山西豬偽狂犬病毒gE基因主要抗原區(qū)的遺傳變異分析

孟 帆，樊振華，吳 忻，姚敬明，王娟萍，米瑞娟，薛翼鵬，趙 岳

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

山西豬偽狂犬病毒gE基因主要抗原區(qū)的遺傳變異分析

孟 帆，樊振華，吳 忻，姚敬明，王娟萍，米瑞娟，薛翼鵬，趙 岳

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

根據(jù)GenBank中收錄的PRV Becker株的gE基因序列，設(shè)計(jì)了合成1對(duì)引物，對(duì)山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE部分基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行克隆與序列分析。經(jīng)測(cè)序，山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE部分基因核苷酸序列長(zhǎng)度為997 bp，編碼322個(gè)氨基酸。測(cè)序后對(duì)山西流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列與18株P(guān)RV參考株進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果顯示，山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因核苷酸序列與18株P(guān)RV參考株之間同源性為97.8%～100%，其中與YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（廣東）及 DL14-08株（長(zhǎng)春）同源性最高，均為100%，與75V19株（比利時(shí)）同源性最低，為97.8%。山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與18株P(guān)RV參考株之間同源性為96.1%～100%，其中與YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（廣東）及DL14-08株（長(zhǎng)春）同源性最高，均為100%，與Rice（美國(guó)）同源性最低，為96.1%。山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因序列的遺傳進(jìn)化分析表明，山西PRV流行株屬于2012年以來分離的PRV變異株群，與YY株和HNXX2012株親緣關(guān)系較近，與歐洲和美洲分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

豬偽狂犬病毒；gE基因；抗原區(qū)；遺傳變異

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies v irus，PRV）引起的豬等多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種烈性自然疫源性傳染病，患病動(dòng)物主要表現(xiàn)特征是發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎[1]。感染該病后只有豬可以存活，豬也是PRV唯一的自然宿主和病毒儲(chǔ)藏者[2-3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬瘟病毒（CSFV）和PRV是豬群中3種能引起神經(jīng)癥狀的免疫缺陷性疫病病毒，三者中以PRV單獨(dú)感染情況最為嚴(yán)重[4]。PR作為豬群重要的傳染病之一，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，并對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在美國(guó)和部分歐洲國(guó)家飼養(yǎng)的豬群中，PRV已經(jīng)得到根除，我國(guó)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》中也明確提出，到2020年全國(guó)所有種豬場(chǎng)達(dá)到豬偽狂犬病凈化標(biāo)準(zhǔn)。

一般規(guī)模化豬場(chǎng)控制豬偽狂犬病的主要方法是免疫接種弱毒疫苗或gE基因缺失疫苗[5-6]，從而使該病得到有效控制。但自2012年開始，我國(guó)許多省市一些免疫過gE基因缺失疫苗后仍相繼暴發(fā)疑似豬偽狂犬病的傳染病[7-13]，2013年以來，山西省多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)疫苗免疫后也發(fā)生PR。

本研究于2016年在山西省某發(fā)病豬群中分離到1株P(guān)RV，對(duì)其進(jìn)行了病毒分離鑒定，并對(duì)其gE基因主要抗原區(qū)進(jìn)行了克隆測(cè)序，與Genbank收錄的其他18株P(guān)RV流行株的核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比較，構(gòu)建遺傳發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)而分析山西省目前的PRV分子流行病學(xué)特點(diǎn)，旨在為控制山西省豬偽狂犬病的傳播和選用合適的疫苗提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 PRV陽(yáng)性病料采集

2016年在山西省某疑似豬偽狂犬病發(fā)病豬場(chǎng)，無菌采集疑似豬偽狂犬病剖檢豬的淋巴結(jié)、扁桃體和腦組織等作為檢測(cè)PRV的材料，經(jīng)PCR鑒定為PRV陽(yáng)性，－70℃保存。

1.2 主要材料

豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。DL2000 DNA Marker，TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0和TaKaRa LA PCRTMKit Ver.2.1試劑盒均由TaKaRa公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PRV病毒的分離與鑒定 參照文獻(xiàn)[14]的方法分離培養(yǎng)病毒。收獲的細(xì)胞毒按豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)，共分離出1株P(guān)RV，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中收錄的PRV Becker株的基因序列，應(yīng)用Primer Permier 5.0軟件，設(shè)計(jì)合成1對(duì)用于擴(kuò)增gE基因部分序列的特異性引物，上游引物PRVF:5′-CTTTCCGCCGAG ACGACCC-3′；下游引物 PRVR：5′-TCATCACGAG CACGTACAG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1000bp。引物由北京華大基因公司合成，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PRV病毒基因組的提取 參照文獻(xiàn)[14]的方法提取PRV病毒基因組DNA，用適量的DEPC水溶解，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PRV gE基因的PCR擴(kuò)增 把提取的病毒DNA作為模板擴(kuò)增gE基因。反應(yīng)體系為50 μL：2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mixture 8 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，上下游引物（20μmol/L）各 1 μL，模板2.5 μL，用 ddH2O補(bǔ)充至 50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入循環(huán)94℃變性45 s，62℃退火45s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。結(jié)束反應(yīng)后，取PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.5 PRV gE基因的克隆及測(cè)序 目的片段經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后，克隆至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α克隆，而后進(jìn)行PCR鑒定，由北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 PRV gE基因序列的比對(duì)分析 將獲得的山西流行株gE基因主要抗原表位區(qū)的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列用DNAStar生物信息學(xué)分析軟件包與已發(fā)表在GenBank中的PRV參考株的gE基因和推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行遺傳變異分析，以查清山西流行株的遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRVgE基因的擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小相同的約為1 000 bp的擴(kuò)增條帶（圖 1）。

2.2 PRVgE基因核苷酸序列分析

經(jīng)測(cè)序，山西PRV流行株（SXPRV）的gE部分基因核苷酸序列長(zhǎng)度為997 bp，編碼322個(gè)氨基酸。對(duì)獲得的山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因序列與GenBank中登錄的YY株（湖南）、75V19株（比利時(shí)）、Rice株（美國(guó)）、SC-1-2015株（四川）、LA株（山東）、DUL34pass株（德國(guó)）、HB-HS株（河北）、CL-15株（阿根廷）、Ea株（湖北）、Min-A株（河南）、Yangsan株（韓國(guó)）、P-Pro株（馬來西亞）、PRV-SH株（上海）、Kanplan株（匈牙利）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（廣東）、FJLY-2P2014株（福建）及 DL14-08株（長(zhǎng)春）18株P(guān)RV參考株的gE基因序列進(jìn)行了核苷酸序列相似性比較。由序列分析可知（圖2），19株P(guān)RV流行株之間的gE基因序列同源性均較高，介于97.3%～100%之間，山西PRV流行株的gE基因序列與18株P(guān)RV參考株之間同源性為97.8%～100%，其中，與YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（廣東）及DL14-08株（長(zhǎng)春）同源性最高，為100%，與75V19株（比利時(shí)）同源性最低，為97.8%。

2.3 PRV分離株gE基因氨基酸序列分析

對(duì)獲得的山西PRV流行株包含主要抗原表位區(qū)的gE基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸與GenBank中登錄的18株P(guān)RV參考株進(jìn)行了氨基酸序列相似性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19株P(guān)RV流行株之間的gE基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸同源性都較高，介于95.2%～100%，山西PRV流行株與18株P(guān)RV參考株之間同源性為96.1%～100%，其中，與YY株（湖南）、SC-1-2015株（四川）、HNXX2012株（湖北）、HN-DZ株（廣東）及DL14-08株（長(zhǎng)春）同源性最高，為100%，與Rice（美國(guó)）同源性最低，為96.1%（圖3）。

2.4 PRVgE基因系統(tǒng)發(fā)生樹分析

在山西PRV分離株和GenBank中登錄的18株P(guān)RV參考株的gE基因核苷酸相似性的基礎(chǔ)上進(jìn)行了遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遺傳進(jìn)化樹分為2個(gè)大的基因群，歐洲和美洲分離株位于一個(gè)大的基因群；亞洲分離株位于另一個(gè)大的基因群。其中，亞洲基因群又分為2個(gè)小支，一支主要是2012年前分離的PRV毒株群，另一支是2012年以來分離的PRV變異株群，山西PRV流行株就屬于變異株群，山西PRV流行株與YY株和HNXX2012株親緣關(guān)系最近，與歐洲和美洲分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

3 討論

豬偽狂犬病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失是巨大的。豬場(chǎng)一旦暴發(fā)豬偽狂犬病，妊娠母豬感染后會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔，特別以產(chǎn)死胎較為嚴(yán)重；新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[15-16]，15日齡內(nèi)死亡率達(dá)100%，仔豬感染后發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、麻痹、共濟(jì)失調(diào)；感染的成年豬多呈隱性，長(zhǎng)期帶毒排毒，是最危險(xiǎn)的傳染源，對(duì)豬場(chǎng)生產(chǎn)的影響非常嚴(yán)重。樊振華等[17]曾于2009—2011年間對(duì)山西省11個(gè)地市的58個(gè)種豬場(chǎng)作了豬偽狂犬病分子流行病學(xué)調(diào)研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)豬群感染豬偽狂犬病病毒比較普遍，而且大部分豬場(chǎng)免疫情況都比較好，但也有一部分豬場(chǎng)對(duì)免疫不重視。對(duì)種豬場(chǎng)來說，豬偽狂犬病危害性非常大，傳染性比較強(qiáng)，今后需要對(duì)該病的防疫免疫工作進(jìn)一步加強(qiáng)。近幾年來，豬偽狂犬病的感染在我國(guó)豬場(chǎng)越來越嚴(yán)重，尤其許多使用豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)，山西省也不例外。因此，有必要對(duì)山西PRV流行株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以研究山西PRV流行株的變異情況，為控制山西省豬偽狂犬病的傳播提供參考。

PRV屬于皰疹病毒科ɑ亞科，基因組為線狀的雙股DNA，全長(zhǎng)約150 kb，GC含量很高，達(dá)73%，可編碼70～100種蛋白質(zhì)。其中，gE糖蛋白基因是病毒的重要毒力基因之一，也是存在于所有PRV野毒株的一個(gè)基因，對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的神經(jīng)向性和病毒從細(xì)胞到細(xì)胞之間的傳播起重要作用，缺失gE基因，病毒的毒力將大幅下降，但對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制與免疫原性沒有影響[18]，因此，應(yīng)廣泛應(yīng)用gE基因缺失疫苗進(jìn)行疫苗接種。對(duì)gE基因進(jìn)行遺傳變異分析將有助于了解PRV流行株變異情況。

為了了解山西PRV流行株的變異情況，本研究對(duì)山西PRV分離株包含主要抗原表位區(qū)的gE部分基因進(jìn)行了遺傳變異分析，通過對(duì)包含主要抗原表位區(qū)的gE基因核苷酸相似性分析發(fā)現(xiàn)，19株P(guān)RV流行株之間的gE基因序列同源性介于97.3%～100%，說明世界各地PRV分離株的基因序列相似性較高；其中，山西PRV流行株的gE基因序列與18株P(guān)RV參考株之間同源性為97.8%～100%，可見，山西PRV流行株與其他PRV流行株的基因序列差異也不大。另外，對(duì)19株P(guān)RV流行株在gE基因核苷酸相似性的基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，山西PRV流行株屬于2012年以來分離的PRV變異株群，說明山西PRV流行株在分子水平上也發(fā)生了變異，病毒毒力也可能隨之發(fā)生了改變，這也可能是部分免疫過gE基因缺失疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生偽狂犬病感染的原因。而且山西PRV流行株與YY株和HNXX2012株親緣關(guān)系最近，與歐洲和美洲分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說明山西PRV流行株可能來源于相近的湖南株及湖北株，這可能與近年來全國(guó)生豬市場(chǎng)環(huán)境好，山西省規(guī)模化養(yǎng)豬持續(xù)發(fā)展，從不同地區(qū)大量引種和跨地區(qū)的生豬流動(dòng)有關(guān)，因此，應(yīng)該加強(qiáng)生豬運(yùn)輸?shù)臋z疫工作。對(duì)包含主要抗原表位區(qū)的gE基因推導(dǎo)的氨基酸相似性分析發(fā)現(xiàn)，19株P(guān)RV流行株之間的gE基因氨基酸序列同源性介于95.2%～100%，其中，山西PRV流行株的gE基因氨基酸序列與18株P(guān)RV參考株之間同源性為96.1%～100%，這些與核苷酸相似性研究結(jié)果是相對(duì)應(yīng)的。本研究從分子水平研究了山西省PRV流行株的遺傳變異情況，以期為山西地區(qū)PRV的防控提供理論依據(jù)。

［1］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］ MULLER T，HAHN E C，TOTTEWITZ F，et al.Pseudorabies virus in wild swine：a global perspective[J].Arch Virol，2011，156（10）：1691-1705.

［3］POMERANZLE，REYNOLDS AE.Molecular biologyof pseudorabies virus：impact on neurovirology and vet erinary medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev，2005，69（3）：462-500.

［4］宋宏曉，李蔥曉，王慧，等.河南省部分地區(qū)豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒核酸檢測(cè)分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（2）：117-121.

［5］METTENLEITER T C.PRV:the virus and molecular pathogenesis[J].Vet Res，2000，31：99-115.

［6］孔德江，何曉玲，易棟，等.規(guī)模化豬場(chǎng)豬偽狂犬病的篩查與防控[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，10（5）：75-77.

［7］彭金美，安同慶，趙鴻遠(yuǎn)，等.豬偽狂犬病新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：1-4.

［8］ CAO S，CHEN H，ZHAO J，et al.Detection of porcine circovirus type 2，porcine parvovirus and porcine pseudorabies virus frompigs with postweaningmultisystemic wastingsyndrome bymultiplexPCR[J].Vet Res Commun，2005，29（3）：263-269.

［9］YE C，ZHANG Q Z，TONG G Z，et al.Genomic characterization of emergent pseudorabies virus in Chinareveals marked sequence divergence：evidence for the existence of two major genotypes[J].Virology，2015，483：32-43.

［10］WANG C H，YUAN J，QIN H Y，et al.A novel gE-deleted pseudorabies virus（ PRV）provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J].Vaccine，2014，32（27）：3379-3385．

［11］GU Z，HOU C，JIANG P，et al.Emergence of highly virulent pseudorabies virus in southern China[J].Can J Vet Res，2015，79（3）：221-228．

［12］占松鶴，殷冬冬，姜安安，等.豬偽狂犬病毒安徽株gE基因的克隆和序列分析 [J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013，21（5）：63-67.

［13］潘霄，劉明陽(yáng)，李學(xué)伍，等.豬偽狂犬病毒的分離與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（7）：134-137.

［14］樊振華，孟帆，吳忻，等.豬偽狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：12-17.

［15］邊傳周，王惠杰，陳創(chuàng).豬偽狂犬病毒河南株的分離與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：69-70.

［16］占松鶴，王非，劉華，等.安徽省北部地區(qū)豬高熱病流行病學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（8）：113-115.

［17］樊振華，姚敬明，孟帆，等.山西部分種豬場(chǎng)豬偽狂犬病分子流行病學(xué)調(diào)研[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：115-116.

［18］敖敬群，婁高明，楊林，等.偽狂犬病病毒閩株gE基因表位抗原編碼區(qū)的克隆與序列測(cè)定 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，33（5）：492-495.

Genetic Variation Analysis ofgEAntigen Epitope of Pseudorabies Virus Isolated from Shanxi Area

MENGFan，F(xiàn)ANZhenhua，WUXin，YAOJingming，WANGJuanping，MI Ruijuan，XUE Yipeng，ZHAOYue
（Institute ofAnimal Husbandryand Veterinary，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

Using a pair of primers designed according to the gE nucleotide sequence of PRV Becker strain from GenBank,the part of gE gene of Shanxi PRV strain containing the main antigenic regions encoding were amplified by PCR,and then PCR product was cloned and sequenced,a fragment of 997 bp carried out could encode 322 amino acids.The part of gE gene nucleotide sequence of Shanxi PRV strain containing the main antigenic regions encoding and amino acid sequence deduced were used to analysis the genetic variation with 18 PRV strains.The results showed that the homologies ofnucleotide sequences ofShanxi PRV strain to the 18 PRV strain were 97.8%-100%,the highest homologywas 100%between Shanxi PRVstrains and YY strains（Hunan）,SC-1-2015 strain（Sichuan）,HNXX2012 strain（Hubei）,HN-DZ strain（Guangdong）and DL14-08 strain（Changchun）,the lowest homology was 97.8%between Shanxi PRV strain and 75V19 strain（Belgium）.The homologies of amino acid sequences of Shanxi PRV strains to the 18 PRV strain were 96.1%-100%,the highest homology was 100%between Shanxi PRV strain and YY strains（Hunan）,SC-1-2015 strain（Sichuan）,HNXX2012 strain（Hubei）,HN-DZ strain（Guangdong）and DL14-08 strain（Changchun）,the lowest homology was 96.1%between Shanxi PRV strain and Rice（America）.The genetic evolution analysis showed that Shanxi PRV strain belonged to the PRV mutation group isolated after 2012,it had the closer relationship with YY strains and HNXX2012 strains,and the farther relationship with the European strains and the American strains.

pseudorabies virus;gE gene;antigen epitope;genetic variation

S858.28

A

1002-2481（2017）11-1844-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.27

2017-06-26

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201603D221023-1）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所所級(jí)項(xiàng)目（XMS201503）

孟 帆（1980-），女，山西太原人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷技術(shù)的研究工作。樊振華為通信作者。