綿羊EDAR基因的克隆、序列分析及其在毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)

陳 磊，賀三剛，劉書東，瑪依拉，李文蓉

(新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

綿羊EDAR基因的克隆、序列分析及其在毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)

陳 磊，賀三剛，劉書東，瑪依拉，李文蓉

(新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

旨在獲得中國美利奴羊EDAR(ectodysplasin A receptor)基因的CDS區(qū)全序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析EDAR在綿羊毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)特性，為深入研究該基因在綿羊毛囊生長發(fā)育過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控提供基礎(chǔ)資料。采用PCR擴(kuò)增獲得綿羊EDAR基因全長編碼區(qū)，并克隆到PCRTM-BluntⅡ-TOPO@vector進(jìn)行測(cè)序；利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)；應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)EDAR基因在綿羊毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，綿羊EDAR基因的CDS序列長度為 1 350 bp(GenBank登錄號(hào)：KX900497)，編碼 449 個(gè)氨基酸，該氨基酸序列與其他物種相比一致性較高；進(jìn)化樹分析表明，綿羊EDAR氨基酸序列與牛的進(jìn)化關(guān)系較近，與斑馬魚較遠(yuǎn)；預(yù)測(cè)結(jié)果顯示綿羊EDAR蛋白存在一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；qRT-PCR分析表明，EDAR基因在綿羊胎兒毛囊發(fā)育過程中均有表達(dá)，在毛囊發(fā)育第 55 天和第 135 天表達(dá)較高，第 75 天表達(dá)最低。獲得綿羊EDAR基因完整的編碼區(qū)序列和毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)特性，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EDAR基因的編碼區(qū)序列具有物種間的保守性，同時(shí)該基因在綿羊毛囊不同發(fā)育階段的皮膚組織中表達(dá)，由此表明EDAR基因可能在綿羊毛囊的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

綿羊；EDAR；基因克?。粺晒舛縋CR；毛囊

中國美利奴羊是中國 1985 年培育成的第一個(gè)毛用細(xì)毛羊品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定、毛叢結(jié)構(gòu)好、羊毛長而明顯彎曲和凈毛量高的特點(diǎn)。綿羊的毛囊是一個(gè)形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的皮膚附屬器官。綿羊毛囊的發(fā)育始于胚胎發(fā)育時(shí)期，通過表皮和真皮兩個(gè)細(xì)胞群體之間相互作用并進(jìn)行有序地增殖和分化，最終形成完整的毛囊[1-5]。EDAR基因在毛囊發(fā)育和生長周期中發(fā)揮重要作用，因此明確其在妊娠期綿羊毛囊不同發(fā)育階段的表達(dá)差異，對(duì)于進(jìn)一步研究其在綿羊毛囊發(fā)育過程中的作用具有重要意義。外異蛋白A受體(EDAR)是 1999 年由Headon和Overbeek采用定位克隆的方法發(fā)現(xiàn)的，主要由與胞外配體結(jié)合的N末端結(jié)構(gòu)域、單跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域3部分組成[6]。EDAR是腫瘤壞死因子受體(TNF)超家族中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)配體，它可以通過與EDA結(jié)合，募集輔助蛋白EDARADD激活NF-КB 轉(zhuǎn)錄因子,最終影響細(xì)胞內(nèi)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[7-8]，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的生物學(xué)作用。研究表明，EDAR在牙齒、皮膚、毛發(fā)和汗腺等外胚層組織的發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用[9-11]。此外EDAR還參與動(dòng)物毛囊生長發(fā)育的調(diào)控，有研究表明，小鼠EDAR基因突變導(dǎo)致guard和zig-zag毛發(fā)類型缺失，導(dǎo)致髓質(zhì)中色素顆粒的分布出現(xiàn)異常[12]。Laurikkala等[10]利用原位雜交技術(shù)將EDAR基因mRNA定位于胚胎期小鼠皮膚毛囊的基板和毛球部，其在小鼠毛囊生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)EDAR基因存在一個(gè) 1 072 C>T錯(cuò)義突變，該突變引起的氨基酸改變影響毛發(fā)的厚度[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)EDA/EDAR/NF-КB信號(hào)通過結(jié)合LHX2促進(jìn)毛囊基板的向下生長[15]；此外，研究發(fā)現(xiàn)EDAR參與WNT、TGFβ、SHH等多種細(xì)胞信號(hào)通路從而調(diào)控毛囊的發(fā)育[16-17]。由此可見，EDAR是一個(gè)具有重要生物學(xué)功能的蛋白，它在動(dòng)物毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長中發(fā)揮重要作用，但是綿羊上還未見EDAR基因的研究報(bào)道。本研究以中國美利奴羊?yàn)樵囼?yàn)材料，對(duì)綿羊EDARCDS區(qū)序列進(jìn)行克隆，隨后用生物信息學(xué)軟件對(duì)EDAR蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，檢測(cè)其在綿羊毛囊不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異，初探EDAR在綿羊毛囊生長發(fā)育過程中的作用，為深入研究EDAR在綿羊毛囊生長發(fā)育過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用2～3 歲的中國美利奴羊，均來自新疆畜牧科學(xué)院綿羊中心羊場(chǎng)，采用相同的飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼喂。通過同期發(fā)情和人工授精技術(shù)分別采集中國美利奴羊妊娠期毛囊發(fā)育起始階段第 55 天(D55)，初級(jí)毛囊形成階段第 75 天(D75)、次級(jí)毛囊形成階段第 85 天(D85)、次級(jí)獲得性毛囊形成階段第 105 天(D105)和毛發(fā)生長成熟階段第 135 天(D135)各 3 只胎羊的體側(cè)皮膚組織樣本，迅速裝入RNAlater凍存管中，-80 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa(大連)公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；TRIzol、zero Blunt@TOPO@PCR cloning kit購自Life Technology公司；RNAlater購自QIAGEN公司；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.3 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成

參照TRIzol Reagent(Invitrogen)說明書，分別提取中國美利奴羊妊娠期第 55、75、85、105 和 135 天體側(cè)皮膚組織總RNA，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并利用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的質(zhì)量濃度和純度。取 2 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV說明書進(jìn)行細(xì)毛羊毛囊發(fā)育不同時(shí)期皮膚組織總RNA的cDNA合成。

1.4 克隆引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 預(yù)測(cè)的羊EDAR基因序列信息(XM_015094371)設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-GTCCGGATCCGCCACCATGGCCCACAGGGGAAGCTGC-3′(下劃線為BamHⅠ 酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CCTGAAGCTTTCAagcgtagtctgggacgtcgtatgggtaGGATGCGGGGGGTGGCGGG-GC-3′(下劃線為Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)，小寫字母為 HA 標(biāo)簽的編碼序列)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 綿羊EDAR基因克隆

以中國美利奴羊皮膚組織 cDNA 為模板，利用設(shè)計(jì)的EDAR基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA模板 2.0 μL， 10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/U)2.0 μL，上、下游引物(10 mol/mL)各1.0 μL，高保真DNA聚合酶(1.0 U/μL)1.0 μL，滅菌去離子水補(bǔ)至 25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取 5.0 μL 反應(yīng)液用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用DNA純化試劑盒純化 PCR產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接 PCR 產(chǎn)物和 PCRTMBlunt Ⅱ-TOP@克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶鑒定后，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行序列拼接；使用Mega 5.0軟件構(gòu)建EDAR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析不同物種之間的序列差異；利用TMHMM server 2.0、NetPhos 3.1 serve軟件預(yù)測(cè)EDAR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)；利用Signal 4.0、NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽及N糖基化位點(diǎn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別以中國美利奴羊毛囊發(fā)育第 55 、75、85、105 和 135 天的體側(cè)皮膚組織cDNA為模板，以綿羊GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)，引物見表 1。反應(yīng)體系 25 μL，其中：cDNA模板 1.0 μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。每個(gè)樣品設(shè) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 5 s,58 ℃復(fù)性 15 s,72 ℃延伸 10 s，共 45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，以 0.1 ℃/s 的速度進(jìn)行熔解曲線分析。分別讀取目的基因和持家基因的Ct值，利用Ct法(Qr=2-ΔΔCt) 計(jì)算EDAR基因在中國美利奴羊毛囊發(fā)育不同時(shí)期體側(cè)皮膚組織 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，并利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 毛囊組織總RNA的提取

中國美利奴羊毛囊發(fā)育各階段組織樣本總RNA經(jīng) 8 g/L 變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均可見到 28 S、18 S和5 S 3 條帶(圖略)，無蛋白和基因組污染。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，所有樣品的A260/A280比值均為1.8～2.0。說明提取的總RNA質(zhì)量較好，符合反轉(zhuǎn)錄和后續(xù)定量分析試驗(yàn)的要求。

2.2 EDAR基因的克隆、重組子鑒定

以中國美利奴羊毛囊發(fā)育第 135 天的體側(cè)皮膚組織 cDNA 為模板，經(jīng)特異性引物 PCR 擴(kuò)增，獲得條帶大小約為 1 500 bp 的片段且特異性良好(圖1)，可以切膠回收進(jìn)行克隆，隨后提取質(zhì)粒并用BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到約 1 300 bp的插入片段(圖2)，與預(yù)期相符。所獲得的序列經(jīng)與 GenBank 公布的人類、小鼠和牛EDAR基因 CDS 序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示克隆獲得的序列與人類、小鼠和預(yù)測(cè)的牛EDAR編碼區(qū)序列相似性分別為 83.41%、79.56%和 96.3%，確定為綿羊EDAR基因(GenBank登錄號(hào)：KX900497)。

M. DNA marker; 1～3. PCR 產(chǎn)物 PCR Product

圖1綿羊EDARPCR擴(kuò)增
Fig.1PCRamplificationofsheepEDAR

M. DNA marker DL 5000；1～4.BamHⅠ和Hind Ⅲ 酶切產(chǎn)物 Products digested byBamHⅠ andHind Ⅲ

圖2綿羊EDAR酶切
Fig.2DigestionofsheepEDAR

2.3 綿羊EDAR序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，綿羊EDAR編碼區(qū)序列為 1 350 bp，編碼 449 個(gè)氨基酸，相似性分析發(fā)現(xiàn)，綿羊EDAR的氨基酸序列與人、大鼠、小鼠、雞和牛(預(yù)測(cè))等物種的同源性較高，分別為 85.75%、82.41%、82.63%、78.4%和 98.22%(圖 3)。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，綿羊和牛處于同一個(gè)分枝上，親緣關(guān)系最近(圖 4)。SMART在線軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)綿羊EDAR蛋白含有 1 個(gè)信號(hào)肽區(qū)域(第 1～26 位氨基酸)、1 個(gè)蛋白跨膜區(qū)域(第 189～211 位氨基酸)、2 個(gè)TNFR(Tumor necrosis factor receptor)區(qū)域(第 31～71 位氨基酸，第 74～113 位氨基酸)和一個(gè) Death 區(qū)域(第 350～432 位氨基酸)(圖 3)。通過ProParam軟件得到其分子質(zhì)量為 48.34 ku，等電點(diǎn)為5.06 ，脂肪系數(shù)為 78.08 ，負(fù)電荷殘基總數(shù) 59 ，正電荷殘基總數(shù) 44 。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，EDAR蛋白存在 27 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，12個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和 6 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，EDAR蛋白含有 17 個(gè)潛在的 O-糖基化位點(diǎn)和 2 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。蛋白疏水性結(jié)果顯示EDAR蛋白具有較少的疏水性區(qū)域，N 段和中間區(qū)域存在多個(gè)親水性區(qū)域，C 段完全是疏水性區(qū)域。采用Targetp 1.1 server軟件分析蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，線粒體靶向肽數(shù)值(mTP)為0.052，信號(hào)肽數(shù)值(SP)為 0.912 。此外，EDAR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，綿羊EDAR蛋白存在 11 個(gè)α-螺旋區(qū)和 6 個(gè)β-折疊區(qū)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5所示。

藍(lán)色下劃線表示信號(hào)肽序列，紅色下劃線表示腫瘤壞死因子受體位點(diǎn)(TNFR)，黃色下劃線表示跨膜區(qū)，紫色下劃線表示死亡結(jié)構(gòu)域，綠色框代表綿羊EDAR測(cè)序序列與EDAR預(yù)測(cè)序列的差異

Blue underline indicates the signal peptide sequence, red underline indicates TNFR, yellow underline indicates EDAR protein transmembrane domains, purple underline indicates death domain, the green box represents the difference between the sequence and the predicted sequence of sheep

圖39個(gè)物種EDAR氨基酸序列分析
Fig.3MultiplealignmentofEDARaminoacidsequencesin9species

2.4 EDAR基因在毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)分析

為了確定EDAR基因在中國美利奴羊胚胎期毛囊生長發(fā)育過程中的表達(dá)差異，提取中國美利奴羊毛囊生長發(fā)育第 55 、75 、85 、105 和135 天體側(cè)部皮膚組織的總RNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。經(jīng)檢測(cè)，EDAR和GAPDH基因的擴(kuò)增效率(Amplification efficiency)分別為 1.906 和 1.901 ，滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR要求。結(jié)果表明(圖6)，EDAR基因第 135 天表達(dá)量最高，在第 55 天表達(dá)量次之，在第 75、85和105天表達(dá)量相近，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。

圖4 9 個(gè)物種 EDAR 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructedfor EDAR protein of 9 species

圖5 綿羊EDAR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted tertiary structure of sheep EDAR protein

EDAR在毛囊不同發(fā)育階段的mRNA水平；圖中所標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

The mRNA level ofEDARin different hair follicle development period;the different letter indicated significant difference (P<0.05)

圖6EDAR在綿羊毛囊不同發(fā)育階段中的表達(dá)量
Fig.6ExpressionofEDARinsheephairfollicleindifferentdevelopmentperiod

3 討 論

3.1 綿羊EDAR基因克隆與結(jié)構(gòu)分析

目前，EDAR基因在調(diào)控動(dòng)物毛囊生長發(fā)育方面已開展較為廣泛的研究，而有關(guān)綿羊EDAR基因的功能研究較為少見，且尚未獲得完整的EDAR基因編碼區(qū)全長序列。本研究根據(jù)EDAR基因編碼區(qū)序列在哺乳動(dòng)物間高度保守的特點(diǎn)，利用 PCR 測(cè)序的方法首次克隆獲得綿羊EDAR基因的編碼區(qū)全序列，其編碼區(qū)序列全長1 350 bp，與綿羊預(yù)測(cè)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)克隆獲得的綿羊EDAR基因編碼區(qū)序列糾正 NCBI 數(shù)據(jù)庫EDAR預(yù)測(cè)序列 221～269 位氨基酸上的錯(cuò)誤(圖3)，填補(bǔ)綿羊EDAR序列的缺失。序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，綿羊EDAR基因編碼的氨基酸序列與牛的序列具有非常高的相似性(98.22%以上)，這與以氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果相一致，從而進(jìn)一步證實(shí)EDAR序列在物種間的高度保守性。

3.2 綿羊 EDAR 蛋白結(jié)構(gòu)分析

綿羊EDAR基因定位于 3 號(hào)染色體，編碼 449 個(gè)氨基酸，屬Ⅰ型跨膜蛋白，一級(jí)結(jié)構(gòu)含有 1 個(gè)信號(hào)肽區(qū)域、1 個(gè)蛋白跨膜區(qū)域、2 個(gè)TNFR區(qū)域和 1 個(gè) Death 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果與其他物種 EDAR 蛋白結(jié)構(gòu)相一致[6]。綿羊EDAR基因編碼的氨基酸序列中存在信號(hào)肽序列，說明其為分泌型蛋白，同時(shí)氨基酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)各物種信號(hào)肽具有不同的結(jié)構(gòu)特征，說明該蛋白在行使信號(hào)功能時(shí)發(fā)揮的作用不盡相同，進(jìn)而在調(diào)控 EDAR 蛋白的生物學(xué)功能中發(fā)揮不同作用。此外，研究發(fā)現(xiàn) EDAR 是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員之一，在毛囊、牙齒和汗腺等組織器官發(fā)育中具有重要作用[11]，本研究分析綿羊EDAR蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有 2 個(gè)腫瘤壞死因子受體(TNFR)位點(diǎn)，由此推測(cè)綿羊EDAR蛋白在調(diào)控組織發(fā)育過程的作用與其同源蛋白的生物學(xué)功能存在一定相似性。另外，綿羊EDAR蛋白含有一個(gè)跨膜區(qū)和死亡結(jié)構(gòu)域，二者使該蛋白較容易區(qū)別于其他TNFR超家族蛋白[11]，并且死亡結(jié)構(gòu)域在EDAR參與的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。該蛋白跨膜區(qū)域兩端不同物種間的氨基酸序列存在一定差異，影響靠近膜兩端的蛋白結(jié)構(gòu)形式，說明該蛋白在發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑存在物種特異性。

3.3 EDAR 與綿羊毛囊發(fā)育的關(guān)系

EDAR基因在細(xì)胞命運(yùn)決定，外胚層發(fā)育以及組織器官的形成等領(lǐng)域的研究取得明顯進(jìn)展，此外，EDAR基因及其參與的EDA/EDAR/NF-КB細(xì)胞信號(hào)通路在器官發(fā)育和毛囊生長周期調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用[18-21]。目前，EDAR的研究主要集中在人類[13]、小鼠[15]和雞[11]上，關(guān)于EDAR調(diào)控綿羊毛囊生長發(fā)育過程的資料報(bào)道較少。本研究以中國美利奴羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分析EDAR在毛囊發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn) EDAR基因在綿羊胚胎期第 55 天和第 135 天的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育時(shí)期，其中在胚胎期第 135 天EDAR基因表達(dá)量最高，第55天次之，說明EDAR基因很可能在毛囊基板發(fā)生和毛發(fā)結(jié)構(gòu)中具有重要功能，這與已知的研究結(jié)果較相近[22]。羊毛的發(fā)生始于出生前胎兒時(shí)期，其毛囊的生長發(fā)育和成熟是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，其發(fā)生和發(fā)育受到多種信號(hào)通路和功能基因的調(diào)控[23-24]。由于EDAR基因能夠與Wnt/β-catenin、BMP等調(diào)控毛囊發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路相互作用影響毛囊的發(fā)育過程[15-16]，因此研究中國美利奴羊胚胎期毛囊生長發(fā)育過程中EDAR基因的表達(dá)，對(duì)研究其在毛囊生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制提供重要依據(jù)。

本研究初步分析EDAR基因在中國美利奴羊毛囊生長發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，為研究EDAR調(diào)控毛囊生長發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。前期大量的研究已經(jīng)證明，EDAR基因與動(dòng)物毛囊的發(fā)育以及毛品質(zhì)性狀密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，EDAR基因參與綿羊毛囊的發(fā)育，并在毛囊發(fā)育過程中具有重要作用，初步推測(cè)EDAR基因可能在綿羊毛囊基板向下生長和毛囊成熟過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，其作用機(jī)制目前尚不清楚，有必要進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆綿羊EDAR基因編碼區(qū)序列，分析表明 EDAR 蛋白在物種間存在高度保守性。同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量 PCR方法獲得該基因在中國美利奴羊毛囊發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特性。上述研究表明，EDAR基因參與中國美利奴羊毛囊的生長和發(fā)育過程，為進(jìn)一步闡述綿羊毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，為研究EDAR在綿羊毛囊發(fā)育過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

Reference：

[1] MILLAR S E.Molecular mechanisms regulating hair follicle development [J].TheJournalofInvestigativeDermatology,2002,118(2):216-225.

[2]FUCHS E,RAGHAVAN S.Getting under the skin of epidermal morphogenesis [J].NatureReviewsGenetics,2002,3(3):199-209.

[3]BOTCHKAREV V A,PAUS R.Molecular biology of hair morphogenesis: development and cycling [J].JournalofExperimentalZoologyPartB,MolecularandDevelopmentalEvolution,2003,298(1):164-180.

[4]SCHMIDT-CHMIDT-ULLRICH R,PAUS R.Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis [J].BioEssays:NewsandReviewsinMolecular,CellularandDevelopmentalBiology,2005,27(3):247-261.

[5]RISHIKAYSH P,DEV K,DIAZ D,etal.Signaling involved in hair follicle morphogenesis and development [J].InternationalJournalofMolecularSciences,2014,15(1):1647-1670.

[6]HEADON D J,OVERBEEK P A.Involvement of a novel Tnf receptor homologue in hair follicle induction [J].NatureGenetics,1999,22(4):370-374.

[7]KUMAR A,EBY M T,SINHA S,etal.The ectodermal dysplasia receptor activates the nuclear factor-kappaB,JNK,and cell death pathways and binds to ectodysplasin A [J].TheJournalofBiologicalChemistry,2001,276(4):2668-2677.

[8]SMAHI A,COURTOIS G,RABIA S H,etal.The NF-kappaB signalling pathway in human diseases: from incontinentia pigmenti to ectodermal dysplasias and immune-deficiency syndromes [J].HumanMolecularGenetics,2002,11(20):2371-2375.

[9]TUCKER A S,HEADON D J,SCHNEIDER P,etal.Edar/Eda interactions regulate enamel knot formation in tooth morphogenesis [J].Development,2000,127(21):4691-4700.

[10]LAURIKKALA J,PIAPA J,JUNG H S,etal.Regulation of hair follicle development by the TNF signal ectodysplasin and its receptor Edar [J].Development,2002,129(10):2541-2553.

[11]DREW C F,LIN C M,JIANG T X,etal.The Edar subfamily in feather placode formation [J].DevelopmentalBiology,2007,305(1):232-245.

[12]BOTCHKAREV V A,FESSING M Y.Edar signaling in the control of hair follicle development [J].TheJournalofInvestigativeDermatologySymposiumProceedings,2005,10(3):247-251.

[13]SABETI P C,VARILLY P,FRY B,etal.Genome-wide detection and characterization of positive selection in human populations [J].Nature,2007,449(7164):913-918.

[14]KAMBEROV Y G,WANG S,TAN J,etal.Modeling recent human evolution in mice by expression of a selected EDAR variant [J].Cell,2013,152(4):691-702.

[15]TOMANN P,PAUS R,MILLAR S E,etal.Lhx2 is a directNF-kappaBtarget gene that promotes primary hair follicle placode down-growth [J].Development,2016,143(9):1512-1522.

[16]ZHANG Y,TOMANN P,ANDI T,etal.Reciprocal requirements for EDA/EDAR/NF-kappaB and Wnt/beta-catenin signaling pathways in hair follicle induction [J].DevelopmentalCell,2009,17(1):49-61.

[17]PUMMILA M,FLINIAUX I,JAATINEN R,etal.Ectodysplasin has a dual role in ectodermal organogenesis: inhibition of Bmp activity and induction of Shh expression [J].Development,2007,134(1):117-125.

[18]MIKKOLA M L,THESLEFF I.Ectodysplasin signaling in development [J].Cytokine&GrowthFactorReviews,2003,14(3/4):211-224.

[19]BAYES M,HARTUNG A J,EZER S,etal.The anhidrotic ectodermal dysplasia gene (EDA) undergoes alternative splicing and encodes ectodysplasin-A with deletion mutations in collagenous repeats [J]HumanMolecularGenetics,1998,7(11):1661-1669.

[20]HYMOWITZ S G,COMPAAN D M,YAN M,etal.The crystal structures of EDA-A1 and EDA-A2: splice variants with distinct receptor specificity [J].Structure,2003,11(12):1513-1520.

[21]HEADON D J,EMMAL S A,FERGUSON B M,etal.Gene defect in ectodermal dysplasia implicates a death domain adapter in development [J].Nature,2001,414(6866):913-916.

[22]STECKSEN-BLICKS C,FALK KIERI C,HAGG D,etal.Hair shaft structures in EDAR induced ectodermal dysplasia [J].BMCMedicalGenetics,2015,16(1):79.

[23]韓新艷,郁 楓,何 婷,等.藏山羊胚胎毛囊的形態(tài)發(fā)生及p-catenin 和SHH的兩類表達(dá)模式 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(6):23-28.

HAN X Y,YU F,HE T,etal.Hair follicles morphogenesis and two expression patterns of β-catenin and SHH in Tibetan goat embryos [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentatisSinica,2009,18(6):23-28(in Chinese with English abstract).

[24]毛青青,代 蓉,沈思軍,等.BMP4對(duì)小鼠毛囊數(shù)量的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(5):13-17.

MAO Q Q,DAI R,SHEN S J,etal.Influence of BMP4 on hair follicles quantity of mice [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentatisSinica,2012,21(5):13-17(in Chinese with English abstract).

[25]WU S J,TAN J Z,YANG Y J,etal.Genome-wide scans reveal variants at EDAR predominantly affecting hair straightness in Han Chinese and Uyghur populations [J].HumanGenetics,2016,135(11):1279-1286.

Cloning,SequencingandQuantitativeExpressionofEDARGeneinSheepDuringHairFollicleDevelopmentPeriod

CHEN Lei,HE Sangang,LIU Shudong,MAYILA and LI Wenrong

(Livestock Breeding and Biotechnology Laboratory of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Xinjiang Autonomous Region, Biotechnology Research Institute, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830000, China)

The aim of this study was to clone the coding sequence(CDS)of sheep EDAR(ectodysplasin A receptor)coding sequence(CDS), to analyze its sequence characteristics, and to investigate its expression during hair follicle different development periods. It could provide the data for further investigation on the function and the expression regulation ofEDARGene in the hair follicle growth and development period. PCR products were cloned into PCRTM- BluntⅡ-TOPO@vector and sequenced. The protein structure of sheep EDAR was analyzed by bioinformatic methods. The expression patterns during hair follicle development period were detected by real-time RT-PCR. The results showed that the sheepEDARCDS was 1 350 bp (GenBank accession KX900497 ) in length, which coded 449 amino acids and shared highly identity with other species. The phylogenetic tree analysis indicated that the sheep EDAR was closely related to cattle, but distantly related to the zebrafish. The sheep EDAR protein contained a signal peptide and a transmembrane helice; According to the analysis of real-time PCR, mRNA expression of sheep EDAR was detected during hair follicle development period, and EDAR mRNA expression levels was higher in the 55th day and the 135 th day, and it was the lowest in the 75th day. Therefore, EDAR was cloned and its expression patterns during hair follicle period were investigated. The sequence characteristics of EDAR was conservative in different species. EDAR expression in the hair follicle development period indicated that EDAR may play an important role in the hair follicle growth and development period.

Sheep; EDAR ; Gene cloning; Real-time PCR; Hair follicle

2016-10-24

2016-12-19

The Natural Science Foundation of Xinjiang(2014211B042).

CHEN Lei, male,assistant research fellow.Research area: hair follicle development. E-mail: chenlei0991@126.com

S826；Q81

A

1004-1389(2017)10-1415-07

日期：2017-10-18

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.002.html

2016-10-24

2016-12-19

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211B042)。

陳 磊，男，助理研究員，研究方向?yàn)榫d羊毛囊發(fā)育。Email：chenlei0991@126.com

李文蓉，女，研究員，研究方向?yàn)榫d羊繁殖育種。Email：xjlwr@126.com

CorrespondingauthorLI Wenrong, female, research fellow. Research area: sheep breeding. E-mail: xjlwr@126.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)