采后ABA處理促進‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖愈傷形成

李雪，吳覺天，王毅，姜紅，畢陽，司敏，張靜榮，徐潔

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采后ABA處理促進‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖愈傷形成

李雪，吳覺天，王毅，姜紅，畢陽，司敏，張靜榮，徐潔

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，蘭州 730070）

研究外源ABA處理對采后‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖愈傷效果的影響，分析苯丙烷代謝及抗氧化酶在愈傷中的作用機理。以‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖為試材，人工損傷后用不同濃度脫落酸（ABA）處理，評價處理塊莖在常溫（（20±3）℃，濕度（80±5）%）及黑暗條件下的愈傷效果，分析100 mg?L-1ABA處理后塊莖傷口處組織苯丙烷代謝關鍵酶活性和代謝產(chǎn)物積累以及過氧化物酶和多酚氧化酶的活性變化，掃描電鏡觀察傷口處愈傷組織的形成過程.不同濃度ABA處理均有效促進了塊莖愈傷，其中以100 mg?L-1的處理效果最好。ABA處理能顯著提高塊莖傷口處組織苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酰-輔酶A-連接酶和肉桂醇脫氫酶的活性，并能使總酚、類黃酮和木質素的含量增加，其中，苯丙氨酸解氨酶的活性呈現(xiàn)雙峰型變化，在處理后的第3天和第9天分別高出同期對照253.07%和125.18%。此外，總酚和類黃酮含量在處理后第6天分別較同期對照高出48.60%和50.42%。ABA處理還明顯增強了塊莖傷口處組織中的過氧化物酶和多酚氧化酶活性。掃描電鏡觀察結果表明，ABA處理促進了塊莖傷口表面愈傷封閉層和周皮的形成。外源ABA處理可通過促進馬鈴薯塊莖傷口處組織的苯丙烷代謝，提高過氧化物酶和多酚氧化酶活性，加速馬鈴薯塊莖愈傷周皮的形成。

馬鈴薯塊莖；愈傷；ABA；苯丙烷代謝；抗氧化酶

0 引言

【研究意義】馬鈴薯（L.）是重要的糧菜兼用作物，但其塊莖在采收及采后過程中易遭受機械損傷[1]，表面的傷口為各類致腐病原物的侵染提供了通道，病害發(fā)生不僅導致貯藏期間塊莖大量損失，而且會在塊莖體內積累真菌毒素，造成食用的安全隱患[2]。馬鈴薯塊莖表面的傷口具有自我愈合能力，即在傷口處形成愈傷周皮，從而有效抑制塊莖失水、減輕致腐病原物造成的危害[3]。然而，塊莖自然愈傷所需的時間偏長，傷口完全愈合通常需要2—3周時間[4]，露天存放偏長的時間往往會使塊莖受凍，并增加人工看護的成本。生產(chǎn)中多在沒有完全愈傷的情況下入貯馬鈴薯塊莖，致使貯藏期間的腐爛率居高不下。因此，縮短愈傷時間、提高愈傷效率是馬鈴薯貯藏中亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】馬鈴薯塊莖的愈傷形成過程包括形成封閉層和形成傷口周皮兩個步驟[3]，多層栓化細胞構成了致密的保護屏障，從而避免或減輕真菌和細菌病原物侵襲[5-6]。脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要的植物激素，在提高植物抗逆性中具有積極的作用[7]。有研究表明，馬鈴薯塊莖損傷后ABA代謝相關基因表達量迅速增加[8]，內源ABA參與了馬鈴薯塊莖的傷口愈合[9]，對上述的兩個愈傷步驟均有重要影響[10]。內源ABA還可介導番茄的木栓化，促進果實莖疤組織的形成[11]。此外，外源ABA可誘導馬鈴薯塊莖切片及愈傷組織的木栓化[12-13]，促進聚酚軟木質的積累，提高塊莖的早期愈傷能力[14]。外源ABA促進采后番茄果實的傷口愈合與增強苯丙烷代謝活性，提高超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性密切相關[15-16]。【本研究切入點】雖然外源ABA在促進馬鈴薯塊莖愈傷中的作用已有報道，但處理后馬鈴薯塊莖傷口處苯丙烷代謝如何系統(tǒng)參與該過程，過氧化物酶和多酚氧化酶如何在其中發(fā)揮作用，以及塊莖傷口表面組織結構如何形成尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】以西北地區(qū)主栽品種‘隴薯3號’馬鈴薯為試材，人工模擬創(chuàng)傷后用不同濃度ABA處理，在常溫條件下（20—25℃，RH 80±5%）下進行愈傷誘導，研究處理對馬鈴薯塊莖愈傷效果的影響，分析處理對愈傷期間苯丙烷代謝關鍵酶活性和產(chǎn)物積累，以及過氧化物酶和多酚氧化酶活性的影響，掃描電鏡觀察處理后塊莖傷口表面組織結構的變化，為馬鈴薯的快速愈傷提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖，2015年10月13日采自甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)。揀選大小均勻、無損傷且無病蟲害的塊莖當天運回甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室，于（7±2）℃下貯藏待用。ABA購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 ABA溶液的配制 分別取ABA 2.5、5、10、20 mg，加少量乙醇溶解后，定容至100 mL，配制成濃度分別為25、50、100和200 mg?L-1的穩(wěn)定溶液，在避光低溫條件下保存待用。

1.2.2 塊莖愈傷及處理 參照姜紅等[17]的方法。用自來水清洗塊莖表面，在1.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，清水沖洗后，于室溫下晾干待用。在塊莖表皮刮出大小為2 cm×2 cm的傷口，每個塊莖3處傷口。

將上述5個濃度的ABA溶液以及蒸餾水對照分別用移液槍吸取20 μL，注在傷口表面，并涂抹均勻，放置10 min直至晾干，裝入扎有小孔的大小25 cm×40 cm，厚度0.02 mm的聚乙烯保鮮袋中，置于（20±3）℃，（80±5）% RH的黑暗環(huán)境下進行愈傷誘導。

1.2.3 愈傷效果評價 測定不同濃度ABA處理后第6天的木質素含量，以評價塊莖愈傷效果。木質素含量的測定參見1.2.5。每個處理用塊莖20個，重復3次。

1.2.4 酶活性的測定

1.2.4.1 取樣 參照楊志敏等[18]方法。在100 mg?L-1ABA處理后第0、3、6、9、12天時，分別取塊莖傷口處栓化周皮及其下2—3 mm處組織3 g，液氮速凍后，在-80℃下冷凍保存待用。

1.2.4.2 苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia lyase，PAL）的活性測定 參照YIN等[19]方法。稱取冷凍組織3 g，加入5 mL提前預冷的硼酸緩沖液（100 mmol?L-1、pH 8.8）。在研缽中充分研磨后，4℃離心（11 250 r/min 20 min），取上清液4℃保存?zhèn)溆?。加? mL L-苯丙氨酸和500 μL上清液，于37℃下反應1 h，測定290 nm處的吸光值，空白加500 μL蒸溜水，其余同反應體系。酶活性以每小時內吸光度變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

1.2.4.3 肉桂酸羥化酶（cinnamic acid hydroxylase，C4H）活性的測定 參照LAMB等[20]方法并略作修改。稱取冷凍組織3 g，在研缽中充分研磨后，加入5 mL提前預冷的提取液，超聲波中反應2 min，用紗布過濾，離心（9 000 r/min 20 min、4℃），分別取上述上清液和緩沖液0.8 mL和2.0 mL混勻。于25℃下振蕩反應30 min，再加入100 μL的HCl（6 mol?L-1）終止反應，離心（9 000 r/min 10 min、4℃），取上清液在340 nm處測定其吸光度。酶活性以每小時變化0.01為一個酶活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

1.2.4.4 4-香豆酰-輔酶A-連接酶（4-coumaroyl- coenzyme A-ligase，4CL）活性的測定 參照SCHOCH 等[21]方法略作修改。稱取冷凍組織3 g，加入提前預冷的Tris-HCl緩沖液5 mL，冰浴下研磨成勻漿，用紗布過濾，離心（11 250 r/min 20 min、4℃），取0.5 mL上清液，加0.45 mL Mg2+（15 μmol?L-1）、0.15 mL p-香豆酸（5 μmol?mL-1）、0.15 mL ATP（50 μmol?mL-1）和0.15 mL CoA（1 μmol?mL-1）后，在333 nm處測定其吸光度。酶活性以每分鐘內變化0.1為1個活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

1.2.4.5 肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活性的測定 參照GOFFNER等[22]方法略作修改。稱取冷凍組織3 g，加入提前預冷的磷酸緩沖液5 mL，冰浴下研磨成勻漿，4℃離心（12 500 r/min 25 min），取上清液。分別取上清液和反應液（NADP 1 mL、反式肉桂酸1.4 mL）0.6 mL和2.4 mL，37℃溫浴30 min，加入200 μL HCl（1 mol?L-1）終止反應，在340 nm處測定其吸光度。每分鐘變化0.001吸光度值為一個酶活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

1.2.4.6 過氧化物酶（Peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的測定 POD活性的測定參照Bao等[23]方法。稱取冷凍組織3 g，加入預冷的磷酸緩沖液5 mL，冰浴下研磨成勻漿，離心（11 250 r/min 20 min、4℃），取上清液。2.5 mL愈創(chuàng)木酚（25 mmol?L-1），200 μL H2O2（250 m mol?L-1）和200 μL上清液，反應15 s后記錄470 nm處的吸光度變化，測定持續(xù)2 min。酶活性以每分鐘內吸光度變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

PPO活性的測定參照YIN等[19]方法。稱取冷凍組織3 g，加入磷酸緩沖液3 mL，冰浴條件下研磨成勻漿，離心（15 000 r/min 20 min、4℃），取上清液。2 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）、100 μL粗酶提取液、0.5 mL鄰苯二酚。24℃溫育2 min，測定420 nm處的吸光度。酶活性以每分鐘內吸光度變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U?mg-1protein。

1.2.4.7 蛋白含量的測定 參照BRADFORD[24]的考馬斯亮藍法，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白作標準曲線，計算蛋白含量。

1.2.5 總酚、類黃酮及木質素含量的測定 參照包改紅等[25]方法。稱取冷凍組織3 g，加入提前預冷的HCl-甲醇（1%）6 mL，在研缽中充分研磨后，轉入離心管，置于暗處4℃下反應20 min，離心（9 000 r/min 10 min、4℃），取上清液測定吸光值?？偡优c類黃酮含量分別表示為OD280?g-1FW和OD325?g-1FW。

參照姜紅等[17]的方法測定木質素含量。稱取冷凍組織3 g，加入提前預冷的乙醇（95%）5 mL，在研缽中充分研磨后，離心去上清，用乙醇沖洗，沉淀在60℃烘箱中干燥24 h，與1 mL溴化乙酰冰醋酸溶液（25%）反應后，70℃溫浴30 min，用1 mL NaOH（2 mol?L-1）中止反應。加入0.1 mL羥胺鹽酸（7.5 mol?L-1）和2 mL冰醋酸，離心，用乙酸定容。木質素含量以OD280?g-1FW表示。

上述各項測定指標均重復3次。

1.2.6 塊莖愈傷表面結構的觀察 參照ALBA等[26]方法。用手術刀分離塊莖傷口處的愈傷周皮，切成大小為5 mm×5 mm的組織塊，乙醇中浸泡10 min后，平鋪在含有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用N2輕吹2 h，制片后在掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 全部數(shù)據(jù)采用Excel 2007計算平均值和標準誤（±SE），采用SPSS 19.0進行Duncan’s多重差異顯著性分析。

2 結果

2.1 不同濃度ABA處理的愈傷效果及100 mg?L-1ABA處理后塊莖傷口處木質素含量的變化

不同濃度ABA處理后可顯著促進塊莖傷口處的木質素積累。但處理間木質素的含量差異較大，在25—100 mg ?L-1，處理濃度越高木質素含量越大，當處理濃度為100 mg?L-1時，處理的木質素含量高出對照48.47%。但隨著處理濃度的進一步增加，木質素含量不再繼續(xù)提高，當濃度高達300 mg?L-1時，木質素含量反而降低（圖1-A）。100 mg?L-1ABA處理后，塊莖傷口處木質素含量的上升趨勢與對照基本一致，處理后第9天時達到最大，處理的含量始終高于對照（圖1-B）。

不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different letters show significant differences (P＜0.05). The same as below

2.2 100 mg?L-1 ABA處理對塊莖苯丙烷代謝關鍵酶活性及其代謝產(chǎn)物的影響

2.2.1 對PAL、C4H、4CL和CAD活性的影響 愈傷期間，處理和對照塊莖傷口處的PAL活性均呈雙峰型變化，處理塊莖的PAL活性均顯著高于對照。在處理后的第3天和第9天分別高出同期對照253.07%和125.18%（圖2-A）。處理塊莖的C4H活性在愈傷期間顯著高于對照，處理后第6天較同期對照提高了1.5倍（圖2-B）。ABA提高了傷口處的4CL活性，處理后第9天的活性高于同期對照74.78%（圖2-C）。處理塊莖的CAD活性在愈傷后期顯著高于對照，處理后第9天時高于同期對照46.49%（圖2-D）。

圖2 100 mg?L-1 ABA處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處PAL(A)、C4H(B)、4CL(C)和CAD(D)活性的影響

2.2.2 對總酚和類黃酮含量的影響 處理塊莖的總酚含量在愈傷的中后期顯著高于對照，處理后第6天高于對照48.60%（圖3-A）。同樣，處理塊莖的類黃酮含量在愈傷期間也高于對照，處理后第6天高出對照50.42%（圖3-B）。

2.3 ABA處理對塊莖POD和PPO活性的影響

處理塊莖的POD活性在愈傷期間顯著高于對照，處理后第12天高出同期對照53.23%（圖4-A）。同樣，處理塊莖的PPO活性在愈傷的中后期顯著高于對照，處理后第9天為同期對照1.4倍（圖4-B）。

圖3 100 mg?L-1 ABA處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處總酚(A)和類黃酮(B)含量的影響

圖4 100 mg?L-1 ABA處理對愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處POD(A)和PPO(B)活性變化的影響

2.4 ABA處理對塊莖傷口表面愈傷組織形成的影響

ABA處理明顯促進了傷口處的組織愈合（圖5）。處理當天，傷口處開放，淀粉粒完全暴露，處理后第3天，傷口處已有明顯的網(wǎng)狀封閉層，并且還在繼續(xù)生成新細胞，而此時對照塊莖剛可見封閉層；處理后第6天，處理的周皮形成，而同期對照周皮則初步形成；處理后第9天，處理的細胞壁厚度和強度進一步提升，形成致密的保護層，愈傷周皮完全成熟，對照此時也形成了愈傷周皮。

3 討論

有研究表明，外源ABA可部分調控馬鈴薯的塊莖愈傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理可促進‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖的愈傷，該過程與增強苯丙烷代謝關鍵酶活性，促進總酚、類黃酮和木質素的積累，提高POD和PPO活性密切相關。本研究也得出苯丙烷代謝和抗氧化酶積極參與外源ABA促進馬鈴薯塊莖愈傷的過程。

苯丙烷代謝在塊莖愈傷周皮的形成中具有積極的貢獻[27]。PAL是苯丙烷代謝的限速酶，催化苯丙氨酸轉化為肉桂酸[28]，在愈傷組織的形成中具有關鍵作用[29]。ABA可通過促進馬鈴薯基因的表達，加速塊莖的木栓化過程[14]。此外，ABA還可有效提高塊莖愈傷組織中的PAL活性[13]。ABA處理可顯著提高塊莖PAL活性，且呈現(xiàn)雙峰型變化（圖2-A），表明PAL積極參與了塊莖愈傷期間封閉層和傷口周皮的形成[3]。該結果與ABA處理后馬鈴薯塊莖愈傷組織中PAL活性增強的結果類似[14]。C4H是苯丙烷代謝途徑中向各分支途徑轉折的關鍵酶，催化反式肉桂酸轉化為對-香豆酸，對-香豆酸對木質素和類黃酮等的合成具有積極的調控作用[30]。本研究所發(fā)現(xiàn)的ABA處理顯著提高愈傷塊莖C4H活性的結果（圖2-B），與前人在菊芋塊莖愈傷期間C4H活性提高的結果類似[31]。4CL經(jīng)苯丙烷代謝的最后一步反應，生成相應的硫酯，進入木質素合成途徑[32]。CAD是木質素生物合成的關鍵酶[33]。甘薯在生物和非生物脅迫下的組織特異性木質化中發(fā)揮重要作用[34]。本試驗中發(fā)現(xiàn)的ABA處理提高馬鈴薯塊莖4CL和CAD活性的結果與外源ABA促進采后番茄果實4CL和CAD活性結果類似[16]。木質素可通過形成交織網(wǎng)，使細胞相連，強化細胞壁，從而形成抵御病原物侵染的保護屏障[35-36]。木質素和H2O2的積累參與了甘薯傷口的愈合，通過調節(jié)愈傷相關的miR828，抑制和的表達，從而提高木質素和H2O2的積累，促進甘薯傷口的愈合[37]。作為植物的抗菌組分，總酚和類黃酮在提高植物對病原物侵染的抗性中發(fā)揮了重要作用[38]。損傷可促進塊莖酚類物質的積累，增加抗氧化能力[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA處理可有效促進塊莖愈傷組織中木質素、總酚和類黃酮的積累，該結果與前人采用ABA促進采后番茄愈傷的結果基本一致[16]。

S：淀粉粒；C：封閉層；P：周皮 S: Starch grain; C: Closing layer; P: Periderm

POD是一種血紅素蛋白由單一肽鏈與卟啉構成，能夠介導酚酸類物質聚合生成木質素，增強細胞壁強度，抵抗病原物侵入[40]，在調控馬鈴薯塊莖愈傷周皮的形成中發(fā)揮至關重要的作用[41]。有報道指出，ABA可促進馬鈴薯塊莖的栓化，提高POD活性[13]，還能誘導馬鈴薯和番茄愈傷組織中POD轉錄物的積累[42]。這些結果與本研究結果基本一致（圖4-A）。PPO能夠將酚類物質氧化成對病原物毒性更強的醌類物質，降低果蔬被真菌侵染的程度[43]。許多生物、非生物因素都可誘導PPO活性[44]，在生長發(fā)育過程中馬鈴薯通過增加PPO mRNA的積累來響應創(chuàng)傷信號[45]。ABA處理可有效促進塊莖愈傷期間PPO活性的增加，該結果與前人用ABA處理番茄的研究結果類似[46]。

馬鈴薯塊莖的愈傷過程包括形成封閉層和形成傷口周皮兩個步驟，前者是傷口表面細胞的栓化，而后者是在封閉層下形成傷口周皮[6]。封閉層及傷口周皮的形成均會提高塊莖對病原物侵染的抗性。在本研究中觀察到，ABA處理明顯促進了塊莖傷口處的組織愈合，ABA處理馬鈴薯塊莖傷口后，網(wǎng)狀結構迅速形成并栓化，開始形成封閉層，該階段不涉及傷口表面的細胞分裂。隨著封閉層形成的完成，傷口周皮開始形成，其中出現(xiàn)的具有分生組織活性的木栓形成層可分裂形成多層栓化細胞，進而構成了愈傷組織的木栓層和栓內層（圖5-B）。該過程與SABBA等[47-48]觀察到的軟木脂在細胞壁積累的結果基本類似。

4 結論

外源脫落酸（ABA）處理可有效促進‘隴薯3號’馬鈴薯塊莖的愈傷，最佳處理濃度為100 mg?L-1。ABA處理能顯著提高塊莖傷口處組織苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酰-輔酶A-連接酶和肉桂醇脫氫酶的活性，促進總酚、類黃酮和木質素的積累，提高塊莖傷口處組織的過氧化物酶和多酚氧化酶活性。在ABA的作用下，塊莖傷口處組織迅速愈合，封閉層和愈傷周皮迅速形成。由此表明，外源ABA可通過促進馬鈴薯塊莖傷口處的苯丙烷代謝，提高抗氧化酶活性來加速塊莖的愈傷形成。

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（責任編輯 趙伶俐）

Postharvest ABA Treatment Promote Wound Healing of Potato ‘Longshu No.3’ Tubers

LI Xue, WU Juetian, WANG Yi, JIANG Hong, BI Yang, SI Min, ZHANG Jingrong, XU Jie

(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)

The experiment was conducted to study the effects of exogenous abscisic acid (ABA) treatment on wound healing of the potato tubers ‘Longshu No.3’, to analyze the role of phenylpropane metabolism and antioxidant enzymes in wound healing.The potato cultivar ‘Longshu No.3’ was used as materials. The tubers were artificially damaged, then treated with different concentrations ABA, and healed under dark condition ((20±3)℃, RH (80±5)%). The healing ability of treated tubers was evaluated. The changes of activity of phenylpropane metabolism key enzymes, peroxidase and polyphenol oxidase were determined. The content of metabolites was determined at wounded site of tubers treated with 100mg?L-1ABA during healing. The formation of healing tissue was observed by scanning electron microscopy.ABA treatment at different concentrations effectively promoted wound healing of tubers, the screened optimum concentration was 100 mg?L-1. ABA treatment at 100 mg?L-1significantly increased the activity of phenylalnine ammonialyase, cinnamic acid hydroxylase, 4-coumaroyl-coenzyme A-ligase and cinnamyl alcohol dehydrogenase, sped the accumulation of total phenols, flavonoids and lignin at wounded site of tubers. In which,the activity of phenylalanine ammonialyase showed bimodal change, the treatment was 253.07% and 125.18% higher than the control after 3 days and 9 days of healing. The content of total phenols and flavonoids of the treatment showed 48.60% and 50.42% higher than that of the control. Moreover, the activities of peroxidase and polyphenol oxidase were significantly enhanced at wounded site of tubers. Observation of scanning electron microscopy showed that the formation of closing layer and wound periderm of tubers were accelerated after ABA treatment.Exogenous ABA treatment accelerates the formation of wound periderm of potato tubers by promoting the phenylpropane metabolism, and increasing the activities of peroxidase and polyphenol oxidase.

potato tubers; wound healing; abscisic acid; phenylpropane metabolism; antioxidant enzyme

2017-05-12；接受日期：2017-08-22

國家自然科學基金（3157102083）、國家自然科學基金（地區(qū)科學基金）（31460412）、馬鈴薯產(chǎn)業(yè)體系（CARS-10-P18）

李雪，Tel：18309472812；E-mail：1641919938@qq.com。通信作者畢陽，Tel：13119421362；E-mail：biyang@gsau.edu.cn