狼尾草中草藥型青貯添加劑的篩選及優(yōu)化

李振武++陸烝++黃秀聲++林忠寧++應(yīng)朝陽(yáng)++韓海東

摘要 本研究旨在從10種中草藥中篩選出2～3種組成復(fù)方中草藥型青貯添加劑，使得該青貯添加劑能夠促進(jìn)狼尾草自帶的乳酸菌生長(zhǎng)，進(jìn)而達(dá)到改善狼尾草青貯發(fā)酵品質(zhì)的目的。首先采用單因素試驗(yàn)研究了不同濃度的5種補(bǔ)益類中草藥和5種清熱解毒類中草藥提取液對(duì)乳酸菌（從新鮮狼尾草葉片表面分離）生長(zhǎng)的影響，以對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)率為指標(biāo)，篩選出黃芪、五味子和金銀花組成復(fù)方中草藥型青貯添加劑；再采用正交試驗(yàn)對(duì)該復(fù)方中草藥型青貯添加劑各組分含量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，狼尾草中草藥型青貯添加劑的最優(yōu)配方為2.00%黃芪提取液、1.00%五味子提取液、1.00%金銀花提取液。

關(guān)鍵詞 狼尾草；中草藥；青貯添加劑；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S816.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）20-0221-003

Screening and Optimization of Chinese Herbal Medicine Additives for Chinese pennisetum silage

LI Zhen-wu 1 LU Zheng 1 HUANG Xiu-sheng 1，2 LIN Zhong-ning 1 YING Zhao-yang 1，2 HANG Hai-dong 1 *

（1 Agricultural Ecology Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou Fujian 350013； 2 Fujian Engineering and Technology Research Center for Circular Agriculture）

Abstract The purpose of this study was to screen out 2-3 kinds of Chinese herbal medicine composition from 10 kinds of Chinese herbal medicine to compose Chinese herbal medicine silage additives，which could promote the growth of lactic acid bacteria isolated from Chinese Pennisetum，so as to improve the quality of Chinese Pennisetum silage.Firstly，single factor experiments were conducted to evaluate the effects of different concentrations of 5 kinds of tonic Chinese herbal medicine and 5 kinds of heat clearing and detoxifying herbs extract on growth of lactic acid bacteria（isolated from fresh leaves of Chinese pennisetum）in vitro.The results showed that Astragali radix，Schisandrae chinensis fructus and Lonicerae japonicae Flos were the best components of the compound Chinese herbal medicine silage additive which promoted the growth of lactic acid bacteria.Furthermore，the orthogonal tests were used to optimize the doses of the compound Chinese herbal medicine silage additive.The results showed that the optimum doses of the compound Chinese herbal medicine additive for Chinese pennisetum silage were of 2.00% Astragali radix extract，1.00% Schisandrae chinensis fructus extract and 1.00% Lonicerae japonicae Flos extract.

Key words Chinese pennisetum；Chinese herbal medicine；silage additives；optimization

狼尾草（Chinese pennisetum）為多年生禾本科牧草，具有產(chǎn)量高、耐刈割、適口性好等特點(diǎn)，是草食家畜的優(yōu)質(zhì)青飼料，在南方紅壤地區(qū)得到了廣泛的推廣和應(yīng)用[1]。狼尾草的盛產(chǎn)期集中在夏季，在夏季對(duì)狼尾草進(jìn)行青貯有利于狼尾草季節(jié)性均衡供應(yīng)和提高其利用效率。近年來(lái)科技工作者對(duì)狼尾草的青貯技術(shù)開(kāi)展了大量的研究，主要集中在狼尾草低水分青貯、混合青貯和添加劑青貯等方面[2-4]。目前，狼尾草青貯應(yīng)用較多的青貯添加劑為乳酸菌制劑，市場(chǎng)上乳酸菌制劑是通用型的青貯添加劑，所用乳酸菌主要分離自外界環(huán)境，這些菌株由于生活環(huán)境與狼尾草生長(zhǎng)環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，致使乳酸菌在狼尾草青貯料中的適應(yīng)力不強(qiáng)、生長(zhǎng)性能差，導(dǎo)致青貯效果不理想。因此，篩選出價(jià)格便宜并可以改善狼尾草青貯品質(zhì)的專用青貯添加劑，對(duì)狼尾草在南方養(yǎng)牛業(yè)中的高效利用具有重要的意義。前人研究表明，許多補(bǔ)益類中草藥對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，許多清熱解毒類中草藥有抑菌作用[5-6]。本研究正是利用中草藥的這一特性，從狼尾草中分離乳酸菌，以對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)率為指標(biāo)，篩選出3種中草藥組成狼尾草專用的中草藥型青貯添加劑。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供篩選作為狼尾草青貯添加劑的中草藥有黃芪、五味子、枸杞、當(dāng)歸、熟地5種補(bǔ)益類中草藥以及金銀花、青蒿、瓜蔞、魚(yú)腥草、決明5種清熱解毒類中草藥。以上10種中草藥均購(gòu)自福建醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。乳酸菌由生長(zhǎng)旺盛的閩牧2號(hào)雜交狼尾草葉片表面分離純化，閩牧2號(hào)雜交狼尾草由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所牧草品種資源圃提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn)。對(duì)以上10種中草藥添加劑分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)率為指標(biāo)，研究不同添加劑不同濃度對(duì)狼尾草葉片表面乳酸菌增殖的影響。從添加劑的成本考慮，添加劑的添加濃度不宜超過(guò)2.00%，因而選擇的添加劑濃度分別為0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%。

1.2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從補(bǔ)益類中草藥中篩選出黃芪、五味子，從清熱解毒類中草藥中篩選出金銀花組成復(fù)方中草藥型青貯添加劑。采用正交試驗(yàn)對(duì)添加劑各組分添加量進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)采用3因素3水平5重復(fù)的正交設(shè)計(jì)，選用L9（33）正交表，試驗(yàn)因素為五味子提取液、黃芪提取液、金銀花提取液。正交試驗(yàn)各因素水平表如表1所示。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 中草藥型青貯添加劑制備。將各供試中草藥置于60 ℃干燥箱中烘至恒重，稱取中草藥25 g，用250 mL去離子水浸泡30 min后煎煮，沸后文火煎煮30 min，用孔徑為1 mm的4層紗布進(jìn)行第1次過(guò)濾得到第1次濾液和藥渣。然后在藥渣中加入150 mL去離子水，文火煎煮30 min后進(jìn)行第2次過(guò)濾，棄掉濾渣。將2次所得濾液合并后，文火煎煮濃縮至25 mL，使藥液終濃度為1 g/mL，即為100%中草藥原液，將中草藥原液高壓滅菌后，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

1.3.2 狼尾草乳酸菌提取純化及鑒定。稱取生長(zhǎng)旺盛、新鮮的閩牧2號(hào)狼尾草葉片5 g，將其剪成長(zhǎng)1 cm左右的小段，放入50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜止培養(yǎng)72 h，取培養(yǎng)72 h的狼尾草MRS發(fā)酵液0.5 mL接種于9.5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，室內(nèi)厭氧培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5代后，用滅菌的移液器吸取0.2 mL培養(yǎng)液滴入HORIBA B-212型微量pH計(jì)測(cè)定pH值。將72 h之后pH值高于4.0的菌液淘汰，之后繼續(xù)繼代培養(yǎng)，隨時(shí)淘汰pH值高于4.0的菌液。經(jīng)過(guò)10代左右的繼代培養(yǎng)，選出一個(gè)菌系，其pH值繼代培養(yǎng)穩(wěn)定且低于4.0。取0.5 mL生長(zhǎng)旺盛的菌液，轉(zhuǎn)入裝有4.5 mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻，依照該方法稀釋直到10-8倍，然后取0.1 mL在含有瓊脂的MRS培養(yǎng)基平板上涂皿，30 ℃靜止厭氧培養(yǎng)。從平板中選擇典型的菌落在同樣的平板上劃線分離培養(yǎng)，直到得到純的單個(gè)菌株，保存?zhèn)溆肹8]。

根據(jù)凌代文[9]的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。凡是革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株初步確定為乳酸菌，然后進(jìn)行乳酸菌屬的鑒定試驗(yàn)。乳酸菌屬的鑒定需要做硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、15 ℃及45 ℃的生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.3.3 添加劑對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響。從斜面上挑取適量菌苔，于MRS平板上劃線活化，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至菌體生長(zhǎng)。挑取平板上的單菌落，接入MRS液體培養(yǎng)基中，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌液渾濁，用生理鹽水對(duì)菌液進(jìn)行106倍稀釋后，置于磁力攪拌器上攪拌30～40 min。用2×MRS液體培養(yǎng)基將受試藥物進(jìn)行梯度稀釋，獲得4.00%、3.00%、2.00%、1.00%、0.50%的梯度溶液。在96孔板上加入梯度溶液100 μL（以2×MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，藥物濃度為0.00%），并加入100 μL工作菌液，各藥物終濃度為0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)5個(gè)平行。由于有些中草藥提取液的顏色很深，恐有干擾，故另取一個(gè)96孔板，以100 μL生理鹽水代替工作菌液，用于對(duì)各濃點(diǎn)的體系進(jìn)行監(jiān)控，并對(duì)各濃度體系的本底值進(jìn)行檢測(cè)，各設(shè)2個(gè)平行。將96孔板靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)振蕩混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將試驗(yàn)組及對(duì)照組的OD600值扣除對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的本底值，即為各濃度點(diǎn)的OD600值。以促進(jìn)率表征中草藥提取液對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響，促進(jìn)率（%）=（試驗(yàn)組的OD600 ÷ 對(duì)照組的OD600 -1）×100。用Minitab16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[10]。單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab16單因子方差分析，使用Tukey法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值+標(biāo)準(zhǔn)差；正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的直觀分析采用Minitab16的田口分析得到均值響應(yīng)表；正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析采用Minitab16的一般線性模型，使用Tukey法配對(duì)比較，檢驗(yàn)中使用校正的SS。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼尾草葉片表面乳酸菌的鑒定

從狼尾草葉片表面分離的菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性、不液化明膠、不產(chǎn)生硫化氫、無(wú)運(yùn)動(dòng)性都能在15 ℃和45 ℃條件下生長(zhǎng)，根據(jù)乳酸菌定義[11]，確定為乳桿菌屬。

2.2 中草藥提取液對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

由表2、3可知，不同類型的中草藥提取液對(duì)乳酸菌的作用不同，即使是同一種中草藥提取液的不同濃度對(duì)乳酸菌的作用也不盡相同。5種補(bǔ)益類中草藥提取液中，各濃度的五味子、黃芪、當(dāng)歸提取液均表現(xiàn)出對(duì)狼尾草乳酸菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，當(dāng)添加劑濃度越大時(shí)黃芪、當(dāng)歸提取液對(duì)乳酸菌的促進(jìn)作用越強(qiáng)，而五味子提取液則存在一個(gè)峰值，達(dá)到峰值以后，隨著添加劑濃度的提高，對(duì)乳酸菌的促進(jìn)作用反而下降；枸杞提取液對(duì)狼尾草乳酸菌生長(zhǎng)的作用不明顯，低濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有輕微的促進(jìn)作用，高濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有輕微的抑制作用；熟地提取液在各濃度均表現(xiàn)出對(duì)狼尾草乳酸菌生長(zhǎng)的抑制作用，添加劑濃度越大抑制作用越強(qiáng)。在試驗(yàn)設(shè)定的添加濃度范圍內(nèi)，5種補(bǔ)益類中草藥中，1.00%五味子提取液對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，促進(jìn)率為15.60%；2.00%黃芪提取液次之，對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的促進(jìn)率為13.88%。endprint