產(chǎn)絮凝劑菌種的篩選及其在豬場污水凈化中的應(yīng)用

張魯新，魯 陳，李呂木,，徐雅芫，梁 君，刁 歡，丁維民

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產(chǎn)絮凝劑菌種的篩選及其在豬場污水凈化中的應(yīng)用

張魯新1，魯 陳2，李呂木1,2※，徐雅芫1，梁 君1，刁 歡1，丁維民3

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036； 3. 安徽安泰農(nóng)業(yè)集團(tuán)，廣德242200）

分離高效絮凝劑產(chǎn)生菌以有效絮凝豬場污水中的懸浮物。通過稀釋平板法和篩選培養(yǎng)基及以發(fā)酵液對豬場污水的絮凝率為指標(biāo)復(fù)篩，從豬場污水沉淀池污泥中篩選獲得一株產(chǎn)絮凝劑的細(xì)菌FD-14，并進(jìn)行16S rDNA鑒定，然后以絮凝效果為標(biāo)準(zhǔn)，采用La(34)正交設(shè)計對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；采用單因素試驗對其碳氮源進(jìn)行優(yōu)化。以最優(yōu)培養(yǎng)條件下菌株的發(fā)酵液實際絮凝豬場污水，與化學(xué)絮凝劑的絮凝效果進(jìn)行比較。分離得到一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌FD-14，分子生物學(xué)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（），其產(chǎn)絮凝劑最適條件為溫度33 ℃，pH值6.6，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間42 h。菌株FD-14利用淀粉作為其廉價碳源替代發(fā)酵培養(yǎng)基的絮凝率為80.80%，與原標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基差異不顯著（>0.05）；對豬場實際應(yīng)用結(jié)果表明，微生物絮凝劑和化學(xué)絮凝劑對豬場污水絮凝率分別為79.0%和62.7%，微生物絮凝劑比化學(xué)絮凝劑對豬場污水絮凝率高16.3%。解淀粉芽孢桿菌FD-14是生物絮凝劑高效產(chǎn)生菌，其產(chǎn)生的絮凝劑可用于豬場污水懸浮物絮凝。

篩選；污水；凈化；解淀粉芽孢桿菌；絮凝劑；絮凝特性

0 引 言

隨著國家對畜牧場環(huán)境污染控制措施的逐步落實到位，畜牧場污水的安全高效凈化處理問題已經(jīng)引起集約化畜牧業(yè)經(jīng)營者的高度重視。由于豬場污水中懸浮物含量高，為了減輕后續(xù)生化處理的壓力，現(xiàn)在常使用化學(xué)合成絮凝劑如聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）和聚合氯化鋁（PAC）[1-2]對豬場污水的懸浮物進(jìn)行絮凝。但大多數(shù)化學(xué)合成絮凝劑難以降解，且由化學(xué)合成絮凝劑衍生的許多單體對人體有害[3-5]。例如從PAM衍生的丙烯酰胺單體對人類是一種強烈的致癌物質(zhì)和神經(jīng)毒素[6]，PAC所含的鋁離子可導(dǎo)致神經(jīng)性病變?nèi)绨柎暮Ｄ习Y[7]。因而，目前一些國家已禁止或限制使用這類絮凝劑[8]。此外化學(xué)合成絮凝劑處理畜牧場污水時添加量大，成本高[9]。微生物絮凝劑（microbial flocculants，MF）是微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)組成[10]。它可以誘導(dǎo)懸浮液中的固體顆粒、細(xì)菌、細(xì)胞和膠體粒子絮凝并沉淀。MF不但具有絮凝沉淀性能，還具有安全無毒，易于生物降解的顯著優(yōu)點[11-12]。目前主要通過水生植物以及化學(xué)處理等途徑對豬場污水進(jìn)行凈化，而利用微生物處理豬場廢水的研究報道還較少[1-2,13]。因此，豬場污水懸浮物的高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的分離篩選備受重視。為此，本研究從豬場污水沉淀池污泥中分離高效絮凝劑產(chǎn)生菌，研究其生物絮凝劑的絮凝特性及絮凝豬場污水懸浮物的效果，以期獲得豬場養(yǎng)殖污水的高效微生物絮凝劑，為綠色生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；FZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；752紫外可見分光光度計（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；HC-2518高速離心機；GRJ-10D全自動發(fā)酵控制系統(tǒng)（江蘇省鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司）；微孔板紫外可見光度計（spectra MAX190，美谷分子儀器(上海)有限公司）。

1.2 篩選材料和培養(yǎng)基

篩選材料：豬場污水沉淀池污泥。

富集培養(yǎng)基：1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，pH值7.0～7.2；

分離培養(yǎng)基：1）PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL，pH值7.0～7.2；2）細(xì)菌分離培養(yǎng)基[14]：脲0.5 g，酵母膏5.0 g，蔗糖20 g，K2HPO45.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO42.0 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；

標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：葡萄糖20 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏2.0 g，KH2PO45.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO42.0 g，NaCl 10 g，水1000 mL。

1.3 菌株的篩選

1.3.1初篩

取2 g污泥和2 mL污水樣品，分別加入到98 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基中，分別于37 ℃，150 r/min和30 ℃，150 r/min搖床振蕩富集培養(yǎng)24 h。取富集培養(yǎng)液，用無菌水適當(dāng)稀釋后，取0.1 mL分別涂布于分離培養(yǎng)基上，于富集培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，并挑選表面光滑且大而帶黏性的菌落，隨后采用平板劃線法進(jìn)行分離純化，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2復(fù)篩

將初篩得到的菌株接入到100 mL標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并分別于相對應(yīng)的篩選溫度下，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h 后取菌液。以菌液對豬場污水的絮凝率為依據(jù)，選出具有生產(chǎn)高效絮凝劑的菌株。選擇絮凝活性高的菌株送大連寶生物進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，使用NCBI中的blast軟件分析菌株測序結(jié)果，使用Maga4.0 軟件的N-J法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3發(fā)酵菌液添加量對絮凝率的影響

準(zhǔn)確量取0.1、0.5、1、2和3 mL發(fā)酵液添加到100 mL豬場污水中，并以氯化鈣為助凝劑，以對豬場污水絮凝率為指標(biāo)，研究絮凝劑添加量對污水絮凝率的影響。

CaCl2添加量對絮凝率的影響：準(zhǔn)確量取1 mL發(fā)酵液添加到100 mL豬場污水中，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的CaCl21、2、3、4和5 mL，以對豬場污水絮凝率為指標(biāo)，研究絮凝劑添加量對污水絮凝率的影響。

1.3.4 絮凝率的測定

取100 mL豬場污水，加入2 mL 1% CaCl2作為助凝劑，再加入1 mL發(fā)酵菌液，常溫條件下，100 r/min振蕩10 min，靜置30 min，取上清液，使用分光光度計測定波長680 nm處的吸光度OD680。絮凝率計算公式如下：

絮凝率（%）=[(?)/]×100%

式中是添加發(fā)酵液后污水在680 nm處吸光度；為原污水在680 nm處吸光度。

1.3.5 菌株生長曲線

將菌種接種到標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。每6 h取樣，以未接菌種的培養(yǎng)基為對照，分別測定發(fā)酵液pH值、菌體生長量OD600及發(fā)酵液對豬場污水的絮凝率，以發(fā)酵液pH值、菌體生長量OD600及發(fā)酵液對豬場污水的絮凝率為縱坐標(biāo)，并以時間為橫坐標(biāo)進(jìn)行生長曲線的繪制。

1.4 菌株培養(yǎng)條件及碳氮源優(yōu)化

1.4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

首先進(jìn)行單因素試驗，分別確定培養(yǎng)時間、溫度、pH值和轉(zhuǎn)速4因素對絮凝活性的影響。培養(yǎng)時間對絮凝活性的影響：試驗方法參照1.5節(jié)。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9(34)正交試驗方法，利用10 L全自動發(fā)酵罐對溫度()、pH值()、轉(zhuǎn)速()、培養(yǎng)時間()：4因素3水平進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.2 碳氮源優(yōu)化

旨在利用廉價碳氮源替代優(yōu)選菌種的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基碳氮源的可能性，以便降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。碳源的優(yōu)化：分別以麩皮、玉米粉和淀粉代替標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變。氮源的優(yōu)化：分別以尿素、氯化銨和豆粕代替標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的酵母粉和牛肉膏。替代碳氮源的低濃度水平為其對應(yīng)的等碳和等氮替代。碳氮源的適宜替代水平確定，以絮凝效果與原標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)基絮凝效果差異不顯著（<0.05）為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 絮凝劑在絮凝豬場養(yǎng)殖污水中的應(yīng)用

于安徽安泰農(nóng)業(yè)集團(tuán)肥東種豬育種公司污水處理站進(jìn)行。利用污水處理站絮凝反應(yīng)裝置進(jìn)行微生物絮凝劑的應(yīng)用研究，并以豬場現(xiàn)行的化學(xué)絮凝方法為對照。具體試驗步驟如下：

化學(xué)絮凝：第1步，徹底排空絮凝反應(yīng)罐原有污水；第2步，放入新鮮的厭氧處理過的豬場污水3 t攪拌均勻并取樣500 mL，作為處理前的污水樣帶回實驗室分析；第3步，添加豬場使用的化學(xué)絮凝劑（0.05 g/mL PAC和0.001 g/mL PAM，0.05 g/mL NaOH）攪拌反應(yīng)10 min，攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min；第4步：靜置30 min后取上清液500 mL，作為化學(xué)絮凝后的水樣帶回實驗室分析。

生物絮凝：第1步和第2步同化學(xué)絮凝；第3步，添加0.02 g/mL助凝劑氯化鈣并攪拌均勻；第4步，添加體積分?jǐn)?shù)1%優(yōu)選菌株擴(kuò)培菌液，攪拌反應(yīng)10 min，攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min；第5步，靜置30 min后取上清液500 mL，作為生物絮凝后的水樣帶回實驗室分析。

每種方法處理兩批，水樣均用棕色玻璃瓶盛裝，并保存于4 ℃陰暗處，其中測定COD和氨氮的樣品加濃硫酸酸化到pH值為2以下后于4 ℃冷藏保存。

1.6 菌株FD-14所產(chǎn)絮凝劑的提取及分析

將發(fā)酵液8 000×離心30 min去除菌體和雜質(zhì)，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/5，裝入3 000 Da透析袋中，透析3次每次6 h。加入3倍體積的預(yù)冷（4 ℃）無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，? ℃靜置24 h。8 000×離心30 min，收集沉淀。將沉淀重新溶解在100 mL蒸餾水中，加1:1的氯仿和正丁醇混合液（氯仿與正丁醇體積比5:2），室溫靜置1 d，取有機溶劑層加入2倍體積污水乙醇，于4 ℃靜置24 h，8000×離心30 min，收集沉淀。冷凍干燥，得到生物絮凝劑。

紫外光譜分析：1 g/L的絮凝劑樣品溶液在190～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。根據(jù)吸收峰判定樣品是否含蛋白質(zhì)和核酸。紅外光譜分析：取1 mg絮凝劑，使用紅外光譜儀進(jìn)行掃描分析，測定紅外吸收光譜，分析其官能團(tuán)組成。多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法測定絮凝劑中的多糖[15]。需利用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個重復(fù)所需絮凝劑約為0.01 g。蛋白質(zhì)含量測定：考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[16]，每個重復(fù)約需10 mg絮凝劑。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)初步整理，采用SAS8.0軟件對培養(yǎng)條件優(yōu)化、培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，對微生物絮凝水質(zhì)和化學(xué)絮凝后水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，并以鄧肯新復(fù)極差法對培養(yǎng)條件進(jìn)行差異顯著性多重比較，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株的篩選

分別在30和37 ℃條件下分離得到18株和23株表面光滑比較黏稠的菌株，對其進(jìn)行絮凝活性的測定，其中37 ℃下得到的菌株FD-14絮凝率最高可達(dá)80.1%。為此，本研究以其為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.1 發(fā)酵液添加量對絮凝率的影響

發(fā)酵液添加量從0.1 mL增加到1 mL時，對豬場污水的絮凝率隨發(fā)酵液添加量的增加快速提高。當(dāng)發(fā)酵液添加量為1 mL時絮凝效果最好，絮凝率可以達(dá)到80.95%（圖1）。然后，隨著發(fā)酵液添加量的繼續(xù)增加，發(fā)酵液對豬場污水絮凝率出現(xiàn)下降，說明發(fā)酵液添加量在適宜范圍才會表現(xiàn)較高絮凝性能。

圖1 絮凝劑添加量對絮凝率的影響

2.1.2 助凝劑氯化鈣添加量對絮凝率的影響

在本研究中，加入氯化鈣可以提高對豬場污水的絮凝率（圖2）。1%氯化鈣添加量在1～2 mL之間時，絮凝率隨氯化鈣添加量的增加而提高。當(dāng)氯化鈣添加量為2～3 mL時絮凝效果最好，絮凝率可以達(dá)到80.49%以上（圖2），然后，隨著氯化鈣添加量的增加，絮凝率出現(xiàn)下降，說明氯化鈣添加量也存在一個合適的范圍。

圖2 氯化鈣添加量對絮凝率的影響

2.2 菌種鑒定

經(jīng)鑒定，菌株FD-14的16S rDNA 基因全序列總長1463 bp，與芽孢桿菌屬的多個菌株具有同源性，與（KP059106.1）的同源性達(dá)到99%，說明菌株FD-14為解淀粉芽孢桿菌（）。

2.3 菌株生長曲線與絮凝曲線

由菌株FD-14發(fā)酵液的絮凝活性與菌體生長量關(guān)系可以看出，可以確定該菌發(fā)酵動力學(xué)類型屬于II型，即發(fā)酵時間與產(chǎn)物合成部分偶聯(lián)。生長曲線（圖3）表明，菌株于6 h進(jìn)入對數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期上升緩慢，78 h后其OD600開始降低；發(fā)酵液絮凝率在24 h前隨著菌的生長而緩慢上升；在24～42 h絮凝活性快速增加，隨后增加緩慢；在42～72 h時絮凝活性維持在較高水平，48 h達(dá)到最高值79.8%，72 h后絮凝活性快速下降。發(fā)酵液pH值在前6 h下降到5.8，6～24 h時維持在5.8附近，30 h時pH值上升到6.7左右，36～66 h維持在6.9上下，66～72 h時pH值下降到6.0并維持在6.0附近。

圖3 菌株FD-14生長曲線與絮凝曲線

2.4　培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

由表1可見，培養(yǎng)時間顯著影響絮凝率（<0.05），在0～48 h之間，絮凝活性隨著培養(yǎng)時間延長而增大，48 h絮凝活性最大，達(dá)77.93%，48～72 h為穩(wěn)定期，絮凝活性維持在70%以上，菌株在穩(wěn)定期大量分泌絮凝產(chǎn)物，72 h后進(jìn)入衰亡期，絮凝活性下降，衰亡期由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，絮凝產(chǎn)物可能也被降解造成衰亡期絮凝率降低。

表1 培養(yǎng)時間單因素結(jié)果

注：同一列中肩標(biāo)字母不同表示差異顯著（0.05），下同。

Note: The data with different letters in same column show significant difference (<0.05), the same as below.

由表2可知，培養(yǎng)溫度對絮凝率有顯著的影響（<0.05），培養(yǎng)溫度為33 ℃時，絮凝率最高為80.54%，隨著培養(yǎng)溫度的升高，絮凝率逐漸降低。培養(yǎng)基初始pH值對絮凝率也影響顯著（<0.05），開始時隨著培養(yǎng)基初始pH的上升，絮凝率逐漸加大，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7時絮凝率最大為80.62%，此后，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值繼續(xù)上升絮凝率隨之降低。轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響趨勢與pH值相似，轉(zhuǎn)速主要是通過改變培養(yǎng)基的溶氧量來影響菌株生長，進(jìn)而影響菌株對微生物絮凝劑合成代謝。過快或過低的轉(zhuǎn)速均不利于生物絮凝劑的合成，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時，絮凝率最高為80.35%，因此，最佳轉(zhuǎn)速確定為150 r/min。

表2 培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速和pH單因素結(jié)果

正交試驗結(jié)果（表3）表明對絮凝率影響最大的是轉(zhuǎn)速，其次是pH值，然后是溫度和時間，即轉(zhuǎn)速>pH值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間。且轉(zhuǎn)速、pH值和培養(yǎng)溫度對絮凝率的影響均達(dá)到了極顯著水平（<0.01），培養(yǎng)時間對菌株絮凝率影響不顯著，因此，選擇最少的培養(yǎng)時間D1（42 h）為其最佳培養(yǎng)時間，得出最優(yōu)組合為A2B1C2D1培養(yǎng)溫度33 ℃，pH值6.6，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間42 h。驗證試驗絮凝率為83.01%，絮凝率高于正交試驗組合，表明正交試驗優(yōu)化結(jié)果為產(chǎn)絮凝劑最佳培養(yǎng)條件。

表3 正交試驗結(jié)果與分析

表4 Duncan多重比較結(jié)果

注：**表示變量各水平多重比較時差異極顯著（<0.01）同一行肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（<0.05），下同。

Note: ** signifies the difference of variable at each level is very significant during multiple comparison at<0.01, the data with different letters on the same line show significant difference (<0.05), the same as follow.

2.4.2 培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源是影響絮凝劑產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，它直接影響絮凝劑的生產(chǎn)成本，從而限制其市場化。培養(yǎng)基不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的研究結(jié)果（表5）表明，淀粉為碳源時絮凝率均大于75.18%，麩皮為碳源時絮凝率非常低，最高不超22.41%，玉米粉為碳源時相較麩皮較好，但絮凝率最高也僅為39.79%。不同含量的淀粉對產(chǎn)絮凝劑的影響也不同（表5），適宜的淀粉濃度有利于菌株生長及代謝產(chǎn)物的積累，淀粉添加量過多時，菌株在生長過程中分解淀粉為葡萄糖，大量的葡萄糖導(dǎo)致pH值降低，胞外滲透壓上升。其中以添加20 g/L的淀粉效果最好，與標(biāo)準(zhǔn)的對照組差異不顯著（>0.05）。

氮源優(yōu)化結(jié)果表明（表5），隨著無機氮NH4Cl濃度增加，絮凝率呈現(xiàn)提高趨勢，當(dāng)其質(zhì)量濃度為3.5 g/L時絮凝率最大為67.38%，但仍顯著低于對照組（<0.05）。當(dāng)以尿素為氮源時，添加量為1.5 g/L時絮凝率最高為60.08%。而豆粕作為氮源時絮凝率最高僅為47.82%。

表5 不同碳源、氮源及其濃度對絮凝率的影響

2.5 微生物絮凝劑與化學(xué)絮凝劑在豬場污水中的應(yīng)用

生物絮凝和化學(xué)絮凝對水質(zhì)的影響見表6?？梢钥闯鑫⑸镄跄齽ωi場污水的絮凝效果顯著優(yōu)于化學(xué)絮凝劑。經(jīng)計算兩者的絮凝率分別為79.0%和62.7%。

表6 生物絮凝與化學(xué)絮凝對水質(zhì)的影響

2.6 絮凝劑成分組成

提純后的微生物絮凝劑紫外掃描圖譜如圖4所示，可以看出吸收曲線較光滑，260 nm有小的吸收峰，260 nm處無特征吸收峰，說明微生物絮凝劑中含微量蛋白，不含核酸[17]。

圖4 絮凝劑紫外光譜分析

由紅外光譜圖（圖5）可見，提純后的微生物絮凝劑具有多糖特征。因為3 100～3 700 cm-1內(nèi)有一強且寬的吸收峰，波峰在3 423.39 cm-1處為O-H鍵；2 937.03 cm-1處有一較弱的吸收峰，為飽和C-H伸縮振動的信號；在1 651.78 cm 的吸收峰是-COOH伸縮震動所致；1 400～1 500 cm-1有一吸收峰，最大吸收波長在1 408.12 cm-1，為C=C伸縮振動的吸收峰；1 200～1 400 cm-1的振動峰為C-H變角振動的吸收峰；950～1 250之間的吸收峰是2種C－O的伸縮振動引起，一種是糖環(huán)的醚鍵C-O-C，另一種是糖環(huán)中C-O-H振動引起[16,18]，而1 000～1 200 cm-1處的強吸收峰為糖類衍生物的特征峰。1 mg/mL絮凝劑溶液中絮凝劑多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定為65.96%。絮凝劑中含微量蛋白，含量為0.020 11 g/L。

圖5 絮凝劑紅外光譜分析

3 討 論

3.1 絮凝菌的分離篩選與鑒定

針對特定絮凝目標(biāo)分離篩選絮凝微生物是一項復(fù)雜的工作，選擇合適分離樣本并設(shè)計好篩選模型可大大提高篩選效率[19]。評價絮凝菌效果的重要指標(biāo)是其對污水懸浮物的絮凝沉降能力，一般原始生長環(huán)境中的微生物對它的生長環(huán)境具有適應(yīng)能力，因此，本研究采集豬場沉淀池污泥樣品篩菌。本試驗以對豬場污水懸浮物絮凝能力為指標(biāo)，在41株細(xì)菌中篩選到6株能有效絮凝場污水懸浮物的細(xì)菌，說明有針對性的采集樣本，可以提高篩選效率。

3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

每一種絮凝劑均存在最佳添加量，過多過少的添加量都會減弱絮凝效果。本試驗中，發(fā)酵液添加量過少時，可能導(dǎo)致絮凝劑分子不能有效吸附污水懸浮顆粒形成架橋[20]；當(dāng)發(fā)酵液添加量過高時，過多的絮凝劑之間存在較強的斥力抑制絮體生成[21]。因此最佳添加量為1%，絮凝率達(dá)80.95%。

絮凝過程中添加金屬離子有助凝作用，比如金屬鈣離子，這主要是因為鈣離子通過庫侖引力靠攏到帶負(fù)電荷的懸浮物顆粒形成Ca2+懸浮物復(fù)合物。通過減少相鄰懸浮物顆粒雙擴(kuò)散層厚度，減少了顆粒之間的距離，進(jìn)而促進(jìn)絮凝沉淀的發(fā)生[22]。本試驗1% CaCl2的添加量小于1 mL時，隨著添加量增加，絮凝率逐漸上升，大于1 mL時，絮凝率逐漸下降，可見CaCl2的添加量對絮凝率影響較大，添加量增大能壓縮膠體雙電層，降低靜電斥力，促進(jìn)絮凝劑的絮凝與吸附，因此，添加量最好為1 mL。

正交試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)速對絮凝率的影響最大。轉(zhuǎn)速不僅和發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解氧的濃度有關(guān)，也可影響菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)[23]。轉(zhuǎn)速過高時，發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解氧充足，微生物細(xì)胞快速增殖消耗掉大量養(yǎng)分，導(dǎo)致絮凝產(chǎn)物的生成較少；轉(zhuǎn)速過低時，發(fā)酵培養(yǎng)基中溶解氧不足，微生物競爭氧氣，影響細(xì)胞正常代謝反應(yīng)和對養(yǎng)分的吸收，從而對菌株FD-14的生長和代謝產(chǎn)物的合成造成不利影響[24]。搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min時奇異變形桿菌TJ-1的絮凝產(chǎn)物的絮凝率最高，轉(zhuǎn)速為160 r/min時地衣芽孢桿菌X14合成的微生物絮凝劑絮凝率最高[25]。菌株FD-14合成絮凝劑的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，與其他研究報道中最佳轉(zhuǎn)速相比較低[26]。

培養(yǎng)基初始pH值對生物絮凝劑的生產(chǎn)具有重要影響[27]。培養(yǎng)基初始pH值決定了表面電荷和氧化還原電位，進(jìn)而影響微生物營養(yǎng)吸收和酶反應(yīng)[28]。pH值不僅影響微生物的生長和絮凝產(chǎn)物的生成和積累，還能影響絮凝產(chǎn)物的表面電荷，進(jìn)而影響其絮凝活性。當(dāng)微生物絮凝劑在一定pH值范圍內(nèi)，膠體顆粒表面電荷有所降低，使得顆粒之間的相互斥力減弱，從而有利于絮凝劑與顆粒之間的橋聯(lián)作用，此pH值即為該絮凝劑的最佳酸堿環(huán)境。培養(yǎng)基初始pH值為7時絮凝率最大為80.62%，而正交試驗結(jié)果表明pH 值6.6時，絮凝率為83.01%，此后，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值繼續(xù)上升絮凝率隨之降低。說明該菌所產(chǎn)絮凝劑在堿性環(huán)境下絮凝效果較差，在中性近酸性環(huán)境條件下有較高的絮凝活性。

培養(yǎng)溫度是絮凝率的第三影響因素。培養(yǎng)溫度不僅能對微生物的生長和新陳代謝有影響，而且影響微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性[23]。不同的微生物生成絮凝劑的最適溫度不一樣，如奇異變形桿菌TJ-1產(chǎn)微生物絮凝劑的最佳溫度為25 ℃[29]，地衣芽孢桿菌X14產(chǎn)微生物絮凝劑的最佳溫度為37 ℃[25]。本試驗獲得的菌株FD-14產(chǎn)絮凝劑的最佳溫度為33 ℃，溫度過高導(dǎo)致菌株體內(nèi)酶的活性降低甚至喪失，影響菌株的生長代謝，造成菌株FD-14發(fā)酵液絮凝率低：溫度過低，菌株生長緩慢并導(dǎo)致體內(nèi)酶活性降低，從而減少菌體內(nèi)代謝產(chǎn)物的生成和積累，降低MF的產(chǎn)生，減少積累量，絮凝率降低。

3.3 微生物絮凝劑與化學(xué)絮凝劑在豬場污水中的應(yīng)用

微生物絮凝劑與化學(xué)絮凝劑對豬場污水絮凝效果對比（表6）表明，微生物絮凝劑顯著優(yōu)于化學(xué)絮凝劑?；瘜W(xué)絮凝劑絮凝污水主要是電中和作用[30]。微生物絮凝劑具有鏈狀結(jié)構(gòu)，分子上的活性基團(tuán)（羥基和羧基基團(tuán)）為污水懸浮物提供吸附位點[31]，相對于無機絮凝劑，微生物絮凝劑可以更有效的絮凝豬場污水。此外，污水處理廠大規(guī)模應(yīng)用無機絮凝劑如聚合氯化鋁會引發(fā)健康風(fēng)險[25]。微生物絮凝劑產(chǎn)生菌FD-14來自豬場沉淀池污泥，所產(chǎn)絮凝劑對如污泥pH值、鹽度等特性，具有良好的適應(yīng)性，且具有易生物降解、高效無毒等突出優(yōu)點，是具有廣闊的應(yīng)用前景的新型高效絮凝劑。

本試驗獲得的絮凝劑產(chǎn)生菌適應(yīng)豬場污水原始pH值，絮凝前所取水樣pH值7.93，微生物絮凝后所取水樣pH值7.64，絮凝率達(dá)79.0%。同時，對豬場污水濁度和COD的去除率分別達(dá)到80%和48.6%，而崔亞楠篩選的菌株xn17所產(chǎn)絮凝劑需調(diào)節(jié)豬場污水pH值到9.5時，對豬場污水濁度和COD的去除率分別為80%和47%[31-32]。微生物絮凝劑產(chǎn)生菌FD-14不需要調(diào)節(jié)pH值就能達(dá)到相似的絮凝結(jié)果從而降低處理成本，是一株較好的絮凝豬場污水懸浮物的絮凝菌。

3.4 絮凝劑成分分析

通過紫外光譜分析、紅外光譜分析、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法對絮凝劑成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該絮凝劑是富含羥基和羧基的多糖類絮凝劑，這與文獻(xiàn)中微生物絮凝劑多半以多糖為主，且富含的羥基和羧基對絮凝效果有重要作用的報道一致[16-17,33]。

4 結(jié) 論

1）從污泥中篩選到一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌FD-14，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。其產(chǎn)生的具有絮凝活性的發(fā)酵液，在助凝劑氯化鈣最佳添加量為0.02 g/mL條件下，優(yōu)選菌株添加體積分?jǐn)?shù)為1%，對豬場污水的絮凝率可達(dá)80%。

2）菌株FD-14產(chǎn)生物絮凝劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH值6.6，溫度33 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時間42 h。工業(yè)化生產(chǎn)最優(yōu)培養(yǎng)基為：淀粉2 g/mL，酵母粉0.5 g/mL和牛肉膏0.2 g/mL，硫酸鎂0.2 g/mL，氯化鈉1g/mL，磷酸氫二鉀0.5g/mL，磷酸二氫鉀0. g/mL。

3）菌FD-14分泌產(chǎn)生的主要物質(zhì)是多糖，含微量蛋白，因此具有很強的熱穩(wěn)定性，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.96%。

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Isolation and identification of flocclant producing strain and its application for swine wastewater clarification

Zhang Luxin1, LuChen2, Li Lvmu1,2※, Xu Yayuan1, Liang Jun1, Diao Huan1, Ding Weimin3

(1.230036; 2.230036; 3.242200)

An efficient flocculant producing strain was isolated, which could effectively flocculate suspended matter in piggery wastewater.The sludge from piggery sewage sedimentation tank was selected as the screening material.Screening was carried out by dilution plate method and screening medium.Colonies with smooth, large and sticky surfaces were selected.Then the plate was used to isolate and purify the strain, and then inoculated into the liquid medium.The flocculation rate of swine wastewater treated by bacterial fermentation liquid as index was rescreened.Finally, a flocculant producing bacterial strain FD-14 was obtained and identified by 16S rDNA.First, single factor experiments were conducted on the culture conditions, in order to determine the influence of 4 factors on the flocculation activity, such as culture temperature, pH value, rotational speed and time,L9 (34) orthogonal design was used to optimize the culture conditions of the strain.The culture conditions were optimized: Temperature: 30, 33 and 36 ℃; pH vale: 6.6, 7, 7.4; speed: 120, 150, 180 r/min, and incubation time: 42, 48, 54 h.Then the single factor experiment was used to optimize the carbon and nitrogen source of the medium.By using ultraviolet spectroscopy, infrared spectroscopy, phenol sulfuric acid method and Coomassie brilliant blue method was used to analyze the components of flocculant. Under the optimal conditions, strain FD-14 was cultured and fermentation broth was used as a crude flocculant, which had been applied to practical swine farm wastewater treatment. The results showed that FD-14 was identified asbased on 16S rDNA gene sequencing. The optimum culture conditions of strain FD-14 were 33 ℃, initial pH value 6.5, rotational speed of 150 r/min, and 42 h incubation. The results showed that strain FD-14 could use starch as an alternative inexpensive carbon source for the fermentation medium, the flocculation rate of 80.80% was not significantly different (>0.05) from the original standard medium. The effect of substituting inexpensive nitrogen sources was poor; the flocculation rate of the best, ammonium chloride, was 67.38%, which was significantly less than the original standard medium (<0.05). According to the practical application results on a swine farm, the flocculation rates of the microbial and chemical flocculants of the swine farm wastewater were 79.0% and 62.7%, respectively. The flocculation rate of the microbial flocculant was 16.3% higher than that of the chemical flocculant. Analysis using UV and IR spectroscopy, the phenol sulfuric acid method, and the Coomassie brilliant blue method of flocculant composition revealed that the polysaccharide flocculant was rich in hydroxyl and carboxyl groups. Strain FD-14 mainly secreted 65.96% polysaccharide substances, but the protein content was minimal, so it had strong heat stability.In this study, it could be concluded that bioflocculant-producing bacteria with high flocculating activity and flocculation might be used for flocculation of swine farm wastewater.

screening; wastewater; purification; Bacillus amyloliquefaciens; flocculant; flocculation characteristics

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.031

S18

A

1002-6819(2017)-20-0250-07

2017-03-29

2017-10-10

國家星火計劃重點項目（2014GA710002）

張魯新，主要從事微生物學(xué)研究。Email：791535996@qq.com

※通信作者：李呂木，男，安徽和縣人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事畜牧微生物與動物營養(yǎng)研究。Email：llm56@ahau.edu.cn

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