改良枕大池二次注血法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型

單宏寬　劉剛

【摘要】 目的：建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，通過研究其出血后認(rèn)知、行為學(xué)改變，基底動脈變化探討枕大池穿刺二次注入自體動脈血溶血物法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的實際可行性。方法：將72只清潔級雄性SD大鼠（體重300～350 g）隨機分成對照組（n=12只）、實驗組（n=60只）。實驗組又分別劃分為出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d 5個時相組，每個時相組各12只大鼠。造模后，通過水迷宮試驗觀察各時相點大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的認(rèn)知、行為學(xué)改變，評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。結(jié)果：水迷宮結(jié)果顯示實驗組大鼠與正常對照組比較，逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。大體標(biāo)本觀察，對照組腦蛛網(wǎng)膜下腔未見出血，實驗組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血明顯，可見有大量血液或血凝塊彌漫分布于蛛網(wǎng)膜下腔。結(jié)論：枕大池穿刺二次注入自體動脈血溶血物法建立模型操作簡便易行，可重復(fù)性強，大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙改變明顯。大鼠基底動脈痙攣明顯，模型復(fù)制成功。

【關(guān)鍵詞】 蛛網(wǎng)膜下腔出血； 動物模型； 注血法； 水迷宮

The SAH Model by Improved Two Times Injections of Arterial Blood Solvate into Cisterna Magna Directly in Rats/SHAN Hong-kuan，LIU Gang.//Medical Innovation of China，2017，14（22）：016-020

【Abstract】 Objective：To study the practical feasibility of two times injections of arterial blood solvate into cisterna magna directly by establishing SAH model in rats by observating the cognitive and behavioral change after subarachnoid hemorrhage in rats.Method：72 clean-level male SD rats were randomly divided into control group（n=12） and experimental group（n=60）.Experimental group were randomly divided into 12 h，24 h，48 h，

3 d，5 d group，12 rats in each group.After modeling，the cognitive and behavioral changes of subarachnoid hemorrhage in rats at different time points by water maze test were observed，the learning and memory impairment in rats were evaluated.Result：Morris water maze showed that the escape latency was prolonged significantly and the number of cross-platform reduced in each group of SAH compared with those of experimental group，the differences were statistically significant（P<0.05）.In general observation，there was no hemorrhage in the subarachnoid space of the control group.The subarachnoid hemorrhage in the experimental group was obvious，and there was a large amount of blood or blood clot distributed around the subarachnoid space.Conclusion：It is easy to perform and repeat the SAH model in rats established by two times injections of arterial blood solvate into cisterna magna directly， whose clinical symptoms and the dysfunction of learning and memory are changed significantly.The artery cramps obviously，which meant the model is established successfully.

【Key words】 Subarachnoid hemorrhage； Animal mode； Blood injection； Morris water maze

First-authors address：Liaocheng Central Hospital of Shandong Province，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.22.005

蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）是臨床常見的腦血管疾病，死亡率及致殘率高，目前對于該病早期的高死亡率知之甚少，因此動物實驗成為研究的重要方法。建立一種操作簡單、發(fā)病機制相似的動物模型來研究SAH后的病理生理變化，對臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。本研究采用枕大池穿刺二次注入自體動脈血溶血物法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，通過研究其出血后認(rèn)知、行為學(xué)改變，探討模型的可靠性，以期提供簡單、可靠的SAH動物模型制作方法。endprint

1 材料與方法

1.1 材料 72只清潔級雄性SD大鼠（體重300～350 g）隨機分成假手術(shù)組即對照組（n=12只）、實驗組（n=60只）。實驗組又分別劃分為出血后

12 h、24 h、48 h、3 d、5 d 5個時相組，每個時相組各12只大鼠。對各組大鼠采用枕大池穿刺二次注入自體動脈血溶血物法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。對照組、實驗組大鼠分別于注血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d進行水迷宮測試。

1.2 方法 （1）采用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉；暴露、分離左側(cè)股動脈，抽取不抗凝的動脈血0.3 mL，將血液迅速置于-80 ℃冰箱冷凍15 min，然后在恒溫水浴箱中37 ℃復(fù)溶后得到動脈血溶血物。枕部局部消毒，取側(cè)臥位，保持頭部向胸部屈曲，先在正中線枕骨隆凸下緣至第一頸椎上緣間切一小切口，用1 mL注射器自制細穿刺針穿刺，注意針尾略向尾部傾斜，垂直緩慢進針直至有突破感停止，表示針頭已穿透硬膜進入枕大池，待清亮腦脊液緩慢流出。SAH組緩慢注射復(fù)溶的自體股動脈血0.3 mL，時間控制在5 min，拔出穿刺針，大鼠俯臥位，頭低30°放置30 min，縫合股部切口。注血完畢時，可觀察到大鼠的呼吸節(jié)律明顯改變，甚至出現(xiàn)呼吸暫停，個別大鼠出現(xiàn)短暫性后肢抽搐。麻醉醒后正常飼養(yǎng)，24 h后同法抽取右側(cè)股動脈血0.3 mL處理后注入枕大池，制成大鼠SAH動物模型。對照組同樣取血，但不注射，24 h后重復(fù)上述操作。注血后大鼠腹腔注射青霉素鈉10萬U，連續(xù)3 d。（2）Motris水迷宮測試（認(rèn)知、行為學(xué)觀察）：實驗于注血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d時進行。測試前大鼠按試驗分組先進行水迷宮適應(yīng)性學(xué)習(xí)訓(xùn)練，水中加入適量墨汁，水平面高過安全平臺10 mm，水溫保持在22～26 ℃，將安全平臺置于訓(xùn)練時水迷宮象限中的任一象限（N、S、E、W），由攝像機及計算機自動跟蹤拍攝和統(tǒng)計大鼠分別由其他三個象限入水后尋找到安全平臺的軌跡和潛伏期值。如大鼠60 s內(nèi)未找到安全平臺，則潛伏期值記為60 s。術(shù)后48 h水迷宮試驗結(jié)束后每組隨機抽取5只采用過度麻醉斷頭處死，迅速開顱取腦，行大體標(biāo)本觀察。

1.3 觀察指標(biāo) 測試程序主要包括定位航行試驗和平臺搜索試驗，共5 d，每天上、下午各進行4次。將大鼠面向池壁分別從四個象限的入水點放入水中，記錄其在60 s內(nèi)尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如果大鼠60s內(nèi)不能找到平臺，則由實驗者用工具牽引其到平臺上停留，再放回到籠中，此項反應(yīng)為大鼠的學(xué)習(xí)能力。模型建立后的神經(jīng)行為學(xué)評估：分別于術(shù)前、術(shù)后24 h、48 h對大鼠進行評分。參考Kaoutzanis等[1]神經(jīng)行為學(xué)評分法進行評分，得分范圍為3～11分，3分最差，11分完全正常，并進行行為學(xué)及顱腦解剖觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，對每個時間點上6個分組的重復(fù)測量數(shù)據(jù)進行方差分析和多元方差分析，并進行不同時間點和不同組間的兩兩比較，計量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分情況 根據(jù)表1評分超過9分的大鼠排除實驗，評分符合者進入下一步驟。術(shù)后死亡作為缺失值，亦予以排除。排除者均在后續(xù)實驗中隨機補足，保證分組且每組數(shù)量恒定。整個實驗過程造模失敗、死亡大鼠17只。

2.2 大鼠逃避潛伏期實驗結(jié)果 水迷宮逃避潛伏期結(jié)果顯示蛛網(wǎng)膜下腔注血后12、24、48 h組大鼠定向航行速度較慢，游泳時間明顯延長，分別為（26.44±1.90）、（57.93±2.28）、（41.94±3.99）s與對照組（5.36±0.65）s比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；3、5 d組有所延長分別為（14.80±3.37）、（7.57±0.45）s，5 d組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.056）。證明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注血后12～48 h學(xué)習(xí)記憶功能障礙明顯，3 d之后逐漸恢復(fù)。

2.3 大鼠平臺搜索試驗結(jié)果 平臺搜索結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔注血后12、24、48 h組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)明顯減少分別為（3.89±0.41）、（1.14±0.66）、（4.96±0.85）次，與對照組（10.68±0.66）次比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；3、5 d組穿越平臺次數(shù)有所增加分別為（8.25±0.86）、（9.96±0.30）次，5 d組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.25），證明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注血后12～48 h學(xué)習(xí)記憶功能障礙明顯，3 d之后有所恢復(fù)。對照組及SAH不同時間組平臺搜索差異見圖1，典型標(biāo)本見圖2～3。

2.4 動物行為及大體標(biāo)本觀察結(jié)果 實驗組大鼠術(shù)后意識恢復(fù)時間為12～16 h，呈頭低位蜷縮狀，活動明顯減少，且毛發(fā)蓬松、攝食減少，未見偏癱或截癱，部分大鼠可見球結(jié)膜下出血。動物體重在第一次手術(shù)后至第二次手術(shù)前平均下降約20 g；神經(jīng)功能障礙隨著時間延續(xù)逐漸減輕，持續(xù)到第3天明顯緩解，第5天除飲食略差外神經(jīng)癥狀基本消失。對照組大鼠術(shù)后恢復(fù)清醒時間為4～6 h，且飲水、攝食及活動較術(shù)前相比均無明顯差異。對照組未見蛛網(wǎng)膜下腔有出血及血凝塊（圖2），所有動物均未見腦實質(zhì)損傷。實驗組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血明顯，可見大量血液或血凝塊彌漫分布于蛛網(wǎng)膜下腔，血凝塊多沉積于視交叉、基底動脈周圍及基底池、側(cè)裂池、縱裂，顳葉底面內(nèi)側(cè)半球表面也可見血液沉積（圖3）。血液及血凝塊的范圍、厚度隨時間延長而減少，一周左右消失。

3 討論

由于蛛網(wǎng)膜下腔出血病情危重、死亡率高，因此建立一種操作簡單、發(fā)病機制相似的動物模型進行研究成為熱點[2]。自從Bagley1928年首次采用狗作為蛛網(wǎng)膜下腔出血模型以來[3-4]，所選動物已囊括大鼠、兔、貓、豬、狗、猴等。選擇大鼠建立蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）模型主要原因如下：（1）大鼠的基因與人類基因同源性高；（2）大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的表現(xiàn)與人類類似；（3）在大鼠模型上可以進行幾乎所有誘發(fā)SAH的試驗；（4）大鼠繁殖能力強、易飼養(yǎng)且價格便宜，來源充足；因此，近年來，人們大量使用大鼠將其自體動脈血直接注入蛛網(wǎng)膜下腔的方法制造SAH模型[5]。endprint

Otsuji等[6]1994年對Endo的模型進行改良，第二次注血時改用氧合血紅蛋白代替全血，發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙更加嚴(yán)重，使SAH的模型更加完善。劉承基等[7-8]亦發(fā)現(xiàn)，SAH后急性腦血管痙攣與動脈破裂后血液成分進入蛛網(wǎng)膜下腔有關(guān)，血液對血管的長時間浸泡導(dǎo)致血管調(diào)節(jié)功能紊亂，血管收縮功能增強，同時舒張功能出現(xiàn)障礙，誘發(fā)血管痙攣。血液進入蛛網(wǎng)膜下腔后紅細胞溶解，釋放氧合血紅蛋白，滅活NO、激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加氧自由基的產(chǎn)生，最終使血管收縮，此為引起腦血管痙攣的早期關(guān)鍵因素。

制作大鼠SAH模型的方法多種多樣，到目前為止有關(guān)大鼠SAH的造模方法主要可歸納為三類：（1）顱內(nèi)動脈刺破法；（2）枕大池注血法；（3）視交叉前池或蛛網(wǎng)膜下腔注血法[9]。第一種方式是刺破頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段某一點，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔，該方法符合蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)病特點，但存在一定缺陷：①細線刺入血管后可能造成暫時性腦缺血，如時間超過30 min，有局部腦組織壞死的可能；②出血量不恒定，影響實驗結(jié)果的觀察；

③操作復(fù)雜，損傷大，死亡率較高，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h約50%的動物死亡；④可引起腦內(nèi)出血，發(fā)生率約占全部實驗動物的11%。近年來，開顱視交叉池注血法建立SAH模型報道較多[10-11]，此方法應(yīng)用腦立體定位儀固定，手術(shù)暴露冠狀縫、矢狀縫及bregma點，在bregma點前7.5 mm稍偏右側(cè)處鉆孔后行視交叉池注血[12]。但此種方法要求儀器輔助，且操作過程復(fù)雜，需要經(jīng)過專門訓(xùn)練才能熟練完成。后兩種造模方式多為手術(shù)開顱將非抗凝自體血經(jīng)額或經(jīng)小腦延髓池或側(cè)腦室插管注入蛛網(wǎng)膜下腔，但采用自體動脈血注入小腦延髓池的方法較多，稱為枕大池注血法。Dudhani等[13]、孫保亮等[14]對單次注血法進行改良，對寰枕區(qū)域進行了更細致的解剖，穿刺注血0.15 mL，停留30 s后拔針，48 h后第二次注血0.15 mL，稱為枕大池二次注血法（double hemorrhage injection），也取得了成功，此方法克服了單次注血后血管痙攣不穩(wěn)定的缺點，成為目前常用的SAH造模方法。

本實驗考慮到SAH大鼠模型要求模型應(yīng)具有發(fā)病機制相似、操作可控性強、所有模型之間差異應(yīng)盡可能小、死亡率不能太高，經(jīng)過認(rèn)真地探索，對動物進行局部解剖測量，找到適合的進針角度及深度，并借鑒其他學(xué)者的成功經(jīng)驗，采用改良枕大池二次注入自體動脈血溶血物法，共制作出72只SAH模型，死亡率為11%，分析死亡原因可能與短時間內(nèi)腦池注血，延髓受壓，未進行復(fù)蘇支持有關(guān)。試驗中采用冷凍后復(fù)溶的血液，原因在于動脈血經(jīng)短暫冷凍復(fù)溶后，血清析出，紅細胞裂解釋放血紅蛋白，更準(zhǔn)確地模擬了臨床中SAH后早期腦損傷的發(fā)病機制。

通常認(rèn)為對造模后大鼠神經(jīng)行為學(xué)的評價可反映模型腦損傷及后期恢復(fù)的程度，并以此判斷造模是否成功[15]。實驗中發(fā)現(xiàn)，SAH后大鼠出現(xiàn)輕微的認(rèn)知功能障礙，第3天左右會在腦干和Willis環(huán)的基底面發(fā)現(xiàn)凝血塊，5～7 d后血凝塊逐漸被吸收，在此期間死亡率約為20%[16]。Morris水迷宮（Morris Water Maze）是目前國內(nèi)外研究中廣泛應(yīng)用的檢測空間學(xué)習(xí)記憶功能最精確、客觀的一種方法。測試大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的方法很多，而Morris水迷宮實驗則最為常用，且可以通過每天變化平臺的位置來增加難度[17]。

本實驗顯示試驗組大鼠每天的隱匿平臺逃避潛伏期均明顯比對照組大鼠長（P<0.01），平臺搜索試驗中每分鐘穿越原平臺位置的次數(shù)明顯比對照組大鼠少（P<0.01），說明缺血再灌注后大鼠空實驗組大鼠與對照組相比在逃避潛伏期、平臺搜索結(jié)果方面結(jié)果均差異顯著，證明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔注血后12～48 h學(xué)習(xí)記憶功能障礙明顯，與臨床SAH患者出現(xiàn)的相關(guān)癥狀類似，證明蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬神經(jīng)元受到損傷，Jeon等[18]猜測這可能與大腦皮層和海馬內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量減少有關(guān)。結(jié)合大體解剖等觀察證明：采用改良枕大池二次注入自體動脈血溶血物法可成功制作蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型。

在此模型制作過程中，個人體會主要有以下幾點：（1）保持相對恒定的實驗環(huán)境溫度：10-11月份，8只大鼠在首次注血后或二次注血后死亡，此時測量動物手術(shù)室的溫度多在17～19 ℃。而分析原因之后，筆者應(yīng)用小動物保溫毯，保持試驗環(huán)境溫度25～29 ℃，死亡率明顯降低。因此，建議操作時實驗室溫度維持在25℃以上。（2）注血量及時間：注血量超過0.3 mL則因顱內(nèi)壓過高導(dǎo)致動物死亡；而注血量在0.2 mL以下（包括0.2 mL）時，顱底血液沉積不足，極少產(chǎn)生腦血管痙攣，不足以造成明確的腦損傷；注血時間要控制在5 min左右，注血過快可導(dǎo)致枕骨大孔疝形成。（3）進針時不能太深，應(yīng)用自制的穿刺針，刺破硬膜時突破感明顯，可更好把握進針深度，損傷腦干的機率大大減少。（4）股動脈取血后，迅速置于-80 ℃深低溫冰箱冷凍10 min，37 ℃復(fù)溶。（5）操作過程中嚴(yán)格無菌操作，預(yù)防顱內(nèi)感染。

綜上所述，采用非開顱枕大池二次注入自體動脈血溶血物法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，操作簡易，可重復(fù)性強，動物行為活動改變、神經(jīng)功能受損明顯，成功模擬臨床上動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理過程。

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（收稿日期：2017-02-13） （本文編輯：周亞杰）endprint