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    響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取長紅棗多糖及其抗氧化活性

    2017-11-14 12:29:52李福帥李國峰王麒雄王占一
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2017年19期
    關(guān)鍵詞:試液紅棗清除率

    李福帥,李國峰,張 璐,王麒雄, 戴 博,王占一

    (1. 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160;2. 空軍總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100142)

    響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取長紅棗多糖及其抗氧化活性

    李福帥1,李國峰1,張 璐1,王麒雄1, 戴 博2,*王占一1

    (1. 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東棗莊 277160;2. 空軍總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100142)

    以魯南地區(qū)長紅棗為原料,長紅棗多糖得率為考查指標(biāo),在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗,得出長紅棗多糖最佳的提取工藝條件為料液比1∶16(g∶mL),超聲溫度50 ℃,超聲時間30 min;在此條件下,長紅棗多糖得率達(dá)15.12%。采用·O2-,·OH和NO2-的清除試驗,研究了長紅棗多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明,當(dāng)長紅棗多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,對·OH和·O2-清除率分別達(dá)到53%和56%;在pH值2~3的酸性條件下,對NO2-清除率達(dá)40%以上。

    長紅棗;多糖;超聲波輔助提??;響應(yīng)面優(yōu)化;抗氧化活性

    (1. College of Life Science, Zaozhuang University, Zaozhuang, Shandong 277160, China;2. Department of Medicine Air Force General Hospital, Beijing 100142, China)

    棗(ZiziphusjujubeMill.)是鼠李科(Rhamnaceae)棗屬植物棗樹的果實,在我國有悠久的栽種歷史,被民間列入“五果”已久。而長紅棗作為魯南地方名產(chǎn)果品,因肉多核小、營養(yǎng)豐富、含糖量高,有著較高的滋補和藥用價值,被譽為“天然維生素丸”。長紅棗富含多糖、黃酮類化合物、香豆素等多種成分,其中尤以多糖活性最佳。長紅棗多糖兼具治療肺熱咳嗽、化痰和影響淋巴細(xì)胞分裂過程等作用,在改善免疫力和抗衰老等方面具有潛在價值[1-2]。同時,長紅棗多糖可以清除體外多種功能因子[3]。依據(jù)黃杰等人[4-5]試驗表明,超聲空化效應(yīng)可縮短提取時間,但沒有探究長紅棗多糖提取的最佳優(yōu)化工藝。試驗以魯南長紅棗為原料,采用超聲空化原理輔助提取長紅棗多糖,并通過體外抗氧化試驗測定其抗氧化能力,為魯南地區(qū)長紅棗資源進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    長紅棗,采自魯南地區(qū)長紅棗培育園區(qū);對氨基苯磺酸,無極宏通化工有限責(zé)任公司提供;鹽酸萘乙二胺,長沙市裕豐化玻器械有限公司提供;葡萄糖、三氯乙酸、鄰苯三酚、濃硫酸等,均為國產(chǎn)AR級。

    SB25-12DTN型超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏試驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;XFB-200型小型多功能粉碎機(jī),永康市小寶電器有限公司產(chǎn)品;U-3900型紫外-可見分光光度計,日本日立公司產(chǎn)品;JA5003B型電子分析天平,上海精科儀器有限公司產(chǎn)品;RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;PHS-2F型pH計,上海儀電科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

    (1) 長紅棗總糖測定依據(jù)苯酚-硫酸法[6]。精密稱量50 mg烘干至恒質(zhì)量葡萄糖,取水補至50 mL,量取10 mL移至100 mL容量瓶,定容即得0.1 mg/mL葡萄糖溶液,分別吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 mL至試管,純水補至1.0 mL,加6%苯酚(由80%苯酚現(xiàn)配) 1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,于40 ℃條件下水浴30 min,放冷10 min后于波長490 nm處測量吸光度。

    苯酚-硫酸法得標(biāo)準(zhǔn)試液質(zhì)量濃度X(mg/mL)與吸光度Y回歸方程為:Y=71.08X+0.008 6,R2=0.999 3, 總糖質(zhì)量濃度范圍為0~10 μg/mg。

    (2) 長紅棗還原糖測定依據(jù)3,5 -二硝基水楊酸(DNS) 法[7]。配制0.5 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取0, 0.3,0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8,0.9 mL至試管,純水補至1.0 mL,添加2.0 mL DNS顯色劑,開水中水浴5 min后,冷水沖至室溫,純水補至10.0 mL,于波長540 nm處測量吸光度。

    DNS法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程為:Y=16.664X-0.008 7, R2=0.999 5,還原糖質(zhì)量濃度為 0~45 μg/mg。

    1.3.2 長紅棗多糖含量的測定[8]

    將5 g長紅棗粉的提取液抽濾后減壓精煉定容至100 mL,制成供試液。吸取0.4 mL供試液定容在100 mL容量瓶中,以苯酚-硫酸法測得總糖,再吸取0.9 mL供試液補水至25 mL容量瓶,以DNS法測得還原糖,二者相減得多糖含量。公式如(1):

    式中:W——長紅棗多糖得率,%;

    c——測定多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;

    V——供試液的體積,mL;

    n——稀釋倍數(shù);

    m——長紅棗多糖的質(zhì)量,g。

    將凈制的長紅棗于烘箱中,于60 ℃條件下烘至恒質(zhì)量,攤開晾涼,粉碎并過60目篩,長紅棗粉以石油醚為提取溶劑,應(yīng)用索氏提取器回流處理2次(第1次1.0 h,第2次0.5 h),脫脂[9-10],脫脂后的粉末于通風(fēng)處自然陰干。將5 g處理后長紅棗粉置于150 mL錐形瓶中,封口膜密封,皮筋拴緊。調(diào)節(jié)超聲波提取器輸出功率為500 W,在設(shè)定溫度下反應(yīng)至設(shè)定的時刻,取出后抽濾,濃縮并定容。每70 mL粗多糖試液加10 g處理好的吸附樹脂于500 mL燒杯中,用磁力攪拌器攪動0.5 h(120 r/min),靜置1 h,脫色[11],抽濾。處理液采用Sevage輔助酶法脫除雜蛋白[12],重復(fù)脫雜2次,得脫蛋白液[13]。將所得的處理液中添加約3倍體積的無水乙醇,于4 ℃條件下靜置8 h,紗布濾得沉淀,冷凍干燥,得到粗多糖。

    1.5.1 單因素試驗

    稱取粉碎至規(guī)定粒度的長紅棗干粉5 g,分別設(shè)定料液比 1∶8, 1∶12, 1∶16, 1∶20, 1∶24(固定超聲溫度50 ℃,超聲時間30 min),超聲時間20, 25,30,35, 40 min(固定料液比1∶16,超聲溫度50 ℃),超聲溫度30,40,50,60,70 ℃(固定料液比1∶16,超聲時間30 min),測定多糖得率,考查各個因素對于試驗結(jié)果的作用。

    1.5.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    以料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)3個因素作為考查對象,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計模型開展響應(yīng)面分析,獲取最適工藝參數(shù)。

    響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計

    1.6.1 溶液的配制

    以長紅棗粗多糖為樣品,以VC為對照品。配制方法:精確稱取樣品及VC各0.2 g,分別用超純水補至100 mL,即配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的水溶液,然后依次倍數(shù)稀釋共得到6個質(zhì)量濃度的樣品溶液,分別為 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.062 5 mg/mL, 用于后續(xù)的抗氧化試驗。

    1.6.2 長紅棗多糖對O2-自由基清除力的測定

    準(zhǔn)確移取5 mL Tris-HCl緩沖液(pH值8.2) 于10 mL具蓋刻度試管中,滴加對應(yīng)濃度的待測供試液,用超純水補至9.7 mL,于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min,移出后滴加同溫水浴的3 mmol/L鄰苯三酚試液0.3 mL,立刻振勻,移入比色皿中,以10 mmol/L的HCl作對照液,于波長325 nm處以30 s為一區(qū)間測吸光度A,共測5.5 min,制作吸光度A與作用時間t相關(guān)聯(lián)的線性圖。用超純水代替樣品液,所得的關(guān)聯(lián)圖中縱橫坐標(biāo)比值即為鄰苯三酚的自氧化速率V0[14]。

    待測樣品清除·O2-的測定:由上述自氧化速率關(guān)聯(lián)圖,求出縱橫坐標(biāo)比值即為加入樣品后的自氧化速率Vt。以VC作為標(biāo)準(zhǔn)對照,按照公式(2) 計算紅棗多糖對·O2-的清除率[15]。

    式中:Vt——樣品的自氧化速率;

    V0——鄰苯三酚的自氧化速率。

    1.6.3 長紅棗多糖對·OH清除率的測定

    在10 mL具蓋刻度試管中滴加0.75 mmol/L鄰二氮菲試液1 mL,0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH值7.4)和超純水1 mL,振蕩混勻,滴加濃度為0.75 mmol/L的FeSO41 mL,振蕩搖勻后加入3%H2O21 mL啟動反應(yīng),于37 ℃條件下保溫1 h,于波長511 nm處測定吸光度A1。將H2O2置換成樣品溶液1 mL,按前述流程測定A2。另取等同體積樣品液代替超純水,按前述流程測定A3。采用抗壞血酸對位對照,各組試驗平行3次,按照公試(3) 計算結(jié)果并取平均值[16]。

    式中:A1——不加樣品所測吸光度;

    A2——不加H2O2所測吸光度;

    A3——樣品液所測吸光度。

    1.6.4 長紅棗多糖在體外模擬不同pH值胃環(huán)境對NO2-清除率的測定

    (1) NO2-清除率的測定。配置25 μg/mL的多糖樣品液,并依據(jù)李志洲等人的方法測定NaNO2含量。NO2-清除率計算按公式(4)。

    另取pH值2,3,4,5,6,7緩沖液配制的多糖溶液1.0 mL,每管滴加10 μg/mL NO2-對照液2 mL,以適宜pH值(即2,3,4,5,6,7) 的緩沖液補至相同體積(剩余步驟同上),作用10,20,30,40,

    50,60 min后取出,測定對NO2-的清除率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1.1 不同料液比對長紅棗多糖得率的作用

    料液比對長紅棗多糖得率的作用見圖1。

    由圖1可知,長紅棗多糖得率伴隨料液比的減小而呈現(xiàn)出先增長后減少的趨向,在料液比1∶16處有明顯的峰值,即在一定范圍內(nèi)長紅棗得率達(dá)到最大值;當(dāng)料液比大于1∶16時,則長紅棗多糖得率顯著下降。這說明了在料液比達(dá)到1∶16后,再持續(xù)增加溶劑量不會持續(xù)增加多糖得率,相反呈現(xiàn)出多糖得率減少的情況。從試驗工藝和經(jīng)濟(jì)成本考慮,確定料液比為1∶12 ~ 1∶20。

    圖1 料液比對長紅棗多糖得率的作用

    2.1.2 不同超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用

    超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用見圖2。

    圖2 超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用

    由圖2可知,當(dāng)超聲溫度較小時,伴隨超聲溫度的增大,長紅棗多糖得率提高;當(dāng)超聲溫度為50 ℃時,長紅棗多糖得率達(dá)峰值;大于50 ℃后,伴隨超聲溫度的提高,長紅棗多糖得率會下降??赡艿脑蚴情L紅棗多糖在50 ℃時會局部產(chǎn)生糊化,以致長紅棗多糖得率降低。因此,確定超聲溫度為40~60 ℃。

    2.1.3 不同超聲時間對長紅棗多糖得率的作用

    超聲時間對長紅棗多糖得率的作用見圖3。

    圖3 超聲時間對長紅棗多糖得率的作用

    由圖3可知,在20~30 min范圍內(nèi),伴隨超聲時間的增長,長紅棗多糖得率上升;30 min時,達(dá)最高值;30 min過后,長紅棗多糖得率降低。這說明長紅棗多糖得率與超聲時間緊密關(guān)聯(lián),超聲時間少,多糖溶出的不完全;超聲時間過多,可能導(dǎo)致多糖構(gòu)造水解,并浪費能量。因此,確定超聲時間為25~35 min。

    2.2.1 回歸方程的建立及方差分析

    依據(jù)單因素試驗分析結(jié)果,以料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C) 為設(shè)計因素,以長紅棗多糖得率(Y) 為響應(yīng)值,采用Design Expert 8.0.6軟件對三因素三水平的Box-Behnken試驗進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計。

    Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2,BBD設(shè)計方差分析結(jié)果見表3。

    表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

    采用Design Expert V.8.0.6統(tǒng)計分析軟件,對所得數(shù)據(jù)采取回歸分析,對3個因素擬合,得到長紅棗多糖得率(Y) 的回歸方程為:

    對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以看出,整個回歸模型極顯著 (p=0.001 8<0.01), R2=0.938 8; 失擬性檢驗不顯著(p=0.092 0>0.05),說明該模型的擬合性較好,用于長紅棗多糖的提取試驗是可行的。其中,一次項B,二次項及A2,B2,C2對長紅棗多糖得率響應(yīng)值影響均極顯著;一次項C,交互相AC,BC對長紅棗多糖得率響應(yīng)值影響均顯著;各因素對多糖得率影響順序為超聲溫度>超聲時間>料液比。

    表3 BBD設(shè)計方差分析結(jié)果

    2.2.2 響應(yīng)面分析

    響應(yīng)曲面圖和等高線圖是響應(yīng)值對試驗因素A,B,C所組成的三維空間曲面立體圖,從響應(yīng)面圖中可以直觀的看出各個試驗因素及兩兩因素之間的交互作用對響應(yīng)面值的影響。

    各因素交互作用對長紅棗多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線見圖4。

    圖4 各因素交互作用對長紅棗多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線

    由圖4(a) 可知,等高線圖中超聲溫度的等高線比料液比密集,超聲溫度比料液比對長紅棗多糖得率的作用大;從曲面圖可以看出,當(dāng)超聲溫度一定時,伴隨料液比的提高,長紅棗多糖得率呈現(xiàn)先增長后降低的趨向,而且增長趨向平緩,降低的趨向陡峭。這可能由于料液比提高會使料液變稀薄,增大了料液濃度差,從而減小了多糖溶出阻力,利于多糖提取,但過高的料液比使料液過度稀薄,可能引起后續(xù)試驗中多糖的破損。

    由圖4(b) 可知,等高線圖中超聲時間的等高線比料液比密集,超聲時間比料液比對長紅棗多糖得率的影響大。當(dāng)料液比到達(dá)一恒定值時,長紅棗多糖得率也呈先增長后降低的趨向。

    由圖4(c) 可知,等高線圖中超聲溫度的等高線比超聲時間密集,伴隨超聲時間的改變,長紅棗多糖得率先升高后降低。超聲作用時間過長對多糖也有一定的分解作用,即超聲時間越久多糖得率不一定越大。當(dāng)超聲時間一定時,隨著超聲溫度的提高,長紅棗多糖得率也呈先增長后降低的趨向,這是由于升高溫度有促于長紅棗粉溶脹充分,加快了多糖分子傳質(zhì)過程和溶散速度,但溫度偏高可能導(dǎo)致多糖裂解而被破壞。

    2.2.3 多糖提取工藝的驗證結(jié)果

    應(yīng)用Design Expert V.8.0.6統(tǒng)計分析軟件,通過響應(yīng)面試驗預(yù)測最優(yōu)值,得到最佳工藝參數(shù)為料液比1∶17.4(g∶mL),超聲溫度55.6 ℃,超聲時間32.1 min,在此優(yōu)化工藝前提下長紅棗多糖得率為14.32%。因為試驗因素的限制,為了便于可行,將最優(yōu)條件工藝修正為料液比1∶17(g∶mL),超聲溫度56 ℃,超聲時間32 min,采取3次平均試驗測得長紅棗多糖平均得率為14.23%,說明該提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化條件試驗結(jié)果可靠,可重復(fù)性好。

    2.3.1 長紅棗多糖對O2-自由基清除能力的測定結(jié)果

    不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·O2-的清除作用見圖5。

    圖5 不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·O2-的清除作用

    由圖5可知,長紅棗多糖和VC對·O2-均有一定的清除作用,并且清除率隨供試液質(zhì)量濃度的提高逐漸增長。在質(zhì)量濃度為0~0.25 mg/mL時,長紅棗多糖和VC對·O2-清除率隨供試液質(zhì)量濃度的提高上升不太明顯;在質(zhì)量濃度為0.25~4.00 mg/mL時,VC對·O2-的清除率高達(dá)89%,長紅棗多糖對·O2-的清除率僅為56%,說明長紅棗多糖對·O2-有一定的清除作用,但其去除效果比同質(zhì)量濃度的VC低。

    2.3.2 長紅棗多糖對·OH清除能力的測定結(jié)果

    不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·OH的清除作用見圖6。

    圖6 不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·OH的清除作用

    由圖6可知,長紅棗多糖和VC對·OH 均有一定的清除作用,并且清除率隨供試液質(zhì)量濃度的增高而逐漸增長。當(dāng)長紅棗多糖質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時,其抗氧化水平與VC幾乎相近;大于此值后,VC對·OH的清除率明顯高于長紅棗多糖,說明長紅棗多糖對·OH有一定的清除作用,但其清除效果低于同質(zhì)量濃度的VC。

    2.3.3 不同pH值下長紅棗多糖對NO2-清除率的測定結(jié)果

    不同pH值下長紅棗多糖對NO2-的清除作用見圖7。

    圖7 不同pH值下長紅棗多糖對NO2-的清除作用

    由圖7可知,在pH值2~3的環(huán)境下,多糖試液對NO2-的清除率在18 min時達(dá)到最高值(為50%),在40 min后變化程度不是很大,清除率在43%處浮動;在pH值4~5的環(huán)境下,多糖試液對NO2-的清除率在50 min后趨于穩(wěn)定,清除率在36%前后浮動;在pH值7的環(huán)境下,多糖試液對NO2-的清除率在30 min時達(dá)最高值,此后伴隨反應(yīng)時間的進(jìn)行在30%前后浮動。結(jié)果表明,在pH值2~5環(huán)境下,多糖試液對NO2-的清除率高于pH值6~7環(huán)境處。說明在酸性環(huán)境下,長紅棗多糖富有良好的抗氧化活性。

    3 結(jié)論

    試驗以單因素分析考查試驗為基礎(chǔ),采用Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化超聲波輔助提取長紅棗多糖的最佳參數(shù)。結(jié)果表明,在料液比1∶17(g∶mL),超聲溫度56 ℃,超聲時間32 min試驗前提下,長紅棗多糖得率為14.23%,與預(yù)測值接近。長紅棗多糖具有一定的抗氧化能力,且抗氧化能力隨供試液質(zhì)量濃度的升高而升高。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL,對·OH的清除率為53%,對·O2-的抑制率為56%。在體外模擬不同pH值的胃環(huán)境清除NO2-試驗中,在pH值2~3環(huán)境下,長紅棗多糖對NO2-的清除率接近50%。試驗結(jié)果為長紅棗多糖提取的工藝放大提供了理論依據(jù),也為魯南地區(qū)長紅棗資源的開發(fā)利用提供了廣闊空間。

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    R284.2

    A

    10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2017.10.002

    1671-9646(2017) 10a-0005-06

    2017-08-07

    李福帥(1995— ),男,在讀本科,研究方向為制藥工程。

    *通訊作者:王占一(1980— ),男,碩士,講師,研究方向為天然藥物活性成分提取與分離。

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