豬瘟診斷技術(shù)

張乾義/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室

豬瘟診斷技術(shù)

張乾義/中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室

一、豬瘟臨床癥狀

1.最急性型豬瘟。突然死亡；突然發(fā)病，表現(xiàn)為全身痙攣、四肢抽搐，皮膚和粘膜發(fā)紺。

2.急性和亞急性型豬瘟。急性發(fā)病期為6～20 d，亞急性為21～30 d；發(fā)病率、死亡率高達(dá)90%；白細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重下降，不及正常豬的1/2；體溫升至41℃～42℃以上；食欲下降或停止；精神極度沉郁、扎堆；病后不久，病豬全身無(wú)力、走路不穩(wěn)，后軀表現(xiàn)明顯。

3.慢性型豬瘟。多發(fā)生于老疫區(qū)或接種豬瘟疫苗但免疫水平不高的豬群；病程通常在一個(gè)月以上；常有嚴(yán)重的繼發(fā)感染；食欲減退；體溫出現(xiàn)周期性發(fā)熱；便秘與腹瀉交替發(fā)生；病豬毛色粗亂，生長(zhǎng)停滯。皮膚呈現(xiàn)紫色出血斑、出疹或壞死；病豬難以完全康復(fù)，常成為僵豬。

4.持續(xù)性感染型豬瘟。不表現(xiàn)臨床癥狀，無(wú)典型豬瘟的臨床癥狀；死亡率低，病程長(zhǎng)，超過(guò)一個(gè)月甚至長(zhǎng)期存在；母豬繁殖障礙，表現(xiàn)為“帶毒母豬綜合征”，產(chǎn)木乃伊胎、死胎、畸形胎，新生仔豬發(fā)顫抖病。

持續(xù)感染型豬瘟危害最大：（1）帶毒導(dǎo)致免疫失敗?！敖】怠钡南忍煨詭Ф咀胸i均不能消除體內(nèi)的病毒，臨床上表現(xiàn)為仔豬發(fā)病、死亡，產(chǎn)生免疫耐受，疫苗之后不產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致免疫失?。唬?）惡性循環(huán)。帶毒仔豬進(jìn)入后備豬群體成為種豬，形成惡性循環(huán)，成為重要的傳染來(lái)源，這是目前對(duì)我國(guó)規(guī)模豬場(chǎng)養(yǎng)豬業(yè)危害最大的感染形式；（3）散毒。帶毒仔豬如果逃避病原監(jiān)測(cè)而進(jìn)入后備豬群體，經(jīng)水平傳播不斷排向外界，引起易感豬感染、發(fā)病和感染，并污染環(huán)境，導(dǎo)致再一個(gè)豬群內(nèi)病毒持續(xù)存在，難以清除。

二、病理剖檢

1.最急性型豬瘟。無(wú)明顯病變，僅見(jiàn)粘膜、腎臟有少量的出血。

2.急性和亞急性型豬瘟。（1）脾臟：脾的邊緣或脾體表面可見(jiàn)從粟粒至黃豆大，數(shù)目不等的紫紅色或紫黑色出血性壞死灶。梗死灶組織堅(jiān)實(shí)、表面稍凸于周?chē)＝M織，切面呈楔形，其檢出率約為占總病例的30%～40%；（2）腎臟：病變明顯，顏色淡有時(shí)呈土黃色，有針尖大至米粒大出血點(diǎn)，量少時(shí)出血點(diǎn)稀疏甚至只有少數(shù)幾個(gè)，量多時(shí)密布整個(gè)腎臟表面，如麻雀蛋外觀；（3）淋巴結(jié)：主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫脹，表面呈深紅色至紫黑色。切面呈紅白相間的大理石狀外觀，在頜下、咽背、耳下、支氣管、胃門(mén)、腎門(mén)、腹股溝及腸系膜等淋巴結(jié)病變最明顯；（4）全身多數(shù)組織和器官：表現(xiàn)出血，喉頭和會(huì)厭軟骨上多數(shù)有小出血點(diǎn)。腸道淋巴濾泡常腫大。膀胱散在點(diǎn)狀出血，胃大彎內(nèi)粘膜常見(jiàn)明顯的充血和出血，表面糜爛、潰瘍。

3.慢性豬瘟。腸粘膜充血、出血；回盲瓣潰瘍，呈紐扣狀。

4.持續(xù)性感染型豬瘟。無(wú)癥狀或癥狀不明顯；仔豬先天性感染CSFV，導(dǎo)致發(fā)生死胎、木乃伊胎、胎兒皮下水腫，腹腔積水以及畸形胎兒，出生后很快死亡的胎兒通常在皮膚和內(nèi)臟器官呈現(xiàn)點(diǎn)狀出血。

三、豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷

（一）動(dòng)物接種

很少使用，幾乎不用，包括兔體交互試驗(yàn)和本動(dòng)物試驗(yàn)。

（二）豬瘟抗原檢測(cè)

包括抗原ELISA、免疫熒光/過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)。

1.ELISA。檢測(cè)物：血液、組織研磨液。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短。缺點(diǎn)：靈敏度低，田間感染很難檢測(cè)。

2.免疫熒光/過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)物：組織切片、抹片。優(yōu)點(diǎn)：特異性高、檢測(cè)時(shí)間短。缺點(diǎn)：對(duì)檢驗(yàn)人員要求高，敏感度低。

（三）病毒分離

病毒分離是實(shí)驗(yàn)室診斷的經(jīng)典方法。

1.檢測(cè)組織類(lèi)型。（1）血液：脫纖血、抗凝血；（2）扁桃體：可活體采樣、豬瘟病毒嗜性組織；（3）淋巴結(jié)：頜下淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，不可活體采樣；（4）脾臟：健康脾臟（應(yīng)為飽滿(mǎn)的紅棕色）；蒼白、柔軟、邊緣梗死-病毒感染。適宜在梗死灶之間進(jìn)行采樣；（5）腎臟：蒼白的紅棕色-健康腎臟；表面有針狀出血點(diǎn)-病毒感染，采樣時(shí)采集皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處；（6）回腸：回腸底部潰爛是急性豬瘟的典型癥狀，但只見(jiàn)于回腸內(nèi)壁；潰爛周?chē)M織是病毒富集區(qū)，適宜進(jìn)行采樣。

2.操作流程。組織處理—接種—結(jié)果判定—鑒定。

3.優(yōu)缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：特異性好，可用于病毒的進(jìn)一步鑒定和毒種保護(hù)。缺點(diǎn)：靈敏度低，檢測(cè)周期長(zhǎng)，易出現(xiàn)假陰性。

（四）病毒核酸檢測(cè)

病毒核酸檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法。

熒光RT-PCR：用于豬瘟病毒野毒、疫苗毒等所有毒株的診斷和監(jiān)測(cè)，適用于豬活體及其臟器、血液、排泄物和細(xì)胞培養(yǎng)物中CSFV核酸的檢測(cè)。注意事項(xiàng)：（1）設(shè)置NTC對(duì)照，包括樣本NTC對(duì)照與體系NTC對(duì)照；（2）實(shí)驗(yàn)分區(qū)（試劑配置區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)）；（3）避免與引物在同靶區(qū)域的開(kāi)蓋PCR方法同時(shí)使用造成污染；（4）檢測(cè)結(jié)束后不要開(kāi)蓋，密封處理；（5）大規(guī)模檢測(cè)時(shí)，建議使用UNG防污染體系。

（五）抗體檢測(cè)—ELISA

1.間接ELISA。優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)針對(duì)某一種蛋白（E2）的總抗體；敏感性高；適合我國(guó)全面免疫的防控策略；有商品化產(chǎn)品（自主研發(fā)）。缺點(diǎn)：與同屬的其他病毒無(wú)法鑒別。

2.阻斷ELISA。優(yōu)點(diǎn)：特異性高，有商品化產(chǎn)品。缺點(diǎn)：敏感性低。

3.競(jìng)爭(zhēng)ELISA。優(yōu)點(diǎn)：特異性高；操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短。缺點(diǎn)：敏感性低，仍處于研發(fā)階段。

（六）抗體檢測(cè)—免疫層析技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快捷；全程只需5min左右，肉眼直接觀察和判斷檢測(cè)結(jié)果；可采用儀器進(jìn)行相對(duì)定量。

缺點(diǎn)：敏感性低；不適合進(jìn)行大批量的檢測(cè)樣品。

（七）抗體檢測(cè)—新型檢測(cè)技術(shù)

1.化學(xué)發(fā)光技術(shù)。

2.熒光微球技術(shù)。

3.鑭系高敏熒光定量免疫層析技術(shù)。