循環(huán)型microRNA-26a及其靶基因PTEN與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關性研究

崔丹瑜，朱丁季，任昊，林靜麗，賴偉男，黃琴，趙進軍，楊敏

（南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院 風濕免疫科，廣東 廣州 510515）

循環(huán)型microRNA-26a及其靶基因PTEN與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關性研究

崔丹瑜，朱丁季，任昊，林靜麗，賴偉男，黃琴，趙進軍，楊敏

（南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院 風濕免疫科，廣東 廣州 510515）

目的 探討循環(huán)型microRNA-26a（miR-26a）及靶基因PTEN在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的表達，以及在SLE發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。方法 選取36例SLE和10例健康體檢者血液標本，實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測血清miR-26a、外周血單個核細胞（PBMC）中PTEN的表達，統(tǒng)計分析miR-26a、PTEN與SLE臨床資料的相關性，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證PTEN是否為miR-26a的靶基因。結果 SLE患者血清miR-26a mRNA的表達高于健康人群（P＜0.05），PBMC中PTEN mRNA的表達低于健康人群（P＜0.05）。SLE患者miR-26a、PTEN的表達水平與C3、抗ds-DNA、紅細胞沉降率、狼瘡活動指數相關。miR-26a轉染BaF3細胞后，PTEN表達下調，PI3K表達上調，轉染組熒光素酶活性下降（P＜0.05）。結論 SLE患者血清中過表達的miR-26a可能通過下調靶基因PTEN，上調PI3K/AKT信號通路，參與SLE的發(fā)生、發(fā)展。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；循環(huán)型microRNA-26a；PTEN；PI3K/AKT

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多個器官、系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，目前認為SLE與環(huán)境、遺傳背景、感染、雌激素等觸發(fā)的自身免疫反應有關[1-3]。MicroRNAs是一種由20～22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3’-UTR結合，調控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA與SLE的發(fā)病機制密切相關[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)型 microRNA-26a（miR-26a）與多種自身免疫疾病密切相關[6-8]，但對循環(huán)型miR-26a在SLE中的表達及作用機制研究較少。抑癌基因PTEN是雙特異蛋白磷酸酶家族成員，近年來大量研究證實PTEN的缺失、突變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起決定性作用[9]。有研究表明，PTEN的激活或缺失與多種自身免疫疾病的發(fā)生有關[10]。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 SLE 患者血清miR-26a和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中 PTEN 的表達，分析兩者與臨床資料的相關性，并利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證PTEN是miR-26a的靶基因。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年6月-2015年6月南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院收治的36例SLE患者的血清，所有患者符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類標準。36例SLE患者平均年齡（35.2±6.47）歲，其中，男性2例，女性34例。采用狼瘡活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity Index，SLEDAI）評分標準評估疾病活動度，平均（12±4）分。選取同期10例健康體檢者作為對照組，其中男性2例，女性8例；平均年齡（38.4±6.81）歲，兩組年齡（t=1.369，P=0.1781）、性別（χ2=2.057，P=0.1515）比較差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 主要材料、試劑與儀器

細胞小鼠原B細胞株BaF3，購自上海賽百慷生物技術公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司，Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），雙熒光素酶檢測試劑盒（美國GeneCopoeia公司），RNeasy Micro Kit微量RNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司），兔抗鼠PTEN抗體、兔抗鼠PI3K抗體購自美國Santa Cruz公司，pMD18-T載體（日本TaKaRa公司），miR-26a、PTEN、PI3K、β-actin 引物序列由上海吉瑪公司合成（見表1）。

表1 PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測血清miR-26a mRNA的表達 收集EDTA抗凝的外周血2 ml，4℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按照RNeasy Micro Kit微量RNA提取試劑盒說明書提取血清RNA。取5 μl血清總RNA，以miR-26a引物為模板，應用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，反應條件：42℃預變性10 min，95℃變性5 min，以cDNA為模板，進行qRTPCR；以cel-miR-39為內參照進行擴增，反應條件：95℃預變性 10 min，95℃變性 15 s，55℃退火 30 s，72℃繼續(xù)延伸30 s，共40個循環(huán)。通過qRT-PCR儀ABI Step One Plus檢測，實驗重復3次，根據公式Folds=2-△△Ct計算各檢測miR-26a的相對表達量，△△Ct=（CtmiR-26a-Ctcel-miR-39）實驗組-（CtmiR-26a-Ctcel-miR-39）對照組。

1.3.2 qRT-PCR檢測PBMC中PTEN mRNA的表達 取EDTA抗凝的外周血5 ml，室溫條件下1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入2倍體積的PBS緩沖液，將混合液緩慢加入到含3 ml淋巴分離液的EP管中，室溫2 500 r/min離心20 min，棄上清液，3 ml PBS緩沖液洗滌沉淀，再次室溫2 500 r/min離心20 min，棄上清液。使用RNA fast 2000總RNA極速抽提試劑盒提取PBMC總RNA，取5 μl總RNA，應用逆轉錄試劑盒將PTEN mRNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內參照進行擴增，通過qRT-PCR儀軟件程序分析檢測數據結果，實驗重復3次。

1.3.3 miR-26a轉染與雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測將BaF3細胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清中，37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)，將細胞分為轉染組（miR-26a mimics）、陰性對照組（Mimics control）和只加轉染試劑的空白對照組。將BaF3細胞接種于6孔板內，待細胞密度約為50%時，取miR-26a mimics和 Mimics control各100 pmol，分別與Lipofectamine 5 μl充分混勻，室溫孵育 30 min，將轉染混合物加入6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，提取細胞內總RNA，以β-actin為內參照，qRT-PCR檢測細胞內miR-26a、PTEN及PI3K mRNA的表達。①Western blot檢測：取轉染48 h后的3組細胞，RIPA裂解細胞，提取細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離、轉膜后，加入兔抗鼠PTEN抗體（1∶300）、兔抗鼠PI3K抗體（1∶400），4℃過夜，加HRP標記的羊抗兔IgG（1∶4000），顯色劑顯色，應用Gene Tools軟件分析PTEN、PI3K蛋白的表達；②雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測：設計PTEN基因雙向引物序列，并在兩端加上XbaⅠ和NotⅠ酶切位點，正向引物：5'-TCTA GACAGTGCTAAAATTC-3'，反向引物：5'-GCGGCCG CTATATATCAATG-3'；擴增PTEN基因的 3'-UTR，對pMD18-T載體和擴增序列進行XbaⅠ和NotⅠ雙酶切，T4 DNA連接酶切后的pMD18-T和PTEN DNA片段，轉化并提取質粒，取質粒150 ng與miR-26a mimics、Mimics control各3 pmol混合后加入25 μl opti-MEM培養(yǎng)基中，將混合物與含1 μl Lipofectamine的25 μl opti-MEM充分混勻，室溫孵育30 min，加入含BaF3細胞的6孔板內，培養(yǎng)箱中孵育24 h，按照美國Gene Copoeia公司雙熒光素酶檢測方法進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較用兩獨立樣本t檢驗，3組間比較用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎上，兩兩比較用SNK-q檢驗，相關分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者血清 miR-26a、PBMC中 PTEN mRNA的表達

36例SLE患者血清miR-26a mRNA的相對表達量為（2.69±0.47），對照組為（1.34±0.29），經 t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.598，P=0.000），SLE 患者血清miR-26a mRNA的相對表達量高于對照組。SLE患者PBMC中PTEN mRNA的相對表達量為（0.75±0.14），對照組為（1.82±0.39），經 t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.85，P=0.000），SLE患者PBMC中PTEN mRNA的相對表達量低于對照組。見圖1。

圖1 SLE患者和健康人群血清miR-26a、PBMC中PTEN mRNA的表達 （±s）

2.2 SLE患者miR-26a、PTEN表達與臨床資料的關系

分析SLE患者miR-26a、PTEN的表達與年齡、性別、病情進展、臟器受累等指標的關系。結果顯示，女性、SLEDAI評分高、臟器受累SLE患者的血清miR-26a的表達水平高于男性、SLEDAI評分低、無臟器受累患者。SLEDAI評分高、臟器受累SLE患者PBMC中PTEN的表達水平低于SLEDAI評分低、無臟器受累SLE患者（見表2）。Spearman法分析miR-26a、PTEN與SLE臨床檢測指標C3、抗ds-DNA、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、SLEDAI的相關性，結果顯示，miR-26a與C3、抗ds-DNA、ESR、SLEDAI呈正相關（r=0.735、0.504、0.562和 0.662，P=0.000、0.002、0.000 和 0.000）（見圖 2）。PTEN與C3、抗ds-DNA、ESR、SLEDAI呈負相關（r=-0.585，-0.469，-0.588 和 -0.521，P=0.000、0.004、0.000和0.001）（見圖3）。線性回歸分析結果顯示，PTEN 與 miR-26a呈負相關（b=42.271，P=0.001），以PTEN為因變量，miR-26a為自變量，兩者符合Y（PTEN）=-0.448×X（miR-26a）+2.093（t=-6.502，P=0.000）（見圖 4）。

表2 SLE患者臨床資料與miR-26a、PTEN表達的關系

圖2 miR-26a與C3、抗ds-DNA、ESR、SLEDAI的相關性分析

2.3 miR-26a轉染后PTEN、PI3K的表達

miR-26a mimics轉染BaF3后，細胞中miR-26a mRNA表達增加，與陰性對照組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=159.308，P=0.000）；兩兩比較經SNK-q檢驗，轉染組miR-26a mRNA高于陰性對照組和空白對照組（q=19.337和22.076，均P=0.000），表明miR-26a已成功轉染至細胞內。轉染后，PTEN mRNA表達減少，與陰性對照組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=162.311，P=0.000）；兩兩比較經SNK-q檢驗，轉染組PTEN mRNA表達少于陰性對照組和空白對照組（q=36.251和23.753，均P=0.000）。轉染后PI3K mRNA表達增加，與陰性對照組和空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.120，P=0.000）；兩兩比較經 SNK-q 檢驗，轉染組PI3K mRNA表達高于陰性對照組和空白對照組（q=26.854 和 53.900，均 P=0.000）。Western blot檢測轉染后 PTEN 蛋白表達減少（F=8.354，P=0.0036）；兩兩比較經SNK-q檢驗，轉染組PTEN蛋白表達少于陰性對照組和空白對照組（q=31.769和87.954，均P=0.000）。而Western blot檢測轉染后PI3K蛋白表達增加（F=27.904，P=0.000）；兩兩比較經 SNK-q檢驗，轉染組PI3K蛋白表達高于陰性對照組和空白對照組（q=45.856 和 39.251，均 P=0.000）。見圖 5、6。

圖3 PTEN與C3、抗ds-DNA、ESR、SLEDAI的相關性分析

圖4 miR-26a與PTEN的相關性分析

圖5 miR-26a mimics轉染后3組PTEN、PI3K的表達比較 （±s）

圖6 miR-26a mimics轉染后PTEN、PI3K蛋白的變化

2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果

miR-26a mimics轉染BaF3后，熒光素酶活性下降（0.36±0.08），與陰性對照組、空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=59.630，P=0.000）；兩兩比較經SNK-q檢驗，轉染組熒光素酶活性低于陰性對照組和空白對照組（q=45.159和 61.132，均 P=0.000）。表明miR-26a通過靶向PTEN的3’-UTR，負向調控PTEN的表達。見圖7。

圖7 miR-26a mimics轉染后熒光強度的變化 （±s）

3 討論

文獻報道我國SLE患病率約為70～100/10萬人，男、女比例為1∶10[11]。SLE患者體內存在抗DSDNA等多種自身抗體，導致細胞和體液免疫功能紊亂，同時累及腎臟、皮膚、關節(jié)等多個器官和組織損傷。目前尚不清楚SLE具體的發(fā)病機制，免疫細胞、DNA甲基化、組蛋白修飾、環(huán)境等因素被認為是SLE主要病因。近年來，microRNA的生物學功能研究引起廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與腫瘤、自身免疫疾病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[12-14]。國內學者發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-125a、miR-146a，以及循環(huán)型 miR-189、miR-31等參與SLE發(fā)生、發(fā)展[15]。血清、血漿、尿液等體液中存在一類耐RNA酶的細胞外游離型microRNA，稱循環(huán)型microRNA，疾病特異性的循環(huán)型miRNA表達譜對疾病的診斷、預后評估有著非常重要的價值[16]。

miR-26a（NC_005107.4）是 miR-26 家族成員之一，女性表達量高于男性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清miR-26a表達水平高于健康人群，而且女性SLE患者血清miR-26a表達水平高于男性，活動期和病變累及臟器的SLE患者的miR-26a表達水平高于穩(wěn)定期、無臟器受累的SLE患者，表明血清miR-26a上調可能與SLE的發(fā)生、發(fā)展有關。為進一步明確血清miR-26a與SLE疾病活動度的關系，本研究對miR-26a與 C3、抗 ds-DNA、ESR、SLEDAI進行相關性分析，結果顯示miR-26a與C3、抗ds-DNA、ESR、SLEDAI存在相關性，進一步說明血清miR-26a的過表達與SLE的發(fā)展相關。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a在不同疾病的發(fā)病過程中扮演迥異的雙重角色，在“抑制疾病”、“促進疾病”2種角色間的轉換，表明miR-26a可能通過靶向不同的基因從而參與疾病的發(fā)生或轉歸。miR-26a通過靶向 EZH2、CDK6、PLAP-1等基因參與肝癌、NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)病過程，然而，對miR-26a通過何種靶基因參與SLE發(fā)病過程的研究卻鮮有報道。

PTEN基因定位于10q23.3，是雙特異蛋白磷酸酶家族成員之一，PTEN磷酸酶區(qū)域的突變導致多種疾病的發(fā)生。microRNA、乙?；⒎核鼗日{控PTEN的表達。通過TARGETSCAN、MIRANDA等microRNA數據庫預測PTEN可能是miR-26a的靶基因，本研究通過miR-26a mimics、雙熒光素酶報告系統(tǒng)加以驗證，結果顯示，miR-26a mimics轉染BaF3后，PTEN mRNA和蛋白表達降低，熒光素酶活性下降，表明miR-26a通過與PTEN的3’-UTR序列結合，在轉錄后水平負向調控PTEN的表達。通過線性回歸分析PTEN、miR-26a的相關性，結果顯示，PTEN與miR-26a呈負相關，進一步證實PTEN是miR-26a的靶基因，而SLE患者PBMC中PTEN的表達水平低于健康人群的原因，可能與血清miR-26a在兩組人群的表達差異有關。PTEN是天然的PI3K/Akt信號通路負向調控因子，PTEN通過磷酸化PIP3，下調PI3K/Akt參與免疫功能的調節(jié)。吳湘妮等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7、miR-21、miR-22 表達增加，導致PTEN表達降低，通過上調PI3K/Akt信號通路導致SLE患者B細胞的高反應性，而且PTEN的下降程度與SLE的活動度、嚴重程度相關。本研究結果也證實該點，SLE患者PBMC中PTEN的表達水平與 C3、抗 ds-DNA、ESR、SLEDAI有關，病變累及臟器的SLE患者PTEN的表達水平低于未累及臟器患者。miR-26a mimics轉染BaF3后，通過與PTEN的3’-UTR序列結合，抑制PTEN的表達，導致PI3K/Akt信號通路失去PTEN這個關鍵的負向調控因子，因此PI3K表達上調，而上調的PI3K通過何種途徑對免疫細胞產生影響，仍有待進一步的研究。

本研究結果顯示，SLE患者血清miR-26a呈高表達狀態(tài)，miR-26a表達水平與SLE的活動度、嚴重程度存有相關性，雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果表明，PTEN是miR-26a的靶基因，miR-26a可能通過與PTEN的3’-UTR序列結合，抑制PTEN的表達，從而上調PI3K/AKT信號通路參與SLE的發(fā)生、發(fā)展。

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Association of circulating miR-26a and its target genePTEN with systemic lupus erythematosus

Dan-yu Cui,Ding-ji Zhu,Hao Ren,Jing-li Lin,Wei-nan Lai,Qin Huang,Jin-jun Zhao,Min Yang
(Department of Rheumatology and Immunology,the Affiliated South Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong 510515,China)

Objective To explore the expressions of circulating miR-26a and its target genePTENin systemic lupus erythematosus (SLE)and their possible roles in the occurrence and development of SLE.Methods The expressions of circulating miR-26a andPTENin peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were detected by qRT-PCR after blood samples were collected from 36 cases of SLE and 10 healthy people.The correlations between miR-26a,PTENand clinical data of SLE were statistically analyzed.Dual luciferase reporter system was used to test whetherPTENwas the target gene of miR-26a.Results The expression of miR-26a mRNA in the serum of the SLE patients was higher than that in the healthy people (P＜0.05),and the expression ofPTENmRNA in the PBMCs of the SLE patients was lower than that in the PBMCs of the healthy people (P＜0.05).The expression levels of miR-26a andPTENin the patients with SLE were correlated with C3,anti-dsDNA,ESR and SLEDAI.After miR-26a was transfected to BaF3 cells,the expression ofPTENwas down-regulated,and the expression of PI3K was up-regulated,and the luciferase activity of the transfected group was decreased (P＜0.05).Conclusions The over-expression of circulating miR-26a may participate in the occurrence and development of SLE through down-regulation of its target genePTENand up-regulation of PI3K/AKT signaling pathway.

systemic lupus erythematosus;circulating miR-26a;PTEN;PI3K/AKT

R593.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.009

1005-8982（2017）26-0045-07

2016-06-02

楊敏，E-mail：minyanggz@yahoo.com；Tel：13802911770

（童穎丹 編輯）