今，利用N基因開發(fā)的標(biāo)記進行煙草標(biāo)記輔助育種在國內(nèi)外已有報道。高玉龍等根據(jù)煙草TMV抗性基因N的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，通過PCR反應(yīng)能夠在含有TMV抗性基因N的煙草中擴增出1條1200 bp左右的特征條帶，并依據(jù)能否擴增出該特征條帶來檢測煙草品種是否具有TMV抗性[24]。Lewis等設(shè)計了N基因的特異性引物，并且用所設(shè)計的特異引物對12個抗煙草花葉病毒品種進行PCR擴增，12個抗TMV品種都能夠擴增出目的條帶[9]。張亮等設(shè)計了一系列N基因的特異性引物，有效地分辨出N基因缺失和含有N基因的煙草個體[25]。劉磊等根據(jù)N基因cDNA序列設(shè)計出4對引物，經(jīng)過試驗驗證后所獲得2對有效引物，通過對供試的11個烤煙品種進行PCR擴增，結(jié)果在4個烤煙品種中擴增出了目的條帶，與已知的N基因在這11個烤煙品種中的分布結(jié)果一致，成功地建立了檢測N基因的PCR擴增體系[14]。然而上述基于N基因開發(fā)的分子標(biāo)記均是顯性標(biāo)記，無法一次性清晰地區(qū)分出材料中全部的三種基因型（抗病純合基因型（NN）、感病純合基因型（nn）和抗病雜合基因型（Nn））。本研究篩選獲得的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的SSR標(biāo)記TM508-007，能有效區(qū)分三種基因型（抗病純合基因型（NN）、感病純合基因型（nn）和抗病雜合基因型（Nn）），且具有穩(wěn)定可靠且簡易高效的特點。同時利用該標(biāo)記的序列信息并結(jié)合Bindler等[22]公開發(fā)表的含有2363個位點的高質(zhì)量煙草遺傳圖譜及中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中紅花大金元的基因組數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)尚未對外公開），最終將標(biāo)記TM508-007分別定位在第11號連鎖群的頂端和紅花大金元基因組的第1號染色體上（約75.51 Mb處），在該處的1.18 Mb區(qū)域（75.42Mb-76.24Mb）內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了6個基因（其在紅大基因組上的基因ID為：Ntab0849210、Ntab0849560、Ntab0849570、Ntab0849690、Ntab0849770和 Ntab0849780）， 其注釋功能均與TMV抗性相關(guān)（基因注釋：expressed protein, similar to TMV resistance protein）。

本研究利用回交一代（BC1F1）分離群體，采用分離群體分組分析（BSA）法和SSR標(biāo)記技術(shù)，篩選獲得共顯性的SSR多態(tài)性標(biāo)記TM508-007，經(jīng)對123個BC1F1分離群體進行基因型分析驗證，結(jié)果表明這種共顯性多態(tài)均穩(wěn)定存在，該共顯性標(biāo)記與目的基因N的遺傳連鎖距離為0.41 cM。由此推斷，該標(biāo)記與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖。

[1]Beijerinck MW. Ueber ein contagium vivum fluidum als ursacheder fl eckenkrankheit der tabaksblatter [J]. Verh Kon Akad Wetensch,1898, 5: 3-21.

[2]Dawson WO, Lehto KM. Regulation of tobamovirus gene expression [J]. Adv. Virus. Res., 1990, 8: 307-342.

[3]Erickson FL,Holzberg S,Calderon-Urrea A, et al. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco [J]. Plant J.,1999,18: 67-75.

[4]Gerstel DU. Inheritance in Nicotiana tabacum.XIX.Identification of the tabacum chromosome replaced by one from N. glutinosa in mosaic-resistant holmes samsoun tobacco [J]. Genetics, 1945, 30: 448-454.

[5]Whitham S, Dinesh-Kumar SP, Choi D, et al. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the Interleukin-1 Receptor [J]. Cell ,1994, 78:1101-1115.

[6]Ternovsky MF. Interspecific hybridization in tobacco and Makhorka (N. rustica) breeding [J]. The A.I. Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & Indian Tob. Ind. Krasnodar Publ, 1941, 143: 99-125.

[7]Ternovsky MF. Methods of breeding tobacco varieties resistant to tobacco mosaic and powdery mildew [J]. The A.I.Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & Indian Tob.Ind.Krasnodar Publ, 1945, 143: 126-141.

[8]Wernsman EA. Sources of resistance to virus diseases [J].Coresta Inf. Bull., 1992, 3: 113-119.

[9]Lewis RS, Milla SR, Levin JS. Molecular and genetic characterization of Nicotiana glutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus resistant tobacco accessions [J]. Crop Sci., 2005, 45(6): 2355-2362.

[10] 袁清華, 陳俊標(biāo), 李淑玲,等.抗TMV煙草種質(zhì)資源的N基因片段序列研究 [J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 1(29): 96-99.YUAN Qinghua, CHEN Junbiao, LI Shuling, et al. Study on partial sequence of N gene in tobacco germplasm recourses with TMV resistant [J]. Guangdong Agricultural Sciences,2011, 1(29): 96-99.

[11] 陳爽, 樸世領(lǐng), 金愛蘭.煙草抗TMVN基因及其在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用 [J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報, 2012,34(4): 355-361.CHEN Shuang, PAIO Shiling, JIN Ailan. N gene and its application on marker-assisted breeding for tobacco resistant to TMV [J]. Agricultural Science Journal of Yanbian University, 2012, 134(4): 355-361.

[12]張玉, 蔣彩虹, 馮莉,等. 3個烤煙品系對TMV抗性的遺傳規(guī)律分析 [J].植物遺傳資源學(xué)報, 2013, 14(5): 971-974.ZHANG Yu, JIANG Caihong, FENG Li, et al. Inheritance for resistance to TMV in three tobacco lines [J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2013a, 14(5): 971-974.

[13]張玉, 羅成剛, 殷英,等. 煙草N基因及其在烤煙遺傳育種中的應(yīng)用 [J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2013, 29(19): 89-92.ZHANG Yu, LUO Chenggang, YIN Ying, et al. Tobacco N gene and its application in genetic breeding [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013b, 29(19): 89-92.

[14]劉磊, 郭兆奎, 萬秀清,等. N基因標(biāo)記基因PCR檢測方法的建立及其在遺傳育種中的應(yīng)用 [J].分子植物育種,2010, 8(1): 167-171.LIU Lei, GUO Zhaokui, WAN Xiuqing, et al. Establishment of PCR detection system for marker gene N gene and its application in genetic breeding [J]. Molecular Plant Breeding, 2010, 8(1): 167-171.

[15]高玉龍, 肖炳光, 盧秀萍, 等. 分子標(biāo)記檢測N基因控制的煙草TMV抗性的方法 [P]. 中國專利:ZL201010140771.2, 2012-04-04.GAO Yulong, XIAO Bingguang, LU Xiuping, et al.Method for detecting TMV resistance of tobacco controlled by N gene by molecular marker [P]. China patent:CN101892304B, 2012-04-04.

[16] 楊軍, 張俊祺, 羅朝鵬, 等. 一步法復(fù)合檢測煙草普通花葉病毒與馬鈴薯Y病毒的方法及其引物[P]. 中國專利:ZL201110067006.7, 2012-12-05.YANG Jun, ZHANG Junqi, LUO Chaopeng, et al. Method and prime for multiply detecting tobacco mosaic virus and potato virus Y by one-step method.[P]. China patent:CN102140546B, 2012-12-05.

[17] 張玉, 羅成剛, 楊愛國, 等. 用于檢測煙草對TMV抗性的N基因特異性引物對、檢測方法及試劑盒[P]. 中國專利: ZL201410135454.X, 2015-09-16.ZHANG Yu, LUO Chenggang, YANG Aiguo, et al. Speci fi c primer pair, test method and kit for detecting N gene controlling TMV resistance of tobacco [P]. China patent:CN103866038B, 2015-09-16.

[18]李梅云，許美玲，焦芳嬋，等. 不同類型煙草種質(zhì)資源對TMV的抗性鑒定[J]. 煙草科技，2016,49（11）：7-13.LI Meiyun, XU Meiling, JIAO Fangchan, et al. Tobacco mosaic virus (TMV) resistance characterization in new tobacco germplasm resources[J]. Tobacco Science &Technology, 2016,49（11）：7-13.

[19]GB/T 23222-2008, 煙草病蟲害分級及調(diào)查方法[S].GB/T 23222-2008, Grade and investigation method of tobacco diseases and insect pests[S].

[20]Tong ZJ, Yang ZM,Chen XJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotiana tabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco [J].Plant Breeding, 2012, 131: 674-680.

[21]童治軍, 焦芳嬋, 肖炳光.普通煙草及其祖先種基因組SSR位點分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(11): 2108-2117.TONG Zhijun, JIAO Fangchan, XIAO Bingguang. Analysis of SSR loci in Nicotina tabacum genome and its two ancestral species genome [J]. Scientia Agricultura Sinica,2015, 48(11): 2108-2117.

[22]Bindler G, Plieske J, Bakaher N, et al. A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L.) obtained from large scale microsatellite marker development [J].Theor. Appl. Genet., 2011, 123(2): 219-230.

[23]Tong ZJ, Xiao BG, Jiao FC, et al. Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in fl ue-cured tobacco [J]. Breeding Science, 2016, 66:381-390.

[24] 高玉龍, 肖炳光, 童治軍, 等.煙草抗TMV基因連鎖分子標(biāo)記的篩選及在抗病資源篩選中的應(yīng)用 [J].分子植物育種, 2011, 9(5): 585-591.GAO Yulong, XIAO Bingguang, TONG Zhijun, et al.Identification of molecular markers linked to TMV resistance gene in tobacco and its application in screening resistance varieties [J]. Molecular Plant Breeding, 2011,9(5): 585-591.

[25]張亮. 煙草TMV抗性基因N基因的突變及進化分析 [D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文, 2011.ZHANG Liang. Mutation and evolution analysis of TMV resistance N gene in tobacco [D]. Dissertation for M.A.,Huazhong agricultural university, 2011.

：SU Yangmeng, TONG Zhijun, LI Meiyun , et al. Co-dominant SSR marker closely linked to TMV resistance gene N of tobacco(Nicotiana tobaccum L.) [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：liyongping@yntsti.com

Co-dominant SSR marker closely linked to TMV resistance gene N of tobacco(Nicotiana tobaccum L.)

SU Yangmeng1,2, TONG Zhijun2, LI Meiyun2, JIAO Fangchan2, GENG Suxiang3, LI Yongping2*
1 College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China;3 China Tobacco Shandong Industrial Co., Ltd., Jinan 250014, China

Tobacco mosaic virus (TMV) was one of the major diseases in tobacco (Nicotiana tabaccum L.) production. Separate progenies(BC1F1 population) from a cross between a resistant parent Coker176 and susceptible parent Y3 were used to establish TMV resistance gene N molecular marker-assisted selection system by bulked segregation analysis (BSA) method and simple sequence repeat (SSR)technology techniques. Among 18,764 SSR primer pairs, 396 SSR primers were polymorphic between parents, while only one SSR marker TM508-007 amplified products was closely linked to TMV-resistant gene N and the genetic distance between TM508-007 and gene N was 0.41 cm. The co-dominant SSR marker screened in this study enriched the number and types of molecular markers in terms of tobacco’s resistance to TMV, and they are expected to be used as marker-assisted selection in tobacco's resistance to TMV disease.

Tobacco (Nicotiana tabccum L.); tobacco mosaic virus (TMV); bulked segregation analysis (BSA); co-dominant SSR marker

粟陽萌，童治軍，李梅云，等. 一個與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標(biāo)記[J]. 中國煙草學(xué)報，2017,23（2）

中國煙草總公司云南省公司科技項目（2016YN27）

粟陽萌（1991—），碩士研究生，研究方向為煙草遺傳育種，Email：412404935@qq.com

李永平（1966—），研究員，主要從事煙草育種工作的研究，Email：liyongping@yntsti.com

2016-11-01；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版時間：

時間：2017-03-23