PAK4與P54蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

張 鵬，朱 靜，呂曉蘭，張興旺，崔 波

陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林719000)

·臨床病理·

PAK4與P54蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

張 鵬，朱 靜，呂曉蘭，張興旺，崔 波△

陜西省榆林市第一醫(yī)院(榆林719000)

目的：研究p21-activated kinase(pAK)-4和P54蛋白在乳腺癌中的表達和相互作用。方法：選擇乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌和乳腺癌轉移瘤組織各20例，用免疫組織化學S-P法檢測pAK-4表達，比較其與不同病理特征的關系。用免疫熒光法體外觀察P54亞細胞定位及與PAK4的共定位情況。結果：乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉移瘤組織和乳腺癌中PAK4表達陽性率逐漸增加，陽性產物主要位于胞漿，尤以核周明顯，細胞基質未見明顯染色，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。非浸潤性癌、早期浸潤癌、晚期浸潤癌中PAK4表達陽性率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過共聚焦實驗證實P54定位在細胞漿，且和PAK4有共定位。結論：PAK4和P54蛋白可能作為診斷和治療乳腺癌的重要敏感分子標志物。

乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，約占全身惡性腫瘤的7%～10%[1]。外周血腫瘤標志物是早期診斷乳腺癌的重要方法，目前常用的血清腫瘤標志物有CA125、CEA、TPS[2]，病理標本檢測HER-2/Neu、ER、PR、EGFR、VGFR、VEGF等[3]，陽性率和陽性預測值均不甚理想，往往僅作為臨床診斷和治療的參考指標。研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞信號轉導通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修飾之間的平衡狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[4]。已有部分研究指出[5]，p21-activated kinase(pAK)-4在乳腺癌和卵巢癌中呈高表達?；诖耍撗芯窟M一步探討pAK-4和主要作用蛋白P54在不同乳腺疾病中的表達情況。

資料與方法

1 材料選擇 連續(xù)選擇2016年4月至2017年4月入我院確診的20例乳腺癌和20例乳腺纖維瘤患者，年齡29～66歲，平均(42.5±10.3)歲。無藥物治療、手術切除和放化療史，無嚴重心、肝、腎等臟器功能障礙，無其他惡性腫瘤。該研究取得患者和家屬的知情同意權，其中癌旁正常組織、乳腺癌組織和轉移瘤組織均取自同一患者，每種組織取不同位點的3份標本，由同一經驗豐富的專家完成，標木經10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，作4μm連續(xù)切片。

2 實驗方法

2.1 主要試劑：兔抗人PAK4抗體(美國Sigma公司)，正常兔IgG(南京碧云天科技有限公司)，S-P免疫組化試劑盒(福建邁新生物技術公司)，過氧化物酶標記羊抗兔IgG(深圳晶美生物有限公司)，EDTA抗原修復液(上海奉賢申鑫化工廠)，DAB顯色試劑盒(廣州杰特偉公司)。

2.2 主要儀器與設備：OLYMPUSBX4O光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，3K30高速離心機(日木OLYMPUS公司)，UNO11型PCR儀(美國Bio-Tek公司)，紫外透射儀(德國Biometra公司)，CU600型電熱恒溫水浴箱(日本柯達公司)，組織切片機(德國leica)，SANYO超低溫冰箱(日本)。

2.3 免疫組織化學：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10min，消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗、PBS浸泡、抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液室溫20min；滴加一抗兔抗人PAK4多克隆抗體50μl(l∶200稀釋)37℃孵育2h，4℃過夜，37℃復溫45min。滴加生物素標記的羊抗兔IgG抗體37℃孵育30min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育30min。PBS洗滌、DAB顯色、蘇木精復染、氨水返藍、脫水、透明、封片、鏡檢。

2.4 結果判定：參照Campo等標準：以陽性染色細胞比率與染色強度之和為總積分，其中以陽性染色細胞比率<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，≥51%計3分；染色強度無計0分，弱染色計1分，中等強度計2分，高等強度計3分；總積分0～1分為陰性，2～3為弱陽性，4分為中等陽性，5～6分為強陽性。

2.5 免疫熒光法：以PBS溶液重懸細胞濃度為1×106/ml，采用微量移液器將其轉移至12孔細胞培養(yǎng)板上，每孔10μl，每組設立3個副孔，結果取其平均值。加入雙無DMEM細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h，相差顯微鏡觀察細胞貼壁外轉P54及PAK4蛋白表達質粒；然后換成雙有DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，保證外轉質粒的正常蛋白表達。棄去培養(yǎng)基，加700μl 4%多聚甲醛常溫固定10min。加入1ml 0.1%Triton-X-100常溫10min對細胞進行透化。1%羊血清常溫封閉1h，加入適宜濃度的一抗常溫孵育l h；加入Alexa-546紅色標記的二抗避光常溫封閉l h，Topro-3染核避光染色30min；甘油封片，在共聚焦激光掃描顯微鏡上觀察P54及PAK4蛋白的亞細胞定位情況。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件，非連續(xù)性等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PAK4蛋白在不同乳腺組織中的表達 乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉移瘤組織和乳腺癌中PAK4表達陽性率逐漸增加，陽性產物主要位于胞漿,尤以核周明顯,細胞基質未見明顯染色，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 PAK4蛋白在不同乳腺組織中的表達(例)

注：Kruskal-Wallis值15.623，P<0.001

2 PAK4蛋白在不同病理類型中的表達 非浸潤性癌、早期浸潤癌、晚期浸潤癌中PAK4表達陽性率逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2

表2 PAK4蛋白在不同病理類型中的表達(例)

注：Kruskal-Wallis值12.432，P<0.001

3 P54和PAK4蛋白的細胞定位 通過共聚焦實驗證實P54定位在細胞漿,且和PAK4有共定位。

討 論

近年來，在分子水平對乳腺癌腫瘤細胞形成、增殖、分化、轉移等研究取得顯著進展[6]。PAKs又稱p21小GTP酶活化激酶，相對分子量為21kD，是絲/蘇氨酸蛋白質磷酸化激酶家族的成員之一。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，調控PAKs基因轉錄的上游分子中有Rho家族的小GTP酶Cdc42和Racl，可表現(xiàn)激酶活性[7]。研究證實，PAK4在細胞損失修復、生長增殖、分化、轉移、血管新生等病理生理方面發(fā)揮重要作用，是與人類多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展關系十分密切的基因和蛋白[8]。通過該研究得出：乳腺癌癌旁正常組織、乳腺纖維瘤、乳腺癌轉移瘤和乳腺癌中PAK4陽性表達率逐漸增加，陽性產物主要位于胞漿，核周最明顯，細胞基質未見明顯染色，差異均有統(tǒng)計學意義。非浸潤性癌、早期浸潤癌、晚期浸潤癌中PAK4表達陽性率逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學意義。說明PAK4可能作為一種敏感檢測指標，在判斷乳腺癌的惡性程度和病理類型中有重要意義。

李彥姝等研究[9]通過構建PAK4過表達真核載體和ShRNA技術構建低表達載體，并分別成功轉染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，結果得出上調乳腺癌細胞PAK4表達可以明顯促進乳腺癌細胞的增殖活性，抑制其凋亡率，增加細胞粘附、侵襲、轉移和體內致瘤等活性，反之亦然。正常乳腺腺體上皮存在活躍的細胞增殖和凋亡，兩者之間的動態(tài)平衡可能是乳腺細胞清除受損衰老細胞的主要機制之一[10]。在細胞基因和結構正常修復過程中，PAKs家族起重要作用，研究表明PAK4受生長因子調控[11]。

P54蛋白是一種神經特異性的蛋白，是有效的微管不穩(wěn)定因子-膜相關蛋白。P54為PAK4腫瘤信號通路的進一步完善提供了新依據(jù)。P54的中心調節(jié)區(qū)域中存在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶 A(PKA)的磷酸化位點，能夠調節(jié)微管蛋白的解聚過程[12]。通過該研究得出：P54定位在細胞漿，和PAK4有共定位。有研究[13]通過酵母雙雜交實驗篩選出PAK4的相互作用蛋白中有P54，并將其共轉到AH109酵母菌體內進行驗證，結果顯示兩者能夠相互作用。此外，GST-pull down實驗也進一步證實了兩者在體外的相互作用，而免疫沉淀實驗則驗證了兩者的體內相互作用。

綜上所述，AK4和P54蛋白可能作為診斷和治療乳腺癌的重要敏感分子標志物。

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△通訊作者

乳腺腫瘤/病理學 PAK4蛋白 P54蛋白 免疫組織化學

R365

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.11.042

(收稿：2017-02-28)