銀丹心腦通軟膠囊對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NPY表達(dá)的影響

王敏

血管性癡呆是腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征，是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病。銀丹心腦通軟膠囊中的銀杏葉、丹參、大蒜等有效成份結(jié)合能擴(kuò)張血管，促進(jìn)血液循環(huán)，預(yù)防和消除動(dòng)脈粥樣硬化。本研究采用血管夾閉法(4-VO法)復(fù)制VD大鼠血管性癡呆模型，初步探討血管性癡呆影響學(xué)習(xí)記憶可能機(jī)制以及YDXNT對(duì)AD的防治作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器 YDXNT(本室自制，HPLC測定純度為90%);丙二醛(MDA)測定試劑盒、免疫組化試劑盒(北京中杉生物工程有限公司)，羊多克隆NPY抗體(南京建成生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康SD大鼠30只，3～4月齡，雄性，體質(zhì)量200～250g，由煙臺(tái)綠葉制造集團(tuán)提供。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham組)、VD模型組(VD組)、YDXNT處理組(YDXNT+VD組)。動(dòng)物模型制備采用4-VO法建立VD大鼠模型。模型成功后YDXNT組灌胃:YDXNT軟膠囊每粒中1/3量，溶于生理鹽水15 ml，使之均勻，取1 ml灌胃，3次/d，連續(xù)4周，Sham組與VD組均灌胃等量生理鹽水;6周后，開始測定。

1.2.2 模型的建立 采用大鼠4-VO法制成VD大鼠模型:將大鼠用10%的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。用4號(hào)絲線結(jié)扎。在距尾尖1cm處剪斷放血約0.3 ml熱凝止血。阻斷血流20 min，松開絲扣再灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，切口局部注射慶大霉素0.2萬U。對(duì)照組只分離頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，尾部不放血。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力行為學(xué)測定 定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4 d，每天上、下午定時(shí)各訓(xùn)練1次，檢測大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間及游泳路徑長度，第5天撤除平臺(tái)作空間搜索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從同一入水點(diǎn)放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠在原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間及原平臺(tái)所在象限游泳距離占總距離的百分比。

1.2.4 海馬組織NPY檢測方法 取血后，結(jié)扎胸主動(dòng)脈，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管，快速灌注300～400 ml磷酸鹽緩沖液沖洗腦組織至流出液體澄清，繼之灌注4℃的4%多聚甲醛溶液灌注過程中動(dòng)物四肢抽動(dòng)，全身發(fā)白，逐漸變硬，持續(xù)灌注30～60 min，然后剝離腦，置于同濃度多聚甲醛溶液中后固定12 h以上。修塊，取海馬腦片，梯度乙醇脫水二甲苯透明，石蠟包埋后，行冠狀切片，片厚約4μm。每只大鼠選取含室旁核海馬切片3～5張，用涂有多聚賴氨酸載玻片撈片。以下Fos蛋白檢測按試劑盒要求進(jìn)行。采用LeicaQWin細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)在PAG隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)算NPY免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物的平均光密度(MOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0 for Windows軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

表1 尋找平臺(tái)所需潛伏期組間比較( ± s，n=10)

表1 尋找平臺(tái)所需潛伏期組間比較( ± s，n=10)

注:與sham組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與VD組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天6.0 VD組 114.30±18.71＊＊ 98.43±20.53＊＊ 91.34±19.80＊＊ 85.80±20.32＊＊YDXNT+VD組 91.22±20.51＊△ 71.00±16.80＊△△ 55.12±12.66＊＊△△ 30.23±13.35 sham組 67.25±22.42 53.16±15.23 29.20±11.23 10.41±＊＊△△

2 結(jié)果

2.1 空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測試結(jié)果 (1)大鼠尋找平臺(tái)所需潛伏期及搜索距離均有隨訓(xùn)練進(jìn)程縮短的趨勢。(見表1、表2)。(2)VD組和YDXNT+VD組與假手術(shù)組比較，在定位航行實(shí)驗(yàn)中大鼠的逃避潛伏期及搜索距離明顯延長(P＜0.05或P＜0.01，表1、2);在空間探索實(shí)驗(yàn)中，兩組在原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間明顯減少(P＜0.01，表3)，提示4-VO法建立VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退。(3)YDXNT+VD組與VD組比較，YDXNT+VD組在定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期及搜索距離縮短(P＜0.01，表1、2)，在空間探索實(shí)驗(yàn)中YDXNT+VD組原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間較VD組延長，(P ＜0.05或 P ＜0.01，表 1、2、3)，提示 YDXNT 對(duì)血管性癡呆引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶的減退有一定的恢復(fù)作用。2.2 銀丹心腦通軟膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬NPY表達(dá)的影響。光鏡觀察免疫組織化學(xué)切片，海馬NPY免疫反應(yīng)物質(zhì)呈程度不等的棕黃色或棕褐色，主要分布于神經(jīng)細(xì)胞胞漿，呈卵圓形、圓形或多角形，胞核呈藍(lán)色，核仁清晰可見。MOD值越高說明表達(dá)越強(qiáng)，反映細(xì)胞內(nèi)NPY表達(dá)量越多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:VD模型組與針刺組大鼠海馬NPY表達(dá)明顯低于Sham組(P＜0.05，表4);其中VD組大鼠海馬NPY表達(dá)又低于與Sham組比較;與VD模型組比較，YDXNT+VD組海馬NPY表達(dá)明顯升高(見表4)。

表2 空間探索距離組間比較± s，n=10)

表2 空間探索距離組間比較± s，n=10)

注:與sham組比較＊＊P＜0.01;與VD組比較△△P＜0.01

組別空間探索距離(cm)第1天 第2天 第3天 第4天05 315.62±26.87 VD組 2881.43±193.55＊＊ 2611.17±160.50＊＊ 2341.24±191.35＊＊ 1831.53±143.22＊＊YDXNT+VD組 2345.08±156.28＊＊△△ 1804.22±135.46＊＊△△ 1643.45±213.11＊＊△△ 900.64±132.39 sham組 1220.87±169.44 1203.42±158.73 620.41±100.＊＊△△

表3 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組在原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間的比較 ± s，n=10)

表3 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組在原平臺(tái)所在象限的搜索時(shí)間的比較 ± s，n=10)

注:與sham組比較＊＊P＜0.01;與VD組比較△△P＜0.01

組別 空間探索時(shí)間(s)46.15±12.31 VD 組 18.23±5.54＊＊YDXNT+VD組 27.53±14.16 sham組＊＊△△

表4 銀丹NP心Y腦通軟膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬表達(dá)的影響 ± s，n=10)

表4 銀丹NP心Y腦通軟膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬表達(dá)的影響 ± s，n=10)

注:與sham組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與VD組比較△△P＜0.01

組別85.66±8.45 VD 組 52.23±9.22＊＊YDXNT+VD組 75.42±7.58 MOD sham組＊△△

3 討論

銀丹心腦通軟膠囊中的銀杏葉、丹參、大蒜的有效成份結(jié)合能擴(kuò)張血管，促進(jìn)血液循環(huán)，預(yù)防和消除動(dòng)脈粥樣硬化;絞股藍(lán)、燈盞細(xì)辛、三七、天然冰片有效成份聯(lián)合能清除血液循環(huán)系統(tǒng)的垃圾，降低血脂及血黏度，修復(fù)受損腦組織，促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞的生長，防治腦梗死。銀杏葉、大蒜、山楂、三七有效成份聯(lián)合能快速緩解頭暈、眼花、煩躁失眠等心腦血管病初期癥狀。近年來研究表明銀丹心腦通軟膠囊通過降血脂、抗炎等機(jī)制防治早期動(dòng)脈粥樣硬化［1］。芮銘安等［2］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)銀丹心腦通能使血漿比黏度、全血比黏度、紅細(xì)胞比容降低。降低腦血管阻力，增加腦血流量;促進(jìn)大腦半球經(jīng)胼胝體的信息傳遞，可改善腦組織因缺氧造成的腦損傷，具有促進(jìn)腦內(nèi)代謝作用，對(duì)缺氧所致的逆行性遺忘有改進(jìn)作用，可以增強(qiáng)記憶，提高學(xué)習(xí)能力，具有激活、保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。銀丹心腦通軟膠囊能通過改變NPY的表達(dá)量來改善腦缺血缺氧造成的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。

［1］盧仁榮，陳曉曦.銀丹心腦通軟膠囊對(duì)冠心病患者血脂及高敏C反應(yīng)蛋白的影響.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(9):1093-1094.

［2］芮銘安，孫赟，柏金喜，等.銀丹心腦通軟膠囊對(duì)PCI后心絞痛的療效觀察.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(1):87-89.