混合菌種發(fā)酵牛骨粉制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽

劉麗莉，梁嚴(yán)予，尹光俊，李　丹，楊陳柳

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

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混合菌種發(fā)酵牛骨粉制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽

劉麗莉，梁嚴(yán)予，尹光俊，李丹，楊陳柳

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

利用蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)MBL 13-U、植物乳桿菌(Lp)和嗜熱鏈球菌(St)混合發(fā)酵牛骨粉，制備牛骨血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽。通過正交試驗(yàn)，以膠原多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定最佳菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為2.5%，骨粉添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為3.5%。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以ACE抑制率為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵工藝條件：接種量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為4%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為42 h，發(fā)酵液初始pH值為7.0。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳發(fā)酵條件下，多肽液的ACE抑制率最高為(51.73±0.65)%。針對(duì)牛骨ACE抑制肽的特性，得到混合菌種發(fā)酵牛骨粉的最佳工藝參數(shù)。

混合菌種；發(fā)酵；牛骨ACE；膠原多肽

0　引言

近年來，中國已成為世界上高血壓致死率最高的國家，平均每年有400萬的新增高血壓病患者，并向青年化發(fā)展[1-2]，但目前市售的降血壓藥物效果均不理想或副作用較大。研究表明：降血壓肽具有降血壓、免疫促進(jìn)和抗凝血等功能[3]，因此，對(duì)天然、高效、預(yù)防和治療高血壓的食源性膠原多肽產(chǎn)品的開發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)[4]。文獻(xiàn)[5]綜合比較了多種不同發(fā)酵食品的降血壓活性，發(fā)現(xiàn)大豆和干酪等食品經(jīng)發(fā)酵后含有較高活性的降血壓肽。文獻(xiàn)[6]通過酶解雞腿骨蛋白制備了降血壓肽，并測(cè)定了酶解過程中的pH值、肽質(zhì)量濃度和水解度。文獻(xiàn)[7]依次采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)豬股骨膠原蛋白進(jìn)行酶解，以制備降血壓肽。牛骨雖然是膠原蛋白的優(yōu)良資源，但因得不到合理利用大部分被丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，充分利用牛骨資源，將膠原蛋白經(jīng)酶降解為相對(duì)分子質(zhì)量較低的牛骨降血壓肽，具有重大的經(jīng)濟(jì)及現(xiàn)實(shí)意義。

目前，對(duì)膠原多肽的制備常采用酶解法[8]，此方法條件溫和、操作安全、過程易控制，但缺點(diǎn)是具有一定的不定向性、產(chǎn)品純度不高、酶制劑的成本較高及易產(chǎn)生苦味肽等。文獻(xiàn)[9-10]發(fā)現(xiàn)微生物復(fù)雜的生理生化機(jī)制在降解蛋白的同時(shí)，還能使過程中產(chǎn)生的苦味肽物質(zhì)得到轉(zhuǎn)化從而達(dá)到脫苦的目的，但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)采用單一菌種純種發(fā)酵有很大的局限性，發(fā)酵液中蛋白酶活力低，從而使產(chǎn)品中多肽質(zhì)量濃度較低。因此，本文采用產(chǎn)膠原蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，B.cereus)MBL 13-U菌株結(jié)合植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,St)混合發(fā)酵牛骨粉制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵液初始pH值等為單因素，以膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率為指標(biāo)，對(duì)混合菌種發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到混合菌種發(fā)酵牛骨粉的最佳工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

新鮮牛腿骨，購于洛陽市老城區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場；蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)MBL 13-U由本課題組篩選誘變所得；嗜熱鏈球菌(St)和植物乳桿菌(Lp)，購于上海紀(jì)寧試劑有限公司。蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸鈉、骨明膠、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂和瓊脂粉等購于天津德恩有限公司，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

MXX1400-40型萬用電爐，濟(jì)南鑫貝西生物有限公司生產(chǎn)；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)；DHG-9013A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3主要培養(yǎng)基

B.cereusMBL 13-U種子培養(yǎng)基(100 mL)：含蔗糖1.00 g，骨明膠2.00 g，磷酸氫鈉 0.05 g，磷酸氫鉀 0.25 g，氯化鈣0.05 g。pH值7.0～7.2。

Lp種子培養(yǎng)基(100 mL)：含蛋白胨1.00 g，牛肉膏1.00 g，酵母膏0.50 g，葡萄糖0.50 g，磷酸氫鉀 0.20 g，硫酸鎂 0.05 g，吐溫80 0.10 g，硫酸錳 0.025 g。pH值6.5。

St種子培養(yǎng)基(100 mL)：含胰蛋白胨2.00 g，蔗糖0.50 g，酵母提取物0.50 g，骨明膠0.25 g，乙酸鈉 0.15 g，葡萄糖0.50 g，抗壞血酸0.05 g，乳糖0.50 g，瓊脂1.50 g。pH值6.8。

2　試驗(yàn)與測(cè)定方法

2.1試驗(yàn)步驟

試驗(yàn)步驟為：牛腿骨→預(yù)處理→牛骨粉(100目過篩)→發(fā)酵液→滅菌→接種→發(fā)酵→滅菌→離心取上清液→超濾分離純化→真空冷凍干燥→牛骨ACE抑制肽[11]。

表1　單因素試驗(yàn)因素與水平表

采用固定的發(fā)酵培養(yǎng)條件：菌種體積比V(B.cereusMBL13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為1.5%，牛骨粉添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為3%，接種量為3%，在37 ℃、pH 7.0、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。以菌種體積比V(B.cereusMBL13-U)∶

V(Lp)∶V(St)分別為1∶0∶0、1∶1∶0、1∶0∶1、

1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1，蔗糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，骨粉添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%為單因素，發(fā)酵液中膠原多肽含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過三因素三水平正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合。單因素試驗(yàn)因素與水平表見表1。

為提高發(fā)酵效率，在優(yōu)化最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵液初始pH值4個(gè)因子為變量，以ACE抑制率為指標(biāo)，利用中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)對(duì)影響發(fā)酵的因素條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2測(cè)定方法

發(fā)酵液中膠原多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定采用雙縮脲法：配制不同濃度梯度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取 6.0 mL 分別與4.0 mL的雙縮脲試劑充分混勻，靜置30 min后在λ=540 nm處測(cè)定吸光度(optical density，OD)值，繪制多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。加5 mL三氯乙酸溶液至5 mL牛骨粉發(fā)酵液中，混合均勻后靜置10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入4 mL雙縮脲試劑，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min。取上清液在540 nm處測(cè)其OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品的多肽質(zhì)量濃度。

ACE抑制率的測(cè)定采用紫外比色法：取50 μL、5.0 mmol/L 馬尿酰組胺酰亮氨酸與10 μL發(fā)酵上清液混勻，37 ℃水浴預(yù)熱5 min，加入10 μL、0.1 U/mL ACE，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，加入75 μL、1.0 mol/L 鹽酸終止反應(yīng)。加入0.6 mL乙酸乙酯充分混勻后，4 000 r/min離心10 min。取1 mL乙酸乙酯置于試管中放入烘箱，110 ℃揮發(fā)60 min后用4 mL蒸餾水溶解，充分混合30 s，在波長228 nm處測(cè)定其OD值。 ACE抑制率(%)=(B-A)×100/(B-C)，其中：A為加入ACE抑制劑的樣品OD值；B為不加ACE抑制劑的樣品OD值；C為不加ACE的樣品OD值。

采用Origin 8.5和Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并作響應(yīng)面及等高線圖。

2.3牛骨ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)分析

取少量牛骨ACE抑制肽樣品均勻涂抹于掃描電鏡(scanning electron microscop,SEM)樣盤雙面膠上，進(jìn)行噴金鍍膜處理后置于掃描電鏡抽真空，調(diào)整電壓，放大不同倍數(shù)獲取清晰掃描圖像。

室溫條件下，取0.50 g分離干燥的牛骨ACE抑制肽溶于30 mL去離子水，將其置于紫外-可見光掃描儀上200～450 nm進(jìn)行掃描[12]。

3　結(jié)果與分析

3.1正交試驗(yàn)確定培養(yǎng)基最佳比例

3.1.1單因素試驗(yàn)

當(dāng)混合菌種體積比V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1時(shí)，測(cè)得的發(fā)酵液中膠原多肽質(zhì)量濃度最大為3.67 mg/mL；當(dāng)蔗糖添加量為2.5%時(shí)，發(fā)酵液中的膠原多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值2.81 mg/mL；當(dāng)骨粉添加量為3.0%時(shí)，膠原多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值3.38 mg/mL。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對(duì)菌種體積配比(A)、蔗糖添加量(B)和骨粉添加量(C)3個(gè)因素，以膠原多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

3.1.2正交試驗(yàn)

因素主次為A>B>C，即對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度影響最大的因素是混合菌種的體積配比，其次是蔗糖添加量，最后是骨粉添加量，且綜合評(píng)價(jià)最佳組合為A2B2C2。從而確定最佳菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量為2.5%，骨粉添加量為3.5%。

3.2接種量對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

混合菌種接種量對(duì)發(fā)酵過程中膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響如圖1所示。由圖1可知：隨著接種量的增加，在接種量為4%時(shí)，膠原多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值3.62 mg/mL；超過4%時(shí)，膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率均顯著降低，這可能是由于隨著活菌數(shù)的逐漸增多，水解黏度增大，水解速度降低，對(duì)水解反應(yīng)有抑制作用，且菌種增多的同時(shí)需要大量氮源，導(dǎo)致多肽被菌體利用而減少。因此，選擇混合菌種的最佳接種量為4%。

3.3發(fā)酵溫度對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過程中膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，膠原多肽質(zhì)量濃度在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值3.36 mg/mL，ACE抑制率在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值34.12%，這與溫度對(duì)于菌體生長以及酶活力的影響有關(guān)。且40 ℃以上，膠原多肽質(zhì)量濃度的減少幅度明顯增大，說明發(fā)酵溫度對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度影響較大。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖1　接種量對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

圖2　發(fā)酵溫度對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

3.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過程中膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響如圖3所示。由圖3可知：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，ACE抑制率增加，在42 h時(shí)達(dá)最大值33.69%，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。膠原多肽質(zhì)量濃度也隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到最大值，這可能是由于過長的發(fā)酵時(shí)間破壞了牛骨粉中的營養(yǎng)成分，從而抑制了酶系統(tǒng)的水解作用，導(dǎo)致ACE抑制肽的減少。綜合考慮膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為42 h。

3.5發(fā)酵液初始pH值對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

發(fā)酵液初始pH值對(duì)發(fā)酵過程中膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響如圖4所示。由圖4可知：當(dāng)發(fā)酵液初始pH值升高，膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵液初始pH值為6.5時(shí)，膠原多肽質(zhì)量濃度達(dá)到最大值3.60 mg/mL；初始pH值升到7.0時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大值37.36%。綜合考慮，選擇最佳發(fā)酵液初始pH值為6.5。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

圖4　發(fā)酵液初始pH值對(duì)膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率的影響

3.6中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響牛骨粉發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以菌種接種量(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)和發(fā)酵液初始pH值(X4)4個(gè)因子為變量，以ACE抑制率為指標(biāo)，進(jìn)行CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)。再利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到二次項(xiàng)回歸方程為：

0.099 306X2X3-0.725X2X4-1.683 33X3X4。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2　中心組合設(shè)計(jì)回歸模型方差分析

圖5　ACE抑制率響應(yīng)面等高線圖

由圖5及回歸方程得到發(fā)酵工藝最優(yōu)組合為：接種量為4%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為42 h，發(fā)酵液初始pH值為7.0，多肽液的ACE抑制率理論最高值為52.07%。由于該組合不在所列試驗(yàn)中，為了驗(yàn)證回歸模型的有效性，在利用最優(yōu)工藝組合情況下，進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，求得平均值為(51.73±0.65)%，偏差絕對(duì)值小于2%，說明本試驗(yàn)建立的回歸模型能較好地描述因素與指標(biāo)的關(guān)系。

3.7牛骨ACE抑制肽掃描電鏡和紫外掃描結(jié)果

牛骨ACE抑制肽經(jīng)放大25 000倍的掃描電鏡照片如圖6所示，牛骨ACE抑制肽表面出現(xiàn)了明顯的溝壑痕跡，可能是由于牛骨ACE抑制肽的親水區(qū)具有較強(qiáng)的吸濕性，接觸空氣后極易吸水，在掃描過程中的真空環(huán)境下失水所造成的。

牛骨ACE抑制肽的紫外(ultraviolet，UV)掃描結(jié)果如圖7所示。文獻(xiàn)[13]研究表明：在波長200～230 nm，膠原多肽的羰基及肽鍵有特征吸收峰。牛骨ACE抑制肽的UV掃描在波長214～222 nm出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，在280 nm處無吸收峰出現(xiàn)，這是因?yàn)榕９悄z原蛋白水解后得到的ACE抑制肽鏈中含有的CO—NH2、C—O和—COOH都是生色基團(tuán)，能夠在220 nm左右產(chǎn)生光吸收[14]。因此，所制備的ACE抑制肽符合膠原多肽的吸收特性。

圖6　牛骨ACE抑制肽的SEM照片

圖7　牛骨ACE抑制肽紫外掃描圖

4　結(jié)論

(1)分別以蔗糖為碳源、牛骨粉為氮源，以發(fā)酵液中膠原多肽質(zhì)量濃度為指標(biāo)，采用3因素3水平正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為：菌種體積比為V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量為2.5%，骨粉添加量為3.5%。

(2)選擇混合菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵液初始pH值為因素，以膠原多肽質(zhì)量濃度和ACE抑制率為指標(biāo)，確定各因素最佳值：接種量為4%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為42 h，發(fā)酵液初始pH值為6.5。

(3)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇ACE抑制率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面和回歸方程得到最佳發(fā)酵工藝：接種量為3%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間為42 h，發(fā)酵液初始pH值為 7.0，此時(shí)多肽液的ACE抑制率理論最高值為52.07%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得試驗(yàn)值為(51.73±0.65)%，表明試驗(yàn)建立的回歸模型能較好地對(duì)混合菌種發(fā)酵牛骨粉制備ACE抑制肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401622);河南省重點(diǎn)攻關(guān)基金項(xiàng)目(152102110080);河南省教育廳自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(13A550255);河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目(2013ZCX012);國家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)基金項(xiàng)目(201303084)

劉麗莉(1974-),女,河南商丘人，副教授,博士,碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工技術(shù).

2016-05-26

1672-6871(2017)01-0067-06

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.014

TS253.1

A