基于轉(zhuǎn)錄組信息的黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分析

嚴莉，王翠平，陳建偉，喬改霞，李健

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基于轉(zhuǎn)錄組信息的黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分析

嚴莉1,2，王翠平2，陳建偉2，喬改霞2，李健2

（1寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021；2寧夏林業(yè)研究院種苗生物工程國家重點實驗室，銀川 750004）

MYB基因家族是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物的生長發(fā)育和代謝調(diào)控過程。目前仍沒有針對枸杞等木本作物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)分析。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定分析黑果枸杞MYB基因家族，可為該類基因生物學(xué)功能和代謝調(diào)控機制的研究提供參考?；诤诠坭睫D(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)，利用NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個數(shù)據(jù)庫和NCBI網(wǎng)站，對黑果枸杞MYB基因進行篩選注釋；利用Web Logo3、Prot Comp 9.0、MEGA5.0軟件進行保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位和系統(tǒng)進化等生物信息學(xué)分析?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析MYB基因在黑果枸杞果實不同發(fā)育期的差異表達模式，并采用熒光定量PCR方法進行驗證。基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，注釋得到83個黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因，根據(jù)結(jié)構(gòu)特性將其分為4大類：R2R3-MYB、1R-MYB、3R-MYB和4R-MYB。結(jié)構(gòu)域分析表明：R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的R2 MYB基序中包含3個極度保守的色氨酸殘基，R3 MYB基序中的第一個色氨酸殘基被疏水氨基酸替代。比較分析黑果枸杞MYB家族和擬南芥MYB家族共同構(gòu)建的進化樹發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞的MYB家族在進化上包括3個大類，6個亞類。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，44個MYB轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞質(zhì)中，37個定位于細胞核中?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的MYB差異表達模式分析表明，黑果枸杞MYB基因可能參與了果實不同發(fā)育時期花青素變化的調(diào)控；基于熒光定量PCR的差異表達數(shù)據(jù)進一步驗證了部分MYB轉(zhuǎn)錄因子在果實不同發(fā)育時期的花青素合成中可能起到調(diào)控作用。黑果枸杞MYB基因家族注釋得到83個黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因，為進一步研究MYB家族的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

黑果枸杞；轉(zhuǎn)錄組測序；MYB家族；分層聚類分析；表達模式

0 引言

【研究意義】MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物的生理生化過程，包括植物表皮細胞分化、氣孔發(fā)育、類黃酮生物合成、非生物脅迫及病原體抗性等[1]。黑果枸杞（Murr）是茄科枸杞屬植物，花青素含量豐富[2]?；ㄇ嗨貙兕慄S酮類化合物，是構(gòu)成植物花或果實顏色的主要水溶性色素之一[3-5]。對黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進行分析鑒定，可為黑果枸杞MYB基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，為研究MYB基因?qū)诠坭筋慄S酮或花青素的代謝調(diào)控提供重要借鑒。【前人研究進展】MYB基因家族是最大的植物基因家族之一，其成員都具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即MYB結(jié)構(gòu)域[6-8]。通常根據(jù)其所含高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù)量將MYB類轉(zhuǎn)錄因子分為1R-MYB（1R-MYB和MYB-Related）、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB[9]。自PAZ-Ares等[10]從玉米中分離出第一個植物MYB轉(zhuǎn)錄因子（Clorless1）后，學(xué)者先后從金魚草[11]、棉花[12]、大豆[13]、擬南芥[14]、蘋果[15]和白菜[16]等植物中鑒定得到功能各異的MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于陸生植物中[17]，并有學(xué)者在多種植物中發(fā)現(xiàn)其參與了植物的次生代謝過程，如擬南芥可上調(diào)查爾酮合成酶和黃酮醇合成酶基因的表達，從而提高類黃酮化合物的積累[18]，通過正向調(diào)控的表達提高植物中花青素的含量[19]；紅沙梨中和通過與形成三元復(fù)合體調(diào)控花青素的生物合成[20]；金魚草中可抑制植物次生代謝途徑中重要可溶性酚酸的合成[21]；可與共同瞬時表達來誘導(dǎo)小麥高原115白色胚芽鞘中花青素的合成[22]。此外，大量研究結(jié)果表明R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子可響應(yīng)非生物脅迫如干旱、低溫、鹽及紫外輻射等，Zhang等[23]通過克隆小麥并構(gòu)建過表達擬南芥植株，發(fā)現(xiàn)其可提高植株在發(fā)芽期和幼苗期的耐旱性[23]；Zhu等[24]分別構(gòu)建過表達和RNA干擾的水稻植株，發(fā)現(xiàn)過表達植株較野生型植株具有更強的耐鹽性，而RNA干擾的水稻植株耐鹽性較野生型植株明顯減弱，這與YANG等[25]對的研究結(jié)果一致；CHENG等[26]發(fā)現(xiàn)過表達的馬鈴薯植株對鹽、紫外及干旱脅迫的耐性顯著提高。另外，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子還參與植物生殖發(fā)育過程調(diào)控，可通過調(diào)節(jié)植物絨氈層的發(fā)育來調(diào)控花粉發(fā)育[27]。關(guān)于其他3類MYB轉(zhuǎn)錄因子功能的研究多集中在脅迫響應(yīng)方面，番茄中1R-MYB蛋白可通過調(diào)節(jié)氣孔開閉來適應(yīng)高鹽環(huán)境[28]；水稻和小麥既可調(diào)控細胞周期，也可響應(yīng)干旱脅迫[29]；（1R-MYB）可提高小麥對條紋繡菌的抗性[30]；擬南芥（3R-MYB）可與GSK3樣激酶BIN2共同作用來抑制油菜素類固醇信號通路中的表達[31]。【本研究切入點】目前對枸杞屬植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能研究很少，僅有一篇外文文獻報道了在黑果枸杞果實發(fā)育過程中MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達升高，未有學(xué)者對枸杞屬植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進行過系統(tǒng)分析，因此，有必要對枸杞屬植物黑果枸杞的MYB家族進行全面分析和鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于不同發(fā)育時期黑果枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選并鑒定出黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，全面分析其基因結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育等信息，同時研究MYB家族成員在果實發(fā)育不同時期的差異表達模式，為后續(xù)研究黑果枸杞中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2016年在寧夏林業(yè)研究院種苗生物工程國家重點實驗室進行。

1.1 材料

黑果枸杞（Murr）為寧夏黑果枸杞，樹齡為3年，常規(guī)栽培管理。于2016年7月12日選取生長健康、長勢良好的黑果枸杞植株（組培苗扦插繁育）做標記，于開花后25 d開始采摘青果期果實，40 d后采摘轉(zhuǎn)色期果實，58 d后采摘成熟期果實（果實大小、飽滿度一致），3棵植株的果實為一個重復(fù)，各采收3個重復(fù)，材料采集后立即置于液氮中速凍，存于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 果實總RNA提取、文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 用植物總RNA提取試劑盒（RNA Prep Pure Plant Kit，天根生化科技有限公司，北京，中國）分別提取黑果枸杞不同發(fā)育時期果實的總RNA，并用NanoDrop- 2000（Thermo Scientific，上海，中國）分光光度計檢測RNA純度（OD260/280比值），通過Qubit（恒斐生物科技有限公司，上海，中國）對RNA濃度進行精確定量，后用Agilent 2100（Stratagene，LaJolla，CA，USA）精確檢測RNA的完整性，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳，樣品檢測合格后送到北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，后續(xù)分析基于此測序結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.2.2 黑果枸杞和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選 基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個數(shù)據(jù)庫進行注釋，初步注釋到137個MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，將這些基因編碼蛋白逐個進行NCBI Blast和SMART預(yù)測，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到83個具有MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。根據(jù)Dubos等[9]對擬南芥MYB基因家族的分類方法（依據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子所含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)目分類），分別將候選序列歸類到1R-MYB（1R-MYB和MYB-Related）、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子中。擬南芥蛋白序列從TAIR （http://www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫中下載獲得。

1.2.3 黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子家族保守域、亞細胞定位及進化關(guān)系分析 利用序列分析軟件clustal X 2.0對32個黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子進行多序列比對，去除保守結(jié)構(gòu)域之外的區(qū)域，通過在線軟件Web Logo3[32]（http://weblogo.Threeplusone. com/）對R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行基序分析；利用在線軟件Prot Comp 9.0（http://linux. softberry.com）對83個候選MYB基因家族各成員的氨基酸序列進行亞細胞定位預(yù)測分析；利用MEGA5.0軟件對83個黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白和部分功能明確的擬南芥MYB家族蛋白（共33個，包括R2R3-MYB 27個，1R-MYB 6個）進行序列比對，并用鄰位（Neighbor-Joining）算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行Bootstrap測試，重復(fù)設(shè)置為1 000。

圖1 黑果枸杞3個發(fā)育時期果實（青果、紫果和黑果）

1.2.4 黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達模式分析與驗證 黑果枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序文庫中各基因片段表達量的計算使用RPKM（Reads per kb per million）法[33]。采用Heml軟件對83個MYB轉(zhuǎn)錄因子在果實3個發(fā)育期的表達數(shù)據(jù)進行分層聚類分析。以黑果枸杞3個發(fā)育期果實為材料，共選取12個在果實轉(zhuǎn)色期上、下調(diào)明顯的MYB轉(zhuǎn)錄因子進行實時熒光定量PCR。各樣品RNA 采用第1鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa，大連，中國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，選用枸杞作內(nèi)參，其GenBank登錄號為HQ415754，采用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量引物（序列見表1），反應(yīng)體系為：模板cDNA 2 μL（10 ng·μL-1），正、反向引物各1 μL（10 μmol·L-1），SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201, TOYOBO，大阪，日本）10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品做3個重復(fù)。所用儀器為美國安捷倫MX3000P（Stratagene，LaJolla，CA，USA）實時熒光定量PCR儀，相對表達量的計算采用2-ΔΔCT方法[34]。

表1 實時熒光定量PCR所用到的引物

2 結(jié)果

2.1 黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選與蛋白序列的分類分析

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，在NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個數(shù)據(jù)庫進行注釋，初步注釋到137個MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，通過NCBI Blast和SMART預(yù)測，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到83個黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子。

對所得83條MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進行批量SMART預(yù)測，并根據(jù)Dubos等[9]對擬南芥MYB基因家族的分類方法，按照每個MYB轉(zhuǎn)錄因子所包含的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域類型分別將其歸類到1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子類別中，最終鑒定出黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子32個，1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子45個，3R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子4個和4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子2個。

2.2 黑果枸杞R2R3-MYB類蛋白保守基序分析

利用clustal X 2.0對所得32個黑果枸杞R2R3- MYB類轉(zhuǎn)錄因子進行多序列比對，去除DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外的不保守區(qū)域，對其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行基序分析。從圖2黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的R2 MYB基序圖可知其約含52個氨基酸殘基，包括3個極度保守的色氨酸殘基（W），由R3 MYB基序圖可知其所含3個極度保守色氨酸殘基（W）中的第一個色氨酸殘基（圖2箭頭處）被苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）以及亮氨酸（L）所替代，其他兩個色氨酸殘基也高度保守。此外，在R2和R3 MYB結(jié)構(gòu)域中還存在其他保守氨基酸殘基，如結(jié)構(gòu)域起始的賴氨酸（K）、甘氨酸（G）和精氨酸（R）殘基、R2結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸（K）、絲氨酸（S）、甘氨酸（G）、半胱氨酸（C）、精氨酸（R）和亮氨酸（L），以及R3結(jié)構(gòu)域中的亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）、蘇氨酸（T）、精氨酸（R）、天冬氨酸（D）和天冬酰胺（N）殘基。這些保守的氨基酸殘基可能與色氨酸殘基共同維持黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，進而發(fā)揮特定功能。

圖2 黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域

2.3 黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位分析

通過在線軟件Prot Comp 9.0（http://linux1. Softberry.com）對83個黑果枸杞MYB基因家族各成員的氨基酸序列進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果如圖3所示，共有44個候選MYB基因位于細胞質(zhì)中，其中1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子多達34個，占候選基因總數(shù)的77.27%，這些MYB類轉(zhuǎn)錄因子可能參與細胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；37個位于細胞核中，其中R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子多達24個，占候選基因總數(shù)的64.9%，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子多數(shù)通過調(diào)控細胞核基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮功能；3R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因和4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因分別定位于細胞核和細胞質(zhì)中，其可能分別參與細胞質(zhì)基因和細胞核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，由于本研究得到的3R-MYB和4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量少，因此還需更多后續(xù)研究來探究其在細胞中的分布規(guī)律；另外通過亞細胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)和位于細胞質(zhì)膜，其可能參與細胞質(zhì)膜某些功能基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖3 黑果枸杞MYB基因家族的亞細胞定位預(yù)測

2.4 黑果枸杞與擬南芥MYB類轉(zhuǎn)錄因子的進化關(guān)系與功能預(yù)測分析

利用MEGA5.0軟件構(gòu)建黑果枸杞和擬南芥MYB蛋白家族的系統(tǒng)進化樹，根據(jù)進化樹（圖4）的拓撲結(jié)構(gòu)將兩個物種的MYB家族蛋白進行聚類分析，共分為3大類（I、Ⅱ、Ш），其中第一大類又分為兩個亞類，包含24個黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白，占黑果枸杞總R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的72.7%，且有18個R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白位于同一個進化亞枝，這與其N端MYB保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致。此外，由于完整的序列比對不僅包括保守的N端，也與各序列的C端密切相關(guān)，因此還有9個R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白分散位于第Ⅱ、Ш大類。由圖可得，LrMYB3與AtMYB51相鄰，LrMYB42與AtMYB37、AtMYB38和AtMYB87相鄰且位于同一進化亞枝上，LrAN2、LrMYB81、LrMYB93和LrMYB96與擬南芥AtMYB61進化關(guān)系較近，推測他們可能具有相似的功能。

1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白分散位于3大類MYB家族蛋白中，尤其在Ⅱ、Ш大類中居多，占黑果枸杞總1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的73.3%，可能由于1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子包括1R-MYB和其他MYB相關(guān)蛋白，結(jié)構(gòu)多樣導(dǎo)致其在進化樹上分布范圍最廣，其中LrMYB16與擬南芥AtMYB0、AtMYB72和AtMYB123位于同一進化亞枝。3R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白包括LrMYB17、LrMYB18、LrMYB19和LrMYB70，其中LrMYB17和LrMYB18相鄰且與AtMYB91位于同一進化亞枝，LrMYB70與AtMYB62相鄰；4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白包括LrMYB12和LrMYB32，其中LrMYB12與AtMYB105相鄰，而LrMYB32與AtMYB24進化關(guān)系較近。

圖4 黑果枸杞和擬南芥MYB類蛋白家族的進化分析

此圖基于黑果枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的計算得出，每種顏色代表相應(yīng)表達量的數(shù)值，數(shù)值越大，表達量越高

2.5 黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在果實不同發(fā)育期的表達模式分析

基因的表達模式與基因的功能關(guān)系密切，據(jù)此從黑果枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的基因表達數(shù)據(jù)庫中提取83個MYB家族基因在果實3個發(fā)育期（青果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期）的表達數(shù)據(jù)，采用Heml軟件對這些基因的差異表達進行分層聚類分析（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著果實的發(fā)育成熟，黑果枸杞各MYB基因的表達模式表現(xiàn)出差異化，共有16個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因隨果實的發(fā)育成熟表達上調(diào)，其中和上調(diào)表達較明顯；共有32個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在果實發(fā)育的青色期到轉(zhuǎn)色期表達上調(diào)，而在果實發(fā)育的轉(zhuǎn)色期到成熟期表達下調(diào)；共有28個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因隨果實的發(fā)育成熟表達下調(diào)，其中和的下調(diào)表達較明顯；共有7個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的表達在果實發(fā)育的青色期到轉(zhuǎn)色期及轉(zhuǎn)色期到成熟期表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢。選取從果實青色期到轉(zhuǎn)色期表達上調(diào)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因7（）和表達下調(diào)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因5個（和），采用熒光定量PCR，在黑果枸杞3個發(fā)育時期果實中進行差異表達分析（圖6），結(jié)果表明所選12個黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子的表達變化隨果實發(fā)育各不相同，其中的表達在果實青色期到轉(zhuǎn)色期明顯升高；而和的表達在果實青色期到轉(zhuǎn)色期明顯降低，但其表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所得的表達模式相符合。

圖6 黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的實時熒光定量PCR

3 討論

由于枸杞全基因組序列還未釋放，在很大程度上限制了控制其重要性狀基因的研究。

通過對黑果枸杞R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域進行基序分析，得出其R2 MYB基序中包含3個極度保守的色氨酸殘基，且這3個色氨酸殘基之間的間隔分別為23和19個氨基酸殘基。其中前兩個色氨酸殘基之間的間隔比杜海[35]描述的植物中R2R3- MYB類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域基序中色氨酸殘基的間隔多4個氨基酸殘基，說明在黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的R2 MYB基序中發(fā)生氨基酸殘基的插入，該區(qū)域可能是黑果枸杞R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子分子進化和功能分化的活躍區(qū)。而R3 MYB基序中的第一個色氨酸殘基被疏水氨基酸（苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）所代替，其他兩個色氨酸殘基仍存在，且相互間隔18個氨基酸殘基。這與成舒飛[36]和Matus[37]等在大豆和水稻中對R3 MYB基序的分析結(jié)果一致，暗示MYB基因家族的N端在不同科植物間的高度保守性。本研究對黑果枸杞R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域進行基序分析，為研究枸杞屬及茄科植物的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能進化提供基礎(chǔ)。

基因表達模式與基因功能關(guān)系密切，因此可通過研究黑果枸杞果實成熟過程中基因表達的變化來發(fā)現(xiàn)花青素合成過程中的功能基因。MYB轉(zhuǎn)錄因子被證實可作為調(diào)控基因參與植物花青素的生物合成代謝，Gulati等[38]發(fā)現(xiàn)可能通過調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達來調(diào)節(jié)植株花青素含量的變化；Sornkanok等[39]通過克隆鑒定蘋果中R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，認為其可作為一種調(diào)控蛋白調(diào)節(jié)植物花青素的生物合成過程。本文基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析MYB轉(zhuǎn)錄因子在黑果枸杞果實不同發(fā)育期的差異表達模式，從中篩選出16個隨果實發(fā)育表達上調(diào)的MYB轉(zhuǎn)錄因子和28個表達下調(diào)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，說明它們可能在在黑果枸杞果實花青素的生物合成中起著正向或負向調(diào)節(jié)作用，同時發(fā)現(xiàn)隨果實轉(zhuǎn)色變化的表達趨勢與Zeng等[1]在黑果枸杞果實發(fā)育5個時期的表達趨勢一致，為研究黑果枸杞中參與花青素生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的分離和功能研究提供基礎(chǔ)。

擬南芥中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究已比較透徹，、和參與調(diào)控擬南芥中吲哚硫代葡萄糖苷的生物合成[40]，參與植物種皮和毛狀體發(fā)育[41]，、、和參與了植物花青素的合成調(diào)控途徑[42-44]。有學(xué)者認為可根據(jù)進化樹中位于同一進化枝中的擬南芥蛋白功能預(yù)測研究物種蛋白的功能，Matus等[38]通過構(gòu)建擬南芥與葡萄、水稻的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹，將位于相鄰位置上的葡萄、水稻和擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子列為具有相同或相似結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，從而推測其功能的一致性。本研究用所得83個黑果枸杞MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白與33個功能明確的擬南芥MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白作系統(tǒng)進化樹，根據(jù)與33個擬南芥MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白進化關(guān)系的遠近推測黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能，如LrMYB3與AtMYB51相鄰，根據(jù)擬南芥AtMYB51的功能推測LrMYB3可能參與了吲哚硫代葡萄糖苷的生物合成[40]；推測LrMYB32可能與AtMYB24功能一致，參與了雄蕊的發(fā)育[45]；LrMYB7與擬南芥AtMYB90和AtMYB113進化關(guān)系較近，可能參與花青素代謝調(diào)控[43]，這與根據(jù)果實不同發(fā)育時期的差異表達模式推測得到的LrMYB7的功能具有一定的相關(guān)性，證明了相鄰或較近進化關(guān)系上的蛋白有可能具有相同或相似的功能，為研究MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能提供一種思路，同時也說明了MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中的保守性。

4 結(jié)論

本研究基于黑果枸杞不同發(fā)育時期果實的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選注釋出83個黑果枸杞MYB轉(zhuǎn)錄因子基因；通過分析黑果枸杞MYB基因家族的保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位、進化關(guān)系和隨果實發(fā)育的表達模式，較為系統(tǒng)地鑒定了黑果枸杞MYB基因家族。MYB基因家族結(jié)構(gòu)保守，家族成員在果實發(fā)育不同時期呈現(xiàn)不同的表達模式。

[1] ZENG S, WU M, ZOU C, LIU X, SHEN X, HAYWARD A, LIU C, WANG Y. Comparative analysis of anthocyanin biosynthesis during fruit development in twospecies., 2014, 150(4): 505-516.

[2] 郝媛媛, 頡耀文, 張文培, 寧寶山, 路新軍. 荒漠黑果枸杞研究進展. 草業(yè)科學(xué), 2016, 33(9): 1835-1845.

HAO Y Y, JI Y W, ZHANG W P, YU B S, LU X J. The research progress on desert., 2016, 33(9): 1835-1845. (in Chinese)

[3] 陳?？? 蒲凌奎, 曹君邁, 任賢.黑果枸杞的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(5): 155-157.

CHEN H K, PU L K, CAO J M, REN X. Current research state and exploitation ofMurr, 2008(5): 155-157. (in Chinese)

[4] 雙全, 張海霞, 盧宇, 劉燕. 野生黑果枸杞化學(xué)成分及抗氧化活性研究. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(4): 94-100.

SHUANG Q, ZHANG H X, LU Y, LIU Y. The research on chemical component and antioxidant activity of wild, 2017, 38(4): 94-100. (in Chinese)

[5] 夏園園, 莫仁楠, 曲瑋, 柳文媛. 黑果枸杞化學(xué)成分研究進展. 藥學(xué)進展, 2015, 32(5): 351-356.

XIA Y Y, MO R N, QU W, Liu W Y. Research progress in chemical constituents ofMurr., 2015, 32(5): 351-356. (in Chinese)

[6] AMBAWAT S, SHARMA P,YADAV N R, YADAV R C. MYB transcription factor genes as regulators for plant responses: an overview., 2013, 19(3): 307-321.

[7] LAI B, DU L N, LIU R, Hu B, SU W B, QIN Y H, ZHAO J T, WANG H C, HU G B. Twotranscription factors interacting withandduring anthocyanin accumulation., 2016, 7(212): 166.

[8] SALIH H, GONG W F, HE S P, Sun G F, SUN J L, DU X M. Genome-wide characterization and expression analysis of MYB transcription factors in., 2016, 17(1): 129.

[9] DUBOS C, STRACKE R, GROTEWOLD E, WEISSHAAR B, MARTIN C, LEPINIEC L. MYB transcription factors in., 2010, 15(10): 573-581.

[10] PAZ-ARES J, GHOSAL D, WIENAND U, PETERSON PA, SAEDLER H. The regulatorylocus of Zea mays encodes a protein with homology to MYB-related proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators., 1988, 6(12): 3553-3558.

[11] WAITES R, SELVADURAI H R, OLIVER I R, HUDSON A. Thegene encodes a MYB transcription factor involved in growth and dorsoventrality of lateral organs in., 1998, 93(5): 779-789.

[12] LOGUERICO L L, ZHANG J Q, WILKINS T A. Differential regulation of six novel MYB-domain genes defines two distinct expression patterns in allotetraploid cotton (L.)., 1999, 261(4): 660-671.

[13] MIYAKE K, ITO T, SENDA M, ISHIKAWA R, HARADA T, NIIZEKI M, AKADA S. Isolation of a subfamily of genes for R2R3-MYB transcription factors showing up-regulated expression under nitrogen nutrient-limited conditions., 2003, 53(1): 237-245.

[14] CHEN Y, YANG X, HE K, LIU M H, LI J G, GAO Z F, LIN Z Q, ZHANG Y F, WANG X X, QIU X M, SHEN Y P, ZHANG L, DENG X H, LUO J C, DENG X W, CHEN Z L, GU H Y, QU L J. The MYB transcription factor superfamily of: Expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family., 2006, 60(1): 107-124.

[15] TAKOS A M, JAFFE F W, JACOB S R, BOGS J, ROBINSON S P, WALKER A R. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples., 2006, 142(3): 1216-1232.

[16] 向珣, 曹家樹, 葉紈芝, 崔輝梅, 俞建濃. 白菜相關(guān)MYB家族新基因的克隆與特征分析. 遺傳, 2007, 29(5): 621-628.

XIANG X, CAO J S, YE W Z, CUI H M, YU J N. Molecular cloning and characterization of, a novel member of the MYB family involved in OguCMS in., 2007, 29(5): 621-628. (in Chinese)

[17] 朱婷婷, 梁東, 夏惠. R2R3-MYB調(diào)控果實花色苷合成的研究進展. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(4): 985-991.

ZHU T T, LIANG D, XIA H. Progress in the study of the regulation of anthocyanin synthesis by R2R3-MYB in fruits., 2016, 35(4): 985-991. (in Chinese)

[18] MEHRTENS F, KRANZ H, BEDNA P, WEISSHAAR B. The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonol-specific regulator of phenylpropanoid biosynthesis., 2005, 138(2): 1083-1096.

[19] LOTKOWSKA M E. Functional analysis of MYB112 transcription factor in the model plant., 2014.

[20] FENG S Q, SUN S S, CHEN X L, WU S J, WANG D Y, CHEN X S. PyMYB10 and PyMYB10.1 interact with bHLH to enhance anthocyanin accumulation in pears., 2015, 10(11): e0142112.

[21] 李瑩. 金魚草中R2R3-MYB基因的克隆及其功能研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院大學(xué), 2015.

LI Y. Cloning and functional analysis of the R2R3-MYB transcription factorsin[D]Beijing:, 2015. (in Chinese)

[22] 葉廣繼, 張波, 陳文杰, 劉寶龍, 張華剛. 紫粒小麥高原115中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析. 分子植物育種, 2016, 8(8): 1940-1947.

YE G J, ZHANG B, CHEN W J, LIU B L, ZHANG H G. Cloning and functional analysis of the R2R3-MYB transcription factorsin the purple wheat variety Gaoyuan 115., 2016, 8(8): 1940-1947. (in Chinese)

[23] ZHANG L, ZHAO G, XIA C, JIA J, LIU X, KONG X. A wheat R2R3-MYB gene,, improves drought stress tolerance in transgenic., 2012, 63(63): 5873-5885.

[24] ZHU N, CHENG S, LIU X, DU H, DAI M, ZHOU D X, YANG W, ZHAO Y. The R2R3-type MYB genehas a function in coordinating plant growth and salt stress tolerance in rice., 2015, 10(236): 146-156.

[25] YANG A, DAI X, ZHANG W H. A R2R3-type MYB gene,, is involved in salt, cold, and dehydration tolerance in rice., 2012, 63(7): 2541-2556.

[26] CHENG Y J, KIM M D, DENG X P, KWAK S S, CHEN W. Enhanced salt stress tolerance in transgenic potato plants expressing, a sweet potato transcription factor., 2013, 23(12): 1737-1746.

[27] HIGGINSON T, LI S F, PARISH R W.regulates tapetum and trichome development in., 2003, 35(2): 177-192.

[28] CAMPOS J F, CARA B, MARTIN F, PINEDA B, EGEA I, FLORES F B, FERNANDEZ G N, CAPEL J, MORENO V, ANGOSTO T, LOZANO R, BOLARIN M C. The tomato mutant(altered response to salt stress 1) identifies an R1-type MYB transcription factor involved in stomatal closure under salt acclimation., 2016, 14(6): 1345-1356.

[29] BALDONI E, GENGA A, COMINELLI E. Plant MYB transcription factors: Their role in drought response mechanisms., 2015, 16(7): 15811-15851.

[30] ZHANG Z J, CHEN J M, SU Y Y, LIU H M, CHEN Y G, LUO P G, DU X G, WANG D, ZHANG H Y. TaLHY, a 1R-MYB transcription factor, plays an important role in disease resistance against stripe rust fungus and ear heading in wheat., 2015, 10(5): e0127723.

[31] YE H, YIN Y. MYBL2 is a substrate of GSK3-like kinase BIN2 and acts as a corepressor of BES1 in brassinosteroid signaling pathway in., 2012, 109(49): 20142-20147.

[32] CROOKS G E, HON G, CHANDONIA J M, BRENNER S E. Web Logo: a sequence logo generator., 2004, 14(6): 1188-1190.

[33] FENG C, CHEN M, XU C J, BAI L, YIN X R, LI X, ALLAN A C, FERGUSON L B, CHEN K S. Transcriptomic analysis of Chinese bayberry () fruit development and ripening using RNA-Seq., 2012, 13(1): 13-19.

[34] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT-method., 2001, 25(4): 402-408.

[35] 杜海. 植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的分子進化機制及調(diào)控類黃酮生物合成MYB基因的鑒定[D]. 四川: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

DU H. Molecular evolution of MYB transcription factor gene family in plants and characterization of the MYB genes involved in flavonoid biosynthesis. Sichuan: Sichuan Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[36] 成舒飛, 端木慧子, 陳超, 劉艾林, 肖佳雷, 朱延明. 大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析. 大豆科學(xué), 2016, 35(1): 52-57.

CHENG S F, DUAN MU H Z, CHEN C, LIU A L, XIAO J L, ZHU Y M. Whole genome identification of soybean MYB transcription factors and bioinformatics analysis., 2016, 35(1): 52-57. (in Chinese)

[37] MATUS J T, AQUEA F, JOHNSON P. Analysis of the grape MYB R2R3 subfamily reveals expanded wine quality-related clades and conserved gene structure organization acrossandgenomes., 2008, 8(1): 83.

[38] GULATI S, PADGETT W J.MYB75/PAP1 transcription factor induces anthocyanin production in transgenic tomato plants., 2008, 35(7): 606-618.

[39] VIMOLMANGKANG S, HAN Y P, WEI G C, KORBAN S. An apple MYB transcription factor,, is involved in regulation of anthocyanin biosynthesis and flower development., 2013, 13(1): 176.

[40] FRERIGMANN H, GLAWISCHNIG E, GIGOLASHVILI T. The role of,and., 2004, 3(6): 587-591.

[41] Li S F, MILLIKEN O N, PHAM H, SEYIT R, NAPOLI. Thetranscription factor regulates mucilage synthesis, seed coat development, and trichome morphogenesis., 2009, 21(1): 72-89.

[42] ZULUAGA D, GONZALI S, LORETI E, PUCCIARIELLO C, DEGLINNOCENTI E, GUIDI L, ALPI A, PERATA P.MYB75/PAP1 transcription factor induces anthocyanin production in transgenic tomato plants., 2008, 35(7): 606-618.

[43] VELTEN J, CAKIR C, CAZZONELLI C I. A spontaneous dominant-negative mutation within a 35S:transgene inhibits flower pigment production in tobacco., 2010, 5(3): e9917.

[44] HEPPEL S C, JAFFE F W, TAKOS A M, SCHELLMANN S, RAUSCH T, AMANDA W. Identification of key amino acids for the evolution of promoter target specificity of anthocyanin and proanthocyanidin regulating MYB factors., 2013, 82(5): 457-471.

[45] YANG X Y, LI J G, PEI M, L G J, P M, GU H, CHEN Z L, QU L G. Over-expression of a flower-specific transcription factor genecauses aberrant anther development., 2007, 26(2): 219-228.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Analysis of MYB Transcription Factor Family Based on Transcriptome Sequencing inMurr

YAN Li1, 2, WANG CuiPing2, CHEN JianWei2, QIAO GaiXia2, LI Jian2

(1College of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021;2State Key Laboratory of Seedling Bioengineering, Ningxia Forestry Institute, Yinchuan 750004)

MYB is one of the most common transcription factor families in plants. It is widely involved in plant growth, and metabolic regulations. So far, there is no systematic analysis of the MYB transcription factor family of tree crops. Analysis of MYB family based on the transcriptome data inMurr. was conducted in this study, which laid a foundation for the research on biological function, and mechanism of metabolic regulations of MYB genes.Based on the transcriptome sequencing (RNA-Seq) data, the NR, NT, Swiss-Prot, PFAM and NCBI sites were used at the same time to screen and classify the MYB genes ofMurrThe Web Logo3, Prot Comp 9.0, and MEGA5.0 were also applied to conservative structure prediction, subcellular localization, and phylogenetic analysis. The expression pattern of MYB genes related to fruit development was obtained and Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the specific expression of those genes.Based on the transcriptome sequencing (RNA-Seq) data, 83 transcription factors of MYB family were annotated, selected, and divided into four categories (R2R3-MYB, 1R-MYB, 3R-MYB and 4R-MYB) according to their structural characteristics. The R2 MYB motif of the R2R3-MYB transcription factor contains three highly conserved tryptophan residues, and the first tryptophan residue in the R3 MYB motif is replaced by some hydrophobic amino acids. The phylogenetic trees of MYB family ofMurrandwere constructed, which showed that the MYB family ofMurrcontained three major branches, and six evolutionary branches. The result of the subcellular localization demonstrated that 44 MYB transcription factors were located in the cytoplasm, and 37 MYB transcription factors were located in the nucleus. The analysis of differential expression of MYB genes ofMurr. based on transcriptome sequencing (RNA-Seq) showed that MYB genes might be involved in the regulation of anthocyanin in three fruit development periods. Additionally, differential expression data based on fluorescence quantitative PCR confirmed that some MYB transcription factors might play a role in the regulation of anthocyanin synthesis in different fruit development periods ofMurr..83 transcription factors of MYB family were annotated ofMurrThe findings have laid a foundation for further studies of the structures and biological functions of MYB family.

; RNA-Seq; MYB family; hierarchical clustering analysis; expression pattern

2017-05-27；接受日期：2017-08-22

國家自然科學(xué)基金（31660045）、國家國際科技合作專項（2015DFA90900）、寧夏自然科學(xué)基金（NZ16215）

嚴莉，E-mail：18295085526@163.com。通信作者王翠平，E-mail：wangcuipingcas@163.com。通信作者李健，E-mail：lijian0630@aliyun.com