miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響

王芳，余愛華

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢430000)

miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響

王芳，余愛華

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢430000)

目的觀察miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化，及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。方法培養(yǎng)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5及正常葡萄膜黑色素細(xì)胞系UM-U-95。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中的miR-16。將SP6.5細(xì)胞分為miR-16組、對(duì)照組和miR-16抑制劑組。其中miR-16組轉(zhuǎn)染miR-16 mimics，對(duì)照組轉(zhuǎn)染scramble(陰性對(duì)照序列)，miR-16抑制劑組轉(zhuǎn)染miR-16抑制劑。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h采用MTT法測算各組相對(duì)活細(xì)胞百分比；轉(zhuǎn)染72 h后采用克隆形成實(shí)驗(yàn)測算克隆形成率；轉(zhuǎn)染72h后，采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)蛋白。結(jié)果SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中miR-16相對(duì)表達(dá)量分別為0.22±0.02、1.0，SP6.5細(xì)胞中miR-16的相對(duì)表達(dá)量低于UM-U-95細(xì)胞(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后48、72 h miR-16組相對(duì)活細(xì)胞百分比低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組相對(duì)活細(xì)胞百分比高于對(duì)照組(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染72 h后，miR-16組、對(duì)照組、miR-16抑制劑組克隆形成率分別為20.15%±2.53%、42.63%±4.42%、68.36%±6.25%，miR-16組克隆形成率低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組克隆形成率高于對(duì)照組(P均<0.05)。miR-16組、對(duì)照組、miR-16抑制劑組細(xì)胞中FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.02、1.0、5.64±0.58，miR-16組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。miR-16過表達(dá)可抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、降低克隆形成率，抑制miR-16表達(dá)可增強(qiáng)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力。miR-16對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響可能與調(diào)節(jié)FGF2蛋白表達(dá)有關(guān)。

微小RNA16；葡萄膜黑色素瘤；細(xì)胞增殖；成纖維細(xì)胞生長因子2

葡萄膜黑色素瘤是成人常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，起源于葡萄膜黑色素細(xì)胞，發(fā)病率為0.02%～0.06%，易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。據(jù)報(bào)道，葡萄膜黑色素瘤患者5年病死率為17%～50%。腫瘤常發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移則預(yù)后極差，生存期僅2～7個(gè)月，僅13%的患者存活超過1年[2]。深入研究葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制對(duì)提高該病診治水平和新藥研發(fā)具有重要意義。miRNA是一類非編碼長鏈RNA，可在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)靶基因的表達(dá)。miR-16被認(rèn)為是一種抑癌基因[3]，其在多種腫瘤中異常表達(dá)[4,5]，并參與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程。然而miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響尚未見報(bào)道。為此，2014年3月～2017年1月，我們進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5及正常葡萄膜黑色素細(xì)胞系UM-U-95購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。TRIzol購自Invitrogen公司。miR-16 mimics、scramble及抑制劑均由廣州銳博生物科技公司合成。

1.2 SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中miR-16檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，按照TRIzol試劑說明書，從SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中提取總RNA。取5 ng的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。以U6小核RNA作為內(nèi)參。以2-ΔΔCt表示miR-16的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 轉(zhuǎn)染miR-16 mimics、miR-16抑制劑后SP6.5細(xì)胞增殖觀察

1.3.1 細(xì)胞分組與處理 將SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將SP6.5細(xì)胞分為miR-16組、對(duì)照組和miR-16抑制劑組。其中miR-16組轉(zhuǎn)染miR-16 mimics，對(duì)照組轉(zhuǎn)染scramble(陰性序列對(duì)照)，miR-16抑制劑組轉(zhuǎn)染miR-16抑制劑。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 相對(duì)活細(xì)胞百分比測算 采用MTT法。各組SP6.5細(xì)胞以1×104/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后添加5 mg/mL的MTT溶液40 μL，孵育4 h后每孔加入200 μL的DMSO，搖床上充分震蕩。在490 nm波長測定光密度值(OD值)。相對(duì)活細(xì)胞百分比=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.3 細(xì)胞克隆形成率測算 將各組SP6.5細(xì)胞以1×103/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)72 h后去除培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，用甲醇固定細(xì)胞20 min，1%亞甲基藍(lán)染色40 min，去離子水清洗兩遍，晾干。顯微鏡下計(jì)算大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值?？寺⌒纬陕?PE)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.4 細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)蛋白檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染72 h后收集三組細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h；常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入FGF2一抗(1∶200)和GAPDH一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔(1∶1 000)37 ℃ 2 h，PBS漂洗3次；ECL液發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影；用Quantity One 1-D分析軟件分析蛋白印跡條帶的灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 結(jié)果

2.1 SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中miR-16表達(dá)比較 SP6.5細(xì)胞、UM-U-95細(xì)胞中miR-16相對(duì)表達(dá)量分別為0.22±0.02、1.0，SP6.5細(xì)胞中miR-16的相對(duì)表達(dá)量低于UM-U-95細(xì)胞(P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-16 mimics、miR-16抑制劑后SP6.5細(xì)胞增殖變化 轉(zhuǎn)染后48、72 h miR-16組相對(duì)活細(xì)胞百分比低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組相對(duì)活細(xì)胞百分比高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。轉(zhuǎn)染72 h后，miR-16組、對(duì)照組、miR-16抑制劑組克隆形成率分別為20.15%±2.53%、42.63%±4.42%、68.36%±6.25%，miR-16組克隆形成率低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組克隆形成率高于對(duì)照組(P均<0.05)。miR-16組、對(duì)照組、miR-16抑制劑組細(xì)胞中FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.02、1.0、5.64±0.58，miR-16組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。

表1 三組SP6.5細(xì)胞相對(duì)活細(xì)胞百分比的比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

葡萄膜黑色素瘤是成年人常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，起源于葡萄膜黑色素細(xì)胞，好發(fā)于白種人，白種人發(fā)病率為黑種人的8.5倍[6]。按改良Callender分型系統(tǒng)，葡萄膜黑色素瘤病理分型可分為梭形細(xì)胞型、類上皮細(xì)胞型、混合細(xì)胞型和其他類型[2]。葡萄膜黑色素瘤生長方式包括內(nèi)生長、外生長及扁平彌散生長。腫瘤直徑、病理分型都是葡萄膜黑色素瘤患者預(yù)后的重要影響因素[7]。手術(shù)仍是該病的最有效治療方法之一，但患者5年生存率仍不樂觀。據(jù)Foulds等[8]報(bào)道，腫瘤直徑<15.0 mm的葡萄膜黑色素瘤患者5年生存率達(dá)88.4%；而對(duì)于直徑≥16.0 mm者，5年生存率僅為43%。

現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一系列分子或信號(hào)通路功能突變的結(jié)果。miRNA是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。迄今共發(fā)現(xiàn)與人類相關(guān)的miRNA共約1 000多種，可與不同的靶標(biāo)mRNA結(jié)合而調(diào)控約30%的人類基因表達(dá)[9]。miRNA被報(bào)道在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-16位于13q14.3基因[10]，在非小細(xì)胞肺癌[5]、卵巢癌[11]、前列腺癌[12]、大腸癌[13]中表達(dá)下調(diào)。汪旭東等[5]報(bào)道m(xù)iR-16在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中低表達(dá)，過表達(dá)miR-16可抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，誘導(dǎo)G1/S期阻滯。馬群英等[13]發(fā)現(xiàn)miR-16可抑制大腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，下調(diào)CyclinD1和CDK6蛋白表達(dá)。張騰龍等[14]研究表明miR-16在多發(fā)性骨髓瘤中低表達(dá)，其低表達(dá)與患者病程和分期相關(guān)，可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5中的miR-16表達(dá)水平為正常葡萄膜黑色素細(xì)胞UM-U-95的0.22±0.02倍，呈低表達(dá)。miR-16過表達(dá)后，miR-16組相對(duì)活細(xì)胞百分比和克隆形成率低于對(duì)照組；反之，miR-16抑制劑組相對(duì)活細(xì)胞百分比和克隆形成率均高于對(duì)照組。上述結(jié)果提示miR-16在黑色素瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，且miR-16高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖能力，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[5,13，14]。

FGF2是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一，可調(diào)控細(xì)胞生長、分化、血管生成并刺激皮膚傷口愈合。研究表明，F(xiàn)GF2在多種腫瘤中高表達(dá)，包括前列腺癌[15]、結(jié)腸癌[16]、肺癌[17]、膀胱癌[18]、乳腺癌[19]及食管癌[20]等。FGF2過表達(dá)與食管癌術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后差有關(guān)，且FGF2可通過調(diào)控PI3K/AKt信號(hào)通路功能，促進(jìn)食管癌細(xì)胞系ECA109增殖、遷移和侵襲[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-16組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，miR-16抑制劑組FGF2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示miR-16抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的作用機(jī)制可能與下調(diào)FGF2蛋白表達(dá)有關(guān)。

總之，miR-16在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-16過表達(dá)可抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、降低克隆形成率，抑制miR-16表達(dá)可增強(qiáng)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖能力。我們推測miR-16對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響與調(diào)節(jié)FGF2蛋白表達(dá)有關(guān)。上述研究結(jié)果為葡萄膜黑色素瘤的治療提供了新的研究方向。miR-16有可能成為葡萄膜黑色素瘤治療的新靶點(diǎn)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.011

R739.7

A

1002-266X(2017)39-0039-03

余愛華(E-mail: aihua929819@163.com)

2017-05-27)