菌絲內(nèi)生細菌及其宿主真菌共生體系研究進展

吳遠征，李金萍，李丹丹，劉寶軍，扈進冬，李紀順，楊合同*

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) a. 山東省科學院生態(tài)研究所; b. 國際合作處，山東 濟南 250014)

共生一詞起源于希臘語“symbioun”，意為“共同生活”，由Anton de Bary于1879年定義為“兩個不同生物共同生活，存在緊密聯(lián)系，通常至少有益于一方”[1-2]。共生對塑造真核生物的進化和多樣性產(chǎn)生重要影響[3]。大多數(shù)真核生物與微生物(例如細菌和真菌)的復雜群落密切相關，而微生物對真核生物的發(fā)育、健康和生態(tài)起著關鍵作用[4-5]。

作為自然界中廣泛分布的真菌-細菌聯(lián)合體，對二者共生關系的認識，能夠對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境和醫(yī)學等方面的實際應用產(chǎn)生積極影響[6]。最新研究表明，許多與植物相關的真菌，包括葉狀子囊菌、深色隔生內(nèi)生菌(dark septate endophytes, DSE)、叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)、外生菌根擔子菌和蠟殼耳目內(nèi)生菌以及土壤生態(tài)系統(tǒng)中的一些植物病原性真菌和中性真菌，都攜帶著系統(tǒng)發(fā)育關系高度多樣性的附生和內(nèi)生細菌[7-12]。這些細菌大多附屬于α-、β-、γ-變形桿菌，柔膜菌，芽孢桿菌，噬幾丁質菌等，能夠改變宿主形態(tài)、孢子形成、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至改變與植物相互作用所涉及的其他特性[13-15]。但是，目前對真菌-共生功能體內(nèi)相互作用機制的全面評估有待深入研究[16-17]。

在植物根部和葉部內(nèi)生真菌的菌絲內(nèi)部經(jīng)常生活著高度多樣化的細菌，這類細菌被稱為菌絲內(nèi)生細菌(endohyphal bacteria, EHB)[18]。EHB現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于菌根真菌的菌絲內(nèi)部[19-20]，其宿主內(nèi)生真菌呈現(xiàn)高度多樣性，分離自不同的植物類群，來源植物的地理分布也具有多樣性[21]。目前對真菌-EHB這種引人注目的共生關系還沒有充分研究，菌絲內(nèi)共生體及其存在的生物學意義，特別是其對宿主真菌次級代謝的影響，尚待深入挖掘了解。本文綜述了EHB及其與宿主真菌的共生體系，以及此類共生體系的復雜性及成員之間微妙的相互關系，為真菌生物學的新發(fā)現(xiàn)和新見解提供借鑒。

1 真菌-細菌聯(lián)合體

1.1 類細菌

1970年，Mosse在研究蜂蜜色內(nèi)囊霉屬Endogone孢子發(fā)育過程中的細微結構變化時，發(fā)現(xiàn)了3類不同尋常的細胞器，即色素顆粒、大晶體和能自我復制的類細菌(bacterium-like organelles, BLOs)[19]。BLOs以自由形式存在于芽管和營養(yǎng)菌絲中，沒有任何外膜包被，并且以獨立分裂的方式增殖，對宿主真菌的形態(tài)沒有明顯的改變；當孢子從休眠轉向靜止狀態(tài)時，這些平時處于潛伏狀態(tài)的生物體會變得更加活躍，在宿主中多處部位形成菌落，膨脹成為尺寸更大的實體性結構，外觀上更像細菌[19]。Wilson和Hanton將BLOs描述為大小(0.5～1.0)μm×(1.0～3.9)μm的革蘭氏陰性的多形態(tài)桿狀細菌，包裹在宿主真菌的液泡或細胞膜中；BLOs出現(xiàn)退化時則變?yōu)榍蛐吻覜]有細胞膜包裹[22]。通過對蘇格蘭球孢囊霉Glomuscaledonius、摩西球囊霉Glomusmosseae、光滑無梗囊霉Acauloporalaevis、珍珠巨孢囊霉Gigasporamargarita、異配巨孢囊霉Gigasporaheterogama和未鑒定的白色網(wǎng)狀叢枝菌根孢子中BLOs的比較研究，發(fā)現(xiàn)BLOs是短暫型的原核細胞共生體，可被宿主真菌反復獲取或丟失[20,23]。在發(fā)現(xiàn)BLOs的最初十余年，叢枝菌根真菌的系統(tǒng)發(fā)育分類僅通過形態(tài)學進行，且BLOs無法在無細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此對BLOs的了解和描述并不充分[24]。

1.2 菌根輔助細菌

上世紀90年代，菌根輔助細菌(mycorrhiza helper bacteria, MHB)的概念被學者提出，用于描述那些能夠刺激菌根共生形成的細菌類別[25]。MHB的發(fā)現(xiàn)始于Duponnois和Garbaye的間接土壤熏蒸實驗，熏蒸處理對菌根真菌感染植物的抑制程度與定殖于土壤中的微生物類群差異有關，土壤微生物群落與菌根感染之間存在顯著的相互作用[26]。外生菌根對照表明，土壤中微生物的輔助性反應是由特殊的細菌MHB所引起的[27]。MHB能夠提高真菌孢子的萌發(fā)率和/或存活率，刺激菌絲體在共生形成之前的生長，增強植物短根對真菌信號的接受能力，刺激植物根與真菌菌絲間的識別，使之朝著利于菌根形成的方向發(fā)生改變[28]。MHB適應與宿主真菌生活在一起，且在離真菌較近的范圍內(nèi)群體更為豐富，二者之間的相互作用更多是種協(xié)同效應，在菌根共生體的生態(tài)和分布中起著關鍵性作用[29]。后來的研究均從經(jīng)表面消毒的外生菌根中分離到了細菌，其中80%的細菌對菌根共生關系的建立有積極作用，其余20%為中性即沒有明顯的影響[30-31]。迄今已鑒定的MHB菌株屬于許多細菌類和屬，例如革蘭氏陰性菌(農(nóng)桿菌、固氮菌、固氮螺菌、伯克霍爾德氏菌、緩生根瘤菌、腸桿菌、假單胞菌、克雷伯菌和根瘤菌)，革蘭氏陽性菌(芽孢桿菌、短桿菌和類芽孢桿菌)和放線菌(紅球菌、鏈霉菌和節(jié)桿菌)[29]。

1.3 菌絲內(nèi)生細菌

進入21世紀，研究者在植物根部和葉部內(nèi)生真菌的菌絲內(nèi)部發(fā)現(xiàn)存活有大量內(nèi)生細菌，系統(tǒng)發(fā)育高度多樣化，被稱為菌絲內(nèi)生細菌[18]。目前已知的EHB多存在于毛霉菌門(Mucoromycota)和球囊菌亞門(Glomeromycotina)。在葉部內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的EHB，與在專性共生真菌(例如球囊菌)中的EHB具有明顯的系統(tǒng)發(fā)育差異[21]。部分EHB的作用已得到闡明，更多EHB對宿主真菌次級代謝產(chǎn)物的影響則有待深入研究。EHB可能在調(diào)節(jié)宿主真菌次生代謝中發(fā)揮著重要作用，EHB的丟失則可能導致宿主真菌培養(yǎng)過程中關鍵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量衰減。Hoffman等[32]發(fā)現(xiàn)EHB能促進其宿主真菌產(chǎn)生能夠刺激植物生長的酶類物質如吲哚-3-乙酸等。在某些叢枝菌根真菌中，EHB有助于宿主真菌獲得磷酸鹽，這與磷酸鹽的運輸有關[33]。

菌絲內(nèi)生細菌還能影響植物內(nèi)生真菌的生態(tài)功能和多樣性。在生物脅迫條件下，EHB對宿主真菌和/或宿主植物具有輔助性保護作用[34]，有助于激活參與識別過程、轉錄調(diào)節(jié)和初級代謝蛋白合成的基因[35]，影響宿主真菌的植物激素產(chǎn)量[32]，輔助調(diào)節(jié)宿主真菌生殖機制的主要相關組分或過程[36]，甚至負責產(chǎn)生宿主真菌的特征性植物毒素如根霉素等[37]。

2 已發(fā)現(xiàn)的真菌-EHB共生體系

2.1 與毛霉菌門有關聯(lián)的EHB

2.1.1 與微孢根霉有關的菌絲內(nèi)生伯克霍爾德氏菌

作為典型的植物病原真菌菌絲內(nèi)生細菌，菌絲內(nèi)生伯克霍爾德氏菌Burkholderiaendofungorum與微孢根霉Rhizopusmicrosporus形成共生聯(lián)合體，微孢根霉是水稻幼苗枯萎病的致病菌，可產(chǎn)生稱為根霉素的植物毒素，導致水稻幼苗根系的異常膨脹[37]。根霉素是一種環(huán)肽化合物，之前曾被錯誤地鑒定為真菌毒素[38]。Partida-Martinez等[11,37]突破性地研究發(fā)現(xiàn)根霉素不是由微孢根霉合成的，而是由菌絲內(nèi)生伯克霍爾德氏菌合成的，這個發(fā)現(xiàn)揭示了一種非常復雜的共生-致病關系，將真菌與植物之間的相互作用范圍擴展到了第三個關鍵參與方EHB。Scherlach等[39]進一步研究發(fā)現(xiàn)，根霉素的前體物質2,3-環(huán)氧乙烷環(huán)的合成酶類來自宿主真菌微孢根霉。因此，可以說兩者在根霉素的生物合成中都起著重要作用。在沒有EHB存在時，微孢根霉不能進行營養(yǎng)繁殖，其孢囊和孢子的產(chǎn)生也只有在EHB重新引入后才能得到恢復[37]。

根霉素具有潛在的抗真菌活性，抑制真核細胞有絲分裂，對多種腫瘤細胞株系有抑制作用，可以作為一種潛在的抗腫瘤藥物[40]。根霉素的作用靶標指向β-微管蛋白，對脊椎動物和真菌等多種真核細胞具有拮抗能力，因此宿主真菌微孢根霉本身肯定對根霉素具有抵抗能力[40]。后來發(fā)現(xiàn)其他真菌類群對這種毒素也具有抗藥性，這些抗性真菌分別屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota)[41-42]。通過對來自36種不同真菌的49個β-微管蛋白序列進行分析，發(fā)現(xiàn)抵抗根霉素真菌的β-微管蛋白序列中氨基酸殘基100起著重要作用，是一個關鍵的位點，氨基酸Ile-100、Val-100、Ser-100和Ala-100均能賦予菌株對該毒素的抗性[43]。對根霉素抗性的進化是維持宿主真菌與其菌絲內(nèi)生細菌之間形成穩(wěn)定聯(lián)合體的關鍵。

此外，還發(fā)現(xiàn)EHB的III型分泌系統(tǒng)是建立這種共生關系的重要因素[44]。細菌細胞表面的多糖一般分為兩大類：一類是與細胞壁結合成囊狀的多糖即胞外多糖(EPS)，另一類是附在脂類A上的多糖即脂多糖(LPS)[45]。胞外多糖分泌到周圍環(huán)境并在細胞表面積累，而脂多糖則錨定在細胞膜上，有助于細胞膜的穩(wěn)定[46]。從根霉伯克霍爾德氏菌B.rhizoxinica中提取的脂多糖整體結構表明，O-抗原是形成穩(wěn)定聯(lián)合體的重要成分[47]，而未在微孢根霉與EHB的共生關系中發(fā)現(xiàn)胞外多糖具有顯著作用[48]。

2.1.2 與長枝被孢霉有關的半胱氨酸嗜真菌分枝桿菌

Sato等[49]篩選和鑒定了產(chǎn)生氧化亞氮N2O的土壤真菌長枝被孢霉Mortierellaelongata，發(fā)現(xiàn)一種生活在長枝被孢霉菌絲內(nèi)的細菌B1-EBT。16S rRNA基因測序結果表明，B1-EBT與巨孢囊霉桿菌Glomeribactergigasporarum(暫定名，屬于伯克霍爾德氏菌科)密切相關。與存在EHB的長枝被孢霉菌株相比，不存在EHB的菌株所產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素數(shù)量可以忽略不計，而EHB的存在與N2O的產(chǎn)生沒有顯著相關性[50]。采用傳統(tǒng)方法無法分離培養(yǎng)B1-EBT，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)該細菌缺少參與半胱氨酸生物合成的關鍵基因以及糖酵解途徑的相關基因，進而在補充添加半胱氨酸的培養(yǎng)基中成功地分離出B1-EBT，16S rRNA基因測序結果表明其屬于伯克霍爾德氏菌科的一個單獨分支——半胱氨酸嗜真菌分枝桿菌Mycoaviduscysteinexigens[51]。在此基礎上，對從日本分離到的半胱氨酸嗜真菌分枝桿菌B1-EBT和根霉伯克霍爾德氏菌HKI 454T以及美國分離的半胱氨酸嗜真菌分枝桿菌Mc-AG77進行了基因組比較分析[34,39,50]，發(fā)現(xiàn)菌株B1-EBT和Mc-AG77基因組中都缺乏能侵染真菌細胞的幾丁質水解酶(幾丁質酶、殼聚糖酶)基因，卻富含多種推定的毒素-抗毒素系統(tǒng)以及一種殺蟲毒素復合物和一個定殖時控制內(nèi)生細菌生長的PIN結構域[52]。

2.1.3 與梨形管囊霉有關的點形念珠藻

梨形管囊霉Geosiphonpyriformis和點形念珠藻Nostocpunctiforme之間存在一種非常罕見的聯(lián)合關系，是唯一已知的真菌與藍藻之間的共生[53-54]。梨形管囊霉是梨形管囊霉屬的唯一種類，特征是能夠形成叢枝菌根，產(chǎn)生含有藍藻的單細胞多核囊；點形念珠藻的細胞不為真菌細胞壁所包圍，以自由狀態(tài)生活在宿主真菌的細胞質中[55]。點形念珠藻可以固定CO2為有機物，作為糖源為梨形管囊霉提供能量；在某些特定條件下，點形念珠藻還可以固定氮氣，為宿主真菌提供氮素營養(yǎng)；同時點形念珠藻也從宿主真菌受益，梨形管囊霉可以為其提供礦物質營養(yǎng)如磷酸鹽以及CO2。這兩個聯(lián)合體成員之間的關系具有穩(wěn)定性，原因是藍藻為宿主真菌提供糖源，而宿主真菌則為藍藻進行光合作用提供所需要的基本物質[56]。

2.1.4 與叢枝菌根珍珠巨孢霉有關的巨孢囊霉桿菌

Bianciotto等[57]利用電子顯微鏡和細菌計數(shù)試劑盒(分子探針)發(fā)現(xiàn)珍珠巨孢霉Gigasporamargarita分離株BEG 34的孢子中有桿狀原核細胞的存在。利用通用引物從珍珠巨囊霉孢子DNA中擴增得到16S RNA，序列分析表明其中的內(nèi)生細菌與伯克霍爾德氏菌關系密切，可能是β-變形桿菌的一員。為了探討這種聯(lián)合體現(xiàn)象是否為巨孢霉科的共同特性，他們進一步研究了11株分屬珍珠巨孢霉G.margarita、玫瑰紅巨孢囊霉G.rosea、巨大巨孢囊霉G.gigantean、易誤巨孢囊霉G.decipiens、波斯盾巨囊霉Scutellosporapersica和板栗盾巨囊霉S.castanea的分離株，發(fā)現(xiàn)除玫瑰紅巨孢囊霉外，其他分離株均觀察到形態(tài)相近的菌絲內(nèi)生細菌，但巨大巨孢囊霉中細菌的形態(tài)略有不同，個體尺寸小且近圓形[58]。存在于珍珠巨孢囊霉、波斯盾巨囊霉和板栗盾巨囊霉細胞中的內(nèi)生細菌屬于單一分類群，形態(tài)上相似，暫定名為巨孢囊霉桿菌Glomeribactergigasporarum[58]。叢枝菌根真菌AMF繁殖過程中，內(nèi)生細菌細胞質的穩(wěn)定性及其在真菌繁殖過程中的繁殖傳遞表明，隨著真菌菌絲體中細菌的活躍增殖，真菌通過AMF孢子的產(chǎn)生而使內(nèi)生細菌發(fā)生垂直性傳播；還發(fā)現(xiàn)這些細菌是其宿主真菌的專一性細胞內(nèi)伴侶。珍珠巨孢霉的EHB能提高真菌的產(chǎn)孢能力，通過提高ATP的產(chǎn)生來為宿主真菌增加能量，還能夠引發(fā)對活性氧解毒機制的啟動，在宿主真菌的代謝、繁殖和抗逆能力中發(fā)揮著重要作用[59]。

2.1.5 與柔膜細菌目有關的內(nèi)生細菌Mre

Naumann等[60]分析了內(nèi)生細菌在球囊菌亞門(Glomeromycotina)中的分布情況，對來自四大洲的28種叢枝菌根真菌AMF培養(yǎng)物進行了評估，將內(nèi)生細菌鑒定為一個新的分類群，與柔膜細菌目(Mollicutes)聚類在一起，與包括支原體目(Mycoplasmatales)和蟲原體目(Entomoplasmatales)的分類群是姊妹關系。選取3種野生苔類植物的內(nèi)生細菌與柔膜細菌目的序列聚類在一起，確定了新型系統(tǒng)發(fā)育類型的存在。利用熒光原位雜交技術(FISH)在AMF菌絲細胞質中發(fā)現(xiàn)了柔膜細菌目相關內(nèi)生細菌(Mollicutes related endobacteria, Mre)的存在[61]。

由于AMF含有兩類內(nèi)生細菌，即柔膜細菌目相關內(nèi)生細菌Mre和前述的巨孢囊霉桿菌Glomeribactergigasporarum(暫定名, CaGg)，因此對二者在AMF宿主中的分布模式和共存情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)單個AMF可以同時容納兩種類型的內(nèi)生細菌Mre和CaGg，并且與CaCg相比，Mre數(shù)量更多、更加多變以及能夠發(fā)生重組現(xiàn)象[62]。在29個內(nèi)囊霉Endogonespp.中發(fā)現(xiàn)了13種Mre，聚類分析表明內(nèi)囊霉Mre與球囊菌Mre不同，構成單獨的系統(tǒng)發(fā)育分支[63]。AMF體內(nèi)的Mre分子進化模式研究表明，Mre在單個AMF內(nèi)雖然表現(xiàn)出了多樣性，但不同大陸來源的AMF中Mre之間的差異并不明顯。Mre據(jù)推測可能是球囊菌的寄生物，而它們之間形成的穩(wěn)定聯(lián)合體是垂直傳播和水平傳播共同作用的結果，但這種聯(lián)合體中二者的關系是否在相互拮抗和互惠之間反復地發(fā)生轉換仍有待確認[64]。

Naito等[65]從叢枝菌根球囊菌中分離到一種新型EHB，暫定名為Moeniiplasmaglomeromycotorum，根據(jù)16S rRNA基因序列分析，該菌與Candidatusmoeniiplasma有相似之處，但19個基因的系統(tǒng)發(fā)育與支原體科(Mycoplasmataceae)成員類似。

最新研究發(fā)現(xiàn)，394株被孢毛霉亞門(Mortierellomycotina)菌株中有12株Mre存在，代表了一種新的細菌系統(tǒng)發(fā)育類型，毛霉菌門的所有種類都可以與Mre形成聯(lián)合體關系，同時Mre可以一種非致命型生活方式拮抗其宿主真菌[66]。

2.2 與擔子菌(Basidomycota)有關聯(lián)的EHB

2.2.1 與外生菌根真菌雙色蠟蘑有關的類芽孢桿菌

早期發(fā)現(xiàn)的EHB多見于毛霉菌門和球囊菌亞門。第一個發(fā)現(xiàn)存在EHB的外生菌根真菌是雙色蠟蘑Laccariabiolor，屬于擔子菌類。雙色蠟蘑菌株S238N已在法國商業(yè)化，用于苗圃中接種道格拉斯冷杉幼苗，以獲得高效的造林用苗木，但在制備該菌株的接種物過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)常有大量的細菌繁殖，鑒定為類芽孢桿菌Paenibacillussp.。用特異性16SrRNA寡核苷酸探針進行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)該細菌定位于真菌菌絲的內(nèi)部，但這種細菌在外生菌根與植物共生關系中的作用尚不清楚[67]。

2.2.2 玉米黑粉菌與短小芽孢桿菌形成的新型胞內(nèi)固氮聯(lián)合體

Ruiz-Herrera等[68]發(fā)現(xiàn)一株致病真菌玉米黑粉菌Ustilagomaydis能在無氮培養(yǎng)基上生長，具有固定大氣氮的能力。進一步的研究發(fā)現(xiàn)在這種真菌體內(nèi)存在一種能夠固氮的內(nèi)共生細菌EHB，用細菌16S rRNA和nifH基因擴增證實在真菌細胞確實存在著一種細菌，鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus，是一種以自由方式生活的固氮菌。通過檢測固氮酶活性確定了其固氮能力，并以摻入細胞同位素15N驗證了固氮過程。

2.2.3 印度梨形孢與放射根瘤菌共生體

通過定量PCR、變性梯度凝膠電泳DGGE和FISH發(fā)現(xiàn)印度梨形孢Piriformosporaindica菌株DSM 11827與放射根瘤菌Rhizobiumradiobacter菌株F4存在密切的共生關系，根瘤菌隨宿主真菌無性繁殖以及真菌植物定殖過程中垂直傳播[69]。蠟殼耳目真菌Sebacinales與多種細菌具有穩(wěn)定的聯(lián)合共生關系[14]，其中3個屬即類芽孢桿菌屬Paenibacillusspp.、不動桿菌屬Acinetobacterspp.、紅球菌屬Rhodococcusspp.與Sebacinavermifera相關聯(lián)，而放射根瘤菌僅與印度梨形孢相關聯(lián)[70]。

從印度梨形孢中能夠分離到放射根瘤菌，無菌條件下的純培養(yǎng)實驗也獲得了成功，但嘗試獲得不含根瘤菌的印度梨形孢純培養(yǎng)物卻屢屢失敗。為了打破宿主真菌-EHB之間的這種聯(lián)合共生，采取了多種策略如使用高濃度抗生素等，都沒有成功地將二者分開，據(jù)推測EHB的缺失可能會降低宿主真菌的適合度[71]。在不同生長條件下分析了寄主真菌中EHB載量的影響因素，觀察到放射根瘤菌確實能提高印度梨形孢的適合度，可以幫助三方成功地建立共生關系。

2.3 與子囊菌(Ascomycota)有關聯(lián)的EHB

Hoffman等[18]2010年首次報道了植物葉部內(nèi)生真菌的菌絲中存在著在系統(tǒng)發(fā)育方面具有多樣性的內(nèi)生細菌。他們對子囊菌類植物內(nèi)生真菌中的EHB發(fā)生情況進行了探討，包括多種子囊菌類植物病原菌、腐生菌和人類病原菌。結果表明這種子囊菌-EHB之間的共生關系廣泛而普遍地存在，使用活/死細胞染色方法(SYTO9綠色熒光核酸染色和紅色熒光核酸染色、碘化丙烯的混合物)在子囊菌菌絲中觀察到內(nèi)生細菌，并通過FISH分析確認。

作為常綠柏科植物Cupressaceaesempervirens的內(nèi)生真菌，擬盤多毛孢Pestalotiopsisneglecta菌絲內(nèi)生細菌藤黃色桿菌Luteibactersp.被成功分離獲得了純培養(yǎng)物，并將藤黃色桿菌重新引入到寄主真菌中，探討EHB對宿主真菌的影響。發(fā)現(xiàn)宿主真菌的生長速度不依賴于EHB的存在，但是含有EHB的宿主菌株中吲哚乙酸的產(chǎn)量高于不含的宿主菌株[72]。

Soltani等[73]也探討了與常綠柏科植物內(nèi)生真菌相關的多種內(nèi)生細菌的發(fā)生、多樣性和潛在的生物活性，發(fā)現(xiàn)大約31%的常綠柏科植物內(nèi)生真菌中含有內(nèi)生細菌，還發(fā)現(xiàn)單一的真菌培養(yǎng)物含有單一的細菌種類。此外，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis既是植物內(nèi)生細菌，也是真菌菌絲的內(nèi)生細菌，目前尚不清楚這種單一基因型的細菌如何同時適應這兩種不同生活方式。

3 真菌-EHB共生體系中的二者關系

3.1 EHB進入宿主真菌的機制

盡管關于EHB的報道越來越多，但對EHB與真菌的結合方式或者EHB進入真菌菌絲的過程及相關機制的了解顯然還不夠[38,74]。最近的許多報道描述了微生物進入宿主細胞的方式，細菌一般是通過分泌蛋白質來抑制宿主細胞的防御系統(tǒng)，從而進入宿主細胞內(nèi)部。

革蘭氏陰性菌依賴于高效的蛋白質分泌系統(tǒng)包括I型～VI型(T1SS～T6SS)，將蛋白質或蛋白底物直接從細菌細胞轉移到靶標真核生物或原核生物的細胞質膜中[75]。其分泌胞外蛋白的過程十分復雜，蛋白質需要穿過兩層磷脂膜，第一步是通過Sec或者Tat系統(tǒng)進入細胞周質，然后再通過另外一個運輸系統(tǒng)穿過外膜。此外，許多蛋白質也可通過獨立于Sec或Tat的系統(tǒng)分泌。盡管細胞壁結構存在差異，革蘭氏陽性菌輸送蛋白質也涉及到Sec和Tat兩種蛋白分泌系統(tǒng)，也有極少數(shù)革蘭氏陽性細菌使用另外一個獨特的分泌系統(tǒng)(T7SS)[75]。

Moebius等[76]基于基因組學和蛋白質組學的研究結果，發(fā)現(xiàn)了一種新的細菌融合現(xiàn)象，涉及到殼聚糖水解酶的分泌，電子顯微鏡照片揭示了細菌對真菌的實際感染過程。雖然殼聚糖是接合菌(Zygomycete)細胞壁的主要成分[77]，但細菌侵入真菌細胞的過程中只有幾丁質水解酶起了重要作用。為建立真菌-EHB之間的密切關系，內(nèi)生細菌還會在適當?shù)臅r間和地點與宿主真菌發(fā)生物理性接觸[78]，隨后確定了兩種相關的分子機制：一種是II型蛋白質分泌系統(tǒng)(T2SS)，另一種是幾丁質酶分泌系統(tǒng)。幾丁質酶參與二者的相互作用以及EHB對宿主真菌細胞的侵入，胞外幾丁質酶的分泌和相關蛋白的易位是通過T2SS系統(tǒng)來完成的，幾丁質酶軟化了真菌細胞壁，從而幫助EHB進入到宿主真菌細胞內(nèi)，這可以作為共生聯(lián)合體關系的模型來探索二者之間的作用機制。

3.2 真菌-EHB二者關系的建立與轉變

為探尋真菌與EHB共生體系中二者相互關系的轉變，Lastovetsky等[79]以微孢根霉與EHB菌株伯克霍爾德氏菌為通用模型，進行了潛在分子機制方面的研究。結果表明，當微孢根霉細胞中含有內(nèi)生伯克霍爾德氏菌時，就具有了對根霉素的抗性，原因是其β-微管蛋白的序列發(fā)生了突變[43]，由此可以推斷二者關系已經(jīng)從拮抗轉向了互惠[47]。二者這種關系的轉變得益于一種新的機制，主要包括宿主在脂質代謝過程中發(fā)生的變化，當脂代謝和磷脂酸合成酶被激活時，宿主與EHB便處于一種互惠互利的關系當中；相反當磷脂酸合成酶活性被抑制時，它們之間轉為相互拮抗的關系。

在植物與微生物的相互作用中，真菌與菌絲內(nèi)生細菌共生體對寄主植物的生活方式可能也會產(chǎn)生重要影響，可能是植物內(nèi)生群落中的第三個關鍵組成部分[80-81]。真菌和細菌聯(lián)合體的形成可能是化學信號通訊作用后的結果，即聯(lián)合體成員中一方的代謝物會引起另一方的反應[82-83]。隨著現(xiàn)代化技術方法的出現(xiàn)，可以利用轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學技術來更好地探索真菌和細菌聯(lián)合體形成過程中各個事件發(fā)生的細節(jié)[84-86]。

4 EHB的研究意義

菌絲內(nèi)生細菌EHB的研究發(fā)現(xiàn)揭開了微生物生態(tài)學的一個新篇章。EHB與其宿主內(nèi)生真菌形成的共生體系，對于闡明微生物共生的形成機制與進化過程、揭示EHB對宿主真菌甚至是植物的生存發(fā)育和適應能力的影響至關重要[87-88]。真菌-EHB共生聯(lián)合體在改善植物營養(yǎng)，促進植物生長，提高抗病性、抗鹽性、抗旱性，分解有毒物質，修復退化與污染環(huán)境，提高環(huán)境與食品安全性等方面發(fā)揮協(xié)同作用[89]。

多項研究表明，EHB能夠改變共生聯(lián)合體中的酶體系及其他代謝物質，進而影響植物-真菌間的相互作用，例如根霉-伯克霍爾德氏菌為代表的模型系統(tǒng)，其毒素的產(chǎn)生方式與致病性的分子基礎令人著迷，是研究微生物相互作用的進化以及相互關系的范例。具有生理活性的次級代謝產(chǎn)物的分離發(fā)現(xiàn)是EHB研究的熱門領域，對真菌致病性檢測甚至抗腫瘤藥物開發(fā)都具有指導意義[90]。

目前微生物組學(Microbiome)、宏基因組學(Metagenomics)和多-組學(Multi-omics)聯(lián)合技術與高通量測序、單細胞測序技術的發(fā)展應用，以及次級代謝物分離分析技術的提高，結合新的計算工具和模型極大促進了EHB的研究[91-92]。德國馬克斯普朗克植物育種研究所與瑞士學者利用微生物組學，成功從模式植物擬南芥Arabidopsisthaliana根和葉片中培養(yǎng)出了超過一半的細菌，利用純培養(yǎng)獲得的432個細菌菌株，研究人員可以在實驗室中重建擬南芥根和葉中的任何微生物組[93]。在此基礎上，開展微生物組研究和多單位、多地域的協(xié)同研究將會進一步加快植物內(nèi)生微生物資源的研究和利用。

5 展望

EHB的多樣性和生態(tài)重要性對于我們了解生態(tài)學和生物進化至關重要，通過對EHB內(nèi)生生活方式的研究，能夠模擬重建遠古細菌狀態(tài)，探討細菌生活方式的演化軌跡，解析真菌-EHB在不同生態(tài)環(huán)境中的相互作用，發(fā)現(xiàn)生物進化中動態(tài)種群的演替過程。

有關EHB與內(nèi)生真菌(包括有益真菌與有害真菌)及其宿主植物之間的相互作用、生理生態(tài)效應及其作用機制以及應用基礎等方面，有待更廣泛、更深入地給予系統(tǒng)、全面的研究與開發(fā)。隨著技術發(fā)展與研究的深入，其新功能將不斷被發(fā)現(xiàn)，EHB已經(jīng)引起植物、微生物學家等的足夠重視，成為研究的熱門課題。

由于EHB分離培養(yǎng)、消除接種等技術的限制，大量的植物內(nèi)生微生物資源仍處于未知狀態(tài)。目前普遍使用的分離培養(yǎng)方法難以有效分離EHB，加之菌絲內(nèi)生環(huán)境和人工培養(yǎng)環(huán)境的區(qū)別，這樣可能導致內(nèi)生微生物不容易形成菌落。許多研究主要集中在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)方向，研究程度上也存在著“初步研究多，深入追究少”的缺點。

利用傳統(tǒng)的非培養(yǎng)技術包括微生物組學、宏基因組學和多-組學等研究EHB內(nèi)生微生物組，發(fā)掘其中豐富的菌種資源、遺傳資源和生理活性物質資源，這也將為環(huán)境微生物多樣性研究和新藥物尋找注入活力和提供新的來源?？蓛?yōu)先研究EHB與生防內(nèi)生真菌在一些重要生理生態(tài)功能上的互補效應與機制，如兩者協(xié)同誘導植物防御反應、提高植物與土壤健康狀況等。針對不同植物種類、土壤條件、農(nóng)藝管理體制等，篩選適宜不同生態(tài)條件、不同種類植物的EHB與內(nèi)生真菌二元和多元復合生物制劑，為其應用提供技術依據(jù)。

菌絲內(nèi)生細菌的研究蘊藏著豐富的可能性和極大的空間。隨著現(xiàn)代分子、成像、培養(yǎng)和生物信息技術的進步，真菌-EHB共生體系的諸多方面仍然有待我們?nèi)リU明：(1)共生體系如何建立、進化和維持的多種支撐機制；(2)微生物共生如何影響宿主的發(fā)育、健康和生存；(3)微生物共生體如何幫助其伴侶適應快速變化的環(huán)境。通過跨學科研究人員的多種系統(tǒng)方法研究，將逐步揭示出自然界中共生體系的非凡之處，進而對加快真菌-EHB在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用，具有重要的理論和實踐價值。