拮抗根癌土壤桿菌的桃內(nèi)生細(xì)菌的篩選鑒定

李昱佳，李茜,2，張志想，李世訪

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拮抗根癌土壤桿菌的桃內(nèi)生細(xì)菌的篩選鑒定

李昱佳1，李茜1,2，張志想1，李世訪1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京100193）

從對根癌病具有獲得抗性（SAR）的桃單株“西北13-1”的枝條內(nèi)分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌，分析其種群組成并從中篩選拮抗根癌土壤桿菌的高效生防菌，為桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌資源。首先，將根癌土壤桿菌（）接種到“西北13-1”的桃樹枝條上，并以無菌水接種作為對照；然后，分別于接種前、接種后10 d和接種后60 d采集接種處理和對照處理的“西北13-1”枝條。表面消毒桃樹枝條樣品后采用涂布平板法分離內(nèi)生細(xì)菌；并結(jié)合16S rDNA序列鑒定，比對初步鑒定菌株，分析內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及組成差異。采用平板拮抗法、溫室防病效果測定篩選拮抗根癌土壤桿菌的活性菌株，通過生理生化測定和分子鑒定，明確其分類地位。為揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用機(jī)制，通過電擊轉(zhuǎn)化將含有GFP基因的pBBR1MCS-2質(zhì)粒導(dǎo)入拮抗菌株中，然后進(jìn)行GFP標(biāo)記菌株對根癌土壤桿菌的抑菌試驗(yàn)、生長動(dòng)力學(xué)分析、穩(wěn)定性測試。采用灌根法提前接種標(biāo)記菌株菌懸液，第2天接種根癌土壤桿菌菌懸液，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡和平板稀釋法研究標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖情況。從“西北13-1”桃枝條中共分離到108株內(nèi)生細(xì)菌，基于16S rDNA序列，這些菌株分別屬于伽馬變形菌類（Gammaproteobacteria）、阿爾法變形菌類（Alpharoteobacteria）、放線菌類（Actinobacteria）、厚壁菌類（Firmicutes）、擬桿菌（Bacteroidetes），共計(jì)5個(gè)細(xì)菌類群17個(gè)屬，顯示了桃樹枝條中內(nèi)生細(xì)菌豐富的種群多樣性。其中，伽馬變形菌類的腸桿菌屬（）、泛菌屬（）和根瘤菌屬（）最多，其數(shù)量在接種根癌土壤桿菌后顯著上升，包含了14株產(chǎn)抑菌圈的拮抗菌中的10株細(xì)菌。經(jīng)鑒定，篩選出的兩株抑菌活性較高、具有生防潛力的拮抗菌10DM4-1和10DI2-2分別為泛菌（）和腸桿菌（），它們可顯著抑制向日葵根癌瘤的形成，防治效果分別為86.08%和89.87%。標(biāo)記菌株10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根番茄后，可在根部細(xì)胞間隙觀察到目標(biāo)菌落，標(biāo)記菌株的數(shù)量在0—10 d時(shí)呈現(xiàn)急劇下降趨勢，最后保持相對穩(wěn)定的較低水平（104CFU/g），說明了它們在番茄根組織內(nèi)具有良好的生存和定殖能力。桃“西北13-1”的內(nèi)生菌中存在著能夠拮抗根癌土壤桿菌的細(xì)菌，這些具有拮抗活性的菌株與桃“西北13-1”具有根癌病抗性有關(guān)。分離得到的泛菌10DM4-1和腸桿菌10DI2-2可能通過產(chǎn)拮抗物質(zhì)、占據(jù)根部有利生態(tài)位拮抗根癌土壤桿菌。

桃根癌病；內(nèi)生細(xì)菌；拮抗菌；生物防治；定殖

0 引言

【研究意義】桃樹根癌病是由根癌土壤桿菌（）引起的、嚴(yán)重危害桃生產(chǎn)的一種細(xì)菌性病害[1]。生物防治是目前防控根癌病最有效的方法，但以K84及其遺傳改造菌株K1026[2-5]為代表的根癌病生防制劑有一定的局限性，只能通過搶先占領(lǐng)果樹傷口位點(diǎn)、產(chǎn)土壤桿菌素Agrocin 84保護(hù)植物傷口來阻止根癌土壤桿菌的入侵。植物體內(nèi)存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，它們是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對寄主植物具有防病、促生、固氮和生物修復(fù)等作用[6-8]。在占據(jù)有利生態(tài)位、經(jīng)受植物防衛(wèi)反應(yīng)、與病原菌直接相互作用等方面具有優(yōu)勢[9]。從內(nèi)生細(xì)菌中篩選出對根癌土壤桿菌有抑制作用的拮抗菌，不僅能為生物防治根癌病提供新思路，而且可為有效防控根癌病提供新的菌種資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】寄主植物對生物脅迫的耐受性與其內(nèi)生細(xì)菌有關(guān)。如病原菌的侵入會(huì)引發(fā)寄主植物內(nèi)生菌群的變化，而這又反過來會(huì)增強(qiáng)寄主植物對病原菌的抵抗能力[10]。近年來，具有生防作用的內(nèi)生細(xì)菌資源不斷被發(fā)現(xiàn)[11-13]。從水稻、棉花、馬鈴薯、橡樹等植物中都分離篩選到了可用于生物防治相關(guān)病害的內(nèi)生細(xì)菌[14]。而且研究表明內(nèi)生細(xì)菌在防治植物病害方面具有廣闊的應(yīng)用前景。如陳延熙等[15]利用植物內(nèi)生芽孢桿菌研制的生物制劑已廣泛應(yīng)用于多種作物的病害防治；Pleban等[16]通過接種內(nèi)生細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了對向日葵和花椰菜病蟲害的防控。然而，到目前為止，國內(nèi)外尚未有分離鑒定防控桃相關(guān)病害的桃內(nèi)生菌的研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Hao等[17]在篩選抗根癌病的桃種質(zhì)資源時(shí)發(fā)現(xiàn)，桃單株“西北13-1”重復(fù)接種根癌土壤桿菌后，其發(fā)病情況均輕于第一次接種，這表明根癌土壤桿菌的侵染使該品種獲得了對桃根癌病的抗性，由此推測桃單株“西北13-1”對根癌病的獲得抗性可能與其內(nèi)生細(xì)菌有關(guān)。因此，本研究將分析根癌土壤桿菌侵染對桃內(nèi)生細(xì)菌菌群的影響，并從中篩選出對根癌土壤桿菌有拮抗作用的菌株，從而探索利用內(nèi)生細(xì)菌防治桃根癌病的可能性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】揭示桃內(nèi)生菌與桃“西北13-1”具有根癌病獲得抗性的關(guān)系，開發(fā)對根癌土壤桿菌具有拮抗活性的生防菌，從而為桃根癌病的生物防治提供新的思路和菌種資源。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所基地完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料：“西北13-1”實(shí)生桃苗，對根癌病具有獲得抗性。桃苗于2011年實(shí)生種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所基地。向日葵作為指示植物測定拮抗菌的防治效果。番茄用于檢測拮抗菌在植株根部的定殖情況。

供試病原菌：根癌土壤桿菌ATCC 23308T（生物Ⅰ型）和TA-AT-2（生物Ⅱ型）均由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）提供。

質(zhì)粒：帶有綠色熒光標(biāo)記的表達(dá)載體pBBR1MCS-2，具有卡那霉素（Kana，終濃度為50 μg·mL-1）抗性。由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所趙廷昌研究員惠贈(zèng)。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離統(tǒng)計(jì)

1.2.1 根癌土壤桿菌的接種 將根癌土壤桿菌TA-AT-2接種于YEB培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度至109CFU/mL。選5棵長勢一致的桃苗，每棵樹選6個(gè)不同方向的枝條，將根癌土壤桿菌菌液接種到新發(fā)嫩枝上[18]，用無菌水接種作為對照。

1.2.2 樣品采集及處理 分別于接種前（0 D）、接種后10 d （接種處理10 DI，對照處理10 DM）和接種后60 d（接種處理60 DI，對照處理60 DM）收集枝條。每棵樹每個(gè)時(shí)期選3個(gè)方向不同的枝條用無菌修枝剪剪下，分別用70%酒精浸泡30 s、1% NaClO浸泡3 min后用無菌水清洗5次[19]進(jìn)行表面消毒。將表面消毒后的材料在NA培養(yǎng)基上做印記，28℃培養(yǎng)5—10 d，觀察平板，驗(yàn)證表面消毒效果。用無菌剪刀將表面消毒的枝條各接種點(diǎn)之間的部分剪切成0.5 cm長的小段，將同一棵樹同一處理的不同枝條的片段混和為一個(gè)樣品，用于內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)和種屬鑒定。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 每個(gè)樣品取1 g于無菌研缽中，加入9 mL PBS溶液，研磨后靜置得到莖組織懸浮液。采用TSA培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，24 h后根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行分類、編號(hào)，分別記錄各類細(xì)菌的形態(tài)及菌落數(shù)。挑取單菌落在NA平板上劃線純化3次后，將其接種到相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上，4℃冰箱保存，同時(shí)采用-80℃甘油管凍存。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌種屬鑒定及分類統(tǒng)計(jì) 將內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)期，利用通用引物27f：5′-AGAGTTTG ATCCTGGTCAG-3′，1492r：5′-TACGGCTACCTTGT TACGACTT-3′[20]，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列。50 μL反應(yīng)體系：2×Mix 25 μL；上下游引物各2 μL（10 pmol），ddH2O 17 μL；菌液4 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸2 min；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）有限公司測序并拼接后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索，尋找具有較高相似性（≥97%）的16S rDNA序列，并確定該序列所屬的門和屬，參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊》[21]對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分類。

1.3 拮抗菌的篩選及鑒定

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌的平板拮抗測定 方法參考文獻(xiàn)[22]。根癌土壤桿菌菌懸液由ATCC 23308T和TA-AT-2按1﹕1體積混和而成。

1.3.2 溫室防病效果測定 分別挑取產(chǎn)生抑菌圈的菌株、ATCC 23308T和TA-AT-2于NB中28℃、200 r/min培養(yǎng)18—24 h，調(diào)整發(fā)酵液濃度至108CFU/mL。將ATCC 23308T和TA-AT-2發(fā)酵液按1﹕1體積混和而成（以下簡稱病原菌發(fā)酵液）。將拮抗菌發(fā)酵液和病原菌發(fā)酵液以5﹕1體積比混和，接種出苗7 d左右的向日葵子葉下方[23]。以體積比5﹕1的無菌水與病原菌發(fā)酵液的混和液作為對照。每個(gè)處理包括10株向日葵苗，3個(gè)重復(fù)。放置于28℃培養(yǎng)室內(nèi)，7 d后觀察根瘤產(chǎn)生情況，20 d后用游標(biāo)卡尺測量根瘤的直徑和向日葵莖粗。統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)[24]，計(jì)算拮抗菌的防病效果。采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（≤0.05）。

1.3.3 菌株16S rDNA序列測定與初步鑒定 16S rDNA序列擴(kuò)增同1.2.4。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下快速切膠、回收?；厥詹襟E參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（康寧生命科學(xué)有限公司）說明書進(jìn)行。參照零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）說明進(jìn)行克隆。選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。使用Mega 6進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 菌株形態(tài)和生理生化特性 按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]對拮抗菌株的菌落和菌體形態(tài)、氧化酶、接觸酶等生理生化特性進(jìn)行測定；采用Biolog全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的Biolog GEN II微孔板測定菌株對碳源的發(fā)酵利用。

1.4 綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性測定

1.4.1 制備感受態(tài)細(xì)胞 以2%的比例將過夜培養(yǎng)的拮抗菌菌液接種于NB培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4左右，冰上預(yù)冷15 min。4℃，5 000 r/min離心20 min收集菌體，用預(yù)冷的無菌水重懸菌體，重復(fù)2次。離心后用無菌冷藏的10%甘油懸浮菌體，重復(fù)3次。最后再重懸于10%甘油中，100 μL/管分裝于1.5 mL離心管中，液氮速凍后于-80℃冰箱中保存。

1.4.2 電擊轉(zhuǎn)化 將1.4.1中感受態(tài)細(xì)胞分別與pBBR1MCS-2質(zhì)?；旌虾筮M(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化[26]。電擊后加入1 mL不含Kana的LB液體培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)4 h復(fù)蘇菌體。取菌液100 μL涂布于含Kana的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)24 h。

1.4.3 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 將1.4.2中培養(yǎng)的平板直接在OLYMPUS SZX16熒光體式顯微鏡下觀察，對照原始菌株，通過觀察菌落發(fā)出的綠色熒光直接篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑取陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于Kana抗性平板上，同時(shí)采用-80℃甘油管凍存。

1.4.4 標(biāo)記菌株與原始菌株的生物學(xué)特性比較 生長曲線、穩(wěn)定性測定均參考文獻(xiàn)[27]。培養(yǎng)條件為28℃、200 r/min，每隔2 h測定菌液的OD600。抑菌活性比較參照1.3.1。溫室防病效果比較參照1.3.2。

1.5 標(biāo)記菌株在番茄根際的定殖

接種方法參考文獻(xiàn)[22]。拮抗菌菌懸液濃度為108CFU/mL，病原菌菌懸液濃度為107CFU/mL。共3個(gè)處理，分別對應(yīng)2個(gè)標(biāo)記菌株的接種處理和無菌水接種的對照處理，每處理10株番茄苗，2個(gè)重復(fù)。分別于第0、3、10、30天取樣，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察定殖情況并采用平板稀釋法測定菌株定殖量[27]。

2 結(jié)果

2.1 桃“西北13-1”不同處理枝條內(nèi)生菌群的差異分析

2.1.1 桃樹枝條內(nèi)生細(xì)菌分離 對不同處理的桃枝條進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，結(jié)果在TSA平板上均可長出大量菌落，且菌落形態(tài)存在明顯差異，說明桃樹枝條中存在大量種類不同的內(nèi)生細(xì)菌。對從不同處理的枝條內(nèi)所分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)（CFU/g鮮重），分別為0 D/9.9、10 DI/3.9×104、10 DM/4.5×102、60 DI/5.6 ×104、60 DM/2.2×104。隨著枝條成長，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量逐漸增加。接種10 d時(shí)，接種枝條內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量是對照處理的近100倍，表明病原菌的侵入引起了枝條內(nèi)生菌群數(shù)量的急劇增加。而接種60 d時(shí)接種處理僅為對照的2.5倍，表明枝條內(nèi)生菌群變化趨于平穩(wěn)。選擇形態(tài)差異明顯的菌落進(jìn)行平板劃線純化，共得到108株內(nèi)生細(xì)菌。其中0 D 3株，10 DI 27株，10 DM 25株，60 DI 26株，60 DM 27株。

2.1.2 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定 對純化的108株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能夠得到大小1.5 kb的目的片段。測序比對，這108株細(xì)菌分別屬于5個(gè)細(xì)菌類群中的17個(gè)屬。其中伽馬變形菌類（Gammaproteobacteria）和阿爾法變形菌類（Alphaproteobacteria）為優(yōu)勢菌群，分別占43.5%和32.7%；其次為放線菌類（Actinobacteria），占15.0%；剩余兩類分別為厚壁菌類（Firmicutes）和擬桿菌（Bacteroidetes），各占8.0%和0.8%（圖1-A）。其中，伽馬變形菌類的泛菌屬（，37.03%）、根瘤菌屬（，12.23%）和腸桿菌屬（，7.59%），阿爾法變形菌類的土壤桿菌屬（，23.15%），放線菌類的短桿菌屬（，14.64%）組成了總分離菌的94.62%（圖1-B）。

2.1.3 內(nèi)生細(xì)菌不同種群在不同處理枝條中的分布情況 除0 d及10 d的對照枝條外，革蘭氏陰性細(xì)菌的數(shù)量（CFU）均達(dá)到了105；而革蘭氏陽性細(xì)菌只有在60 d的接種枝條中其數(shù)量才上升至105。在0 d時(shí)，革蘭氏陰性細(xì)菌與革蘭氏陽性細(xì)菌的數(shù)量沒有明顯差異。接種病原菌后顯著刺激了革蘭氏陰性細(xì)菌的上升，尤其接種10 d時(shí)，枝條內(nèi)革蘭氏陰性細(xì)菌的數(shù)量為革蘭氏陽性細(xì)菌的7 800倍，但這種差異在60 d時(shí)不再明顯，僅為2倍。對照枝條中，革蘭氏陰性細(xì)菌的數(shù)量也大于革蘭氏陽性細(xì)菌，10 d時(shí)為革蘭氏陽性細(xì)菌數(shù)量的6倍，60 d時(shí)則為10倍。

在門水平上看（圖2-A），隨著枝條由嫩變老，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也逐漸增加；同時(shí)，根癌土壤桿菌的接種也刺激了菌群的增長，接種處理的菌群數(shù)量顯著高于清水對照。其中伽馬變形菌類存在于接種前后的各個(gè)時(shí)期，是數(shù)量最多，分布最廣泛的一個(gè)類群。其數(shù)量在0 d時(shí)為33，10 d時(shí)數(shù)量上升至104，60 d時(shí)則達(dá)105，即隨枝條變老而上升。其次是阿爾法變形菌類，除了新生嫩枝沒有分離到以外，其他接種枝條和對照都有阿爾法變形菌分布。病原菌的接種顯著刺激了阿爾法變形菌的上升，尤其接種10 d后，枝條內(nèi)的阿爾法變形菌數(shù)量為對照的300倍。放線菌類則主要存在于60 d的枝條中，接種枝條中的數(shù)量是對照的近10倍。而厚壁菌類卻主要集中于對照枝條中，在接種枝條中幾乎分離不到厚壁菌。擬桿菌僅存在于接種60 d的枝條中。

A：桃樹枝條內(nèi)生細(xì)菌在門水平的分布情況Distribution of endophytic bacteria on phylum in ‘Xibei 13-1’ twigs；B：桃樹枝條內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的分布情況 Distribution of endophytic bacteria on genus in ‘Xibei 13-1’ twigs

A：不同處理枝條中內(nèi)生細(xì)菌菌群在門水平的分布情況Distribution of endophytic bacteria composition on phylum in ‘Xibei 13-1’ twigs in different treatments；B：不同處理枝條中內(nèi)生細(xì)菌菌群在屬水平的分布情況Distribution of endophytic bacteria composition on genus in ‘Xibei 13-1’ twigs in different treatments

在屬水平上看（圖2-B），只有腸桿菌屬分布于各處理中，其數(shù)量由于接種刺激而顯著上升，具體為10 d時(shí)為對照處理數(shù)量的34倍，60 d時(shí)為對照的210倍。數(shù)量最多的泛菌屬存在接種刺激效應(yīng)，尤其接種10 d時(shí)接種枝條是對照枝條中泛菌的655倍，但這種差異在60 d時(shí)不再明顯，僅為2倍；根瘤菌屬與泛菌屬趨勢類似，10 d時(shí)接種處理為對照處理數(shù)量的151倍，而60 d時(shí)僅為1.05倍。土壤桿菌屬幾乎只存在于接種枝條中且數(shù)量很多，但土壤桿菌與根瘤菌數(shù)量都隨時(shí)間推移而下降。其他屬細(xì)菌都只存在于某個(gè)時(shí)間點(diǎn)或某個(gè)處理中。

2.2 拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定

2.2.1 拮抗細(xì)菌的篩選 通過平板拮抗測定，從108株桃樹枝條內(nèi)生細(xì)菌中篩選獲得14株拮抗菌，它們都能形成抑菌圈且長勢良好。這14株拮抗菌分別屬于6個(gè)屬，其中根瘤菌屬4株；泛菌屬4株；腸桿菌屬2株；假單胞菌屬（）2株；短小桿菌屬（）1株；葡萄球菌屬（）1株。

以向日葵為感病植物，測定這14株待選拮抗菌的防病效果。接種7 d后，對照組發(fā)病嚴(yán)重，病情指數(shù)為65.83。菌株10DM4-1和10DI2-2與病原菌混和接種向日葵后形成的根癌瘤大小明顯小于對照組（圖3），發(fā)病率分別降低了60.0%和63.3%；所形成的根癌瘤直徑大約為0.3 cm×0.5 cm，明顯小于對照組的根癌瘤直徑（0.6 cm×1.0 cm）；病情指數(shù)明顯降低，防治效果分別為86.08%和89.87%（表1）。其余12株待選拮抗菌對根癌土壤桿菌侵染向日葵形成根癌瘤有一定的抑制作用，但防治效果不及10DM4-1和10DI2-2。

表1 拮抗菌對根癌土壤桿菌侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（≤0.05） Different lowercases following the data indicated significant difference (≤0.05)

A: CK; B: 10DM4-1; C: 10DI2-2; D: 10DM4-1-gfp; E: 10DI2-2-gfp

2.2.2 拮抗菌的菌落形態(tài)和生理生化特性 菌株10DM4-1在NA培養(yǎng)基上的單菌落圓形扁平，呈黃色，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色陰性，接觸酶反應(yīng)陽性，不水解明膠等。根據(jù)菌體形態(tài)特征、生化特性及Biolog測定結(jié)果（表2），初步判定10DM4-1為[28-30]。菌株10DI2-2在NA培養(yǎng)基上的單菌落圓形中凸，呈淡黃色，表面光滑黏稠。革蘭氏染色陰性，能水解七葉靈等。根據(jù)菌體形態(tài)特征、生化特性及Biolog測定結(jié)果（表3），初步判定10DI2-2為[31-32]。

2.2.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 菌株10DM4-1和10DI2-2的16S rDNA序列已提交至GenBank，登錄號(hào)分別為KY451836和KY451837。16S rDNA序列比對結(jié)果顯示，10DM4-1與（EF688011）相似性達(dá)98.94%，且與其在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支（圖4-A），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將10DM4-1鑒定為。10DI2-2的16S rDNA序列與（AJ508303）序列相似性達(dá)99.56%，且與其在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支（圖4-B），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將10DI2-2鑒定為。

2.3 GFP標(biāo)記菌株的檢測及其生物學(xué)測定

2.3.1 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測 將電轉(zhuǎn)復(fù)蘇后的菌液涂布于Kana抗性平板上，培養(yǎng)1 d后長出許多小菌落，在熒光體式顯微鏡下觀察這些菌落，均發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。挑取單克隆轉(zhuǎn)接后，菌落同樣發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖5-A、5-B），證明含有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒在目標(biāo)菌株中成功表達(dá)。10DM4-1和10DI2-2的綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株分別命名為10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp。

表2 菌株10DM4-1的形態(tài)和生理生化特征鑒定結(jié)果

“＋”：陽性Positive；“-”：陰性Negative；“w”：弱陽性Weakly positive。下同The same as below

表3 菌株10DI2-2的形態(tài)和生理生化特征鑒定結(jié)果

2.3.2 標(biāo)記菌株的生物學(xué)特性 在相同培養(yǎng)條件下，標(biāo)記前后菌株的生長曲線變化趨勢基本相同，在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期，20 h后開始衰亡。熒光鏡檢結(jié)果表明連續(xù)轉(zhuǎn)接10次后，菌落仍然保持均勻而且強(qiáng)烈的綠色熒光，標(biāo)記菌株質(zhì)粒的穩(wěn)定性接近100%。10DM4-1、10DM4-1-gfp、10DI2-2和10DI2-2-gfp對根癌土壤桿菌形成的抑菌圈直徑（mm）分別為12.29±1.02a、13.41±0.52a、12.47±0.78a和13.44±0.94a，平板抑菌活性檢測及溫室防病效果測定（表1）的結(jié)果表明標(biāo)記菌株10DM4-1-gfp、10DI2-2-gfp分別與原始菌株10DM4-1、10DI2-2對根癌土壤桿菌的抑菌活性無明顯差異。結(jié)果證明外源質(zhì)粒的存在及GFP的表達(dá)未對菌株10DM4-1和10DI2-2的生理代謝、生防功能產(chǎn)生明顯的不利影響。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

A：10DM4-1-gfp的熒光顯微鏡觀察Fluorescence detection of strain 10DM4-1-gfp under fluorescence microscope；B：10DI2-2-gfp的熒光顯微鏡觀察Fluorescence detection of strain 10DI2-2-gfp under fluorescence microscope

2.4 標(biāo)記菌株在番茄根際的定殖

定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根當(dāng)天的初始菌量接近108CFU/g，3 d后種群數(shù)量迅速下降至106CFU/g，隨后下降速度稍緩，10 d后種群數(shù)量約為104CFU/g，30 d后標(biāo)記菌株仍然能被檢測到且數(shù)量級趨于穩(wěn)定，同樣約為104CFU/g。用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察到，灌根當(dāng)天10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp的綠色菌體大量定殖在番茄根圍，形成一層綠色的保護(hù)膜，處理3 d后綠色菌體的數(shù)量迅速下降，標(biāo)記菌株大量進(jìn)入細(xì)胞間隙，10 d及30 d之后標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖動(dòng)態(tài)變化不大，在30 d后根部細(xì)胞間隙能明顯觀測到綠色菌群（圖6）。對照組在接種3 d后沒有發(fā)現(xiàn)任何熒光，表明該番茄根組織沒有背景熒光。

3 討論

植物內(nèi)生細(xì)菌指能定殖在健康植物組織內(nèi)，并與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物[33]。植物內(nèi)生細(xì)菌的菌群會(huì)隨環(huán)境的改變而發(fā)生變化，以此增加寄主植物對環(huán)境的適應(yīng)性[10]。為驗(yàn)證桃的內(nèi)生細(xì)菌是否也會(huì)增加桃對病害的抗性，本研究選取了對根癌病具有獲得抗性的桃單株“西北13-1”進(jìn)行分析。從“西北13-1”的枝條中分離出了多種內(nèi)生細(xì)菌，絕大多數(shù)為泛菌屬、腸桿菌屬和根瘤菌屬，并且其菌群數(shù)量在接種根癌土壤桿菌后急劇增加，這說明在桃的內(nèi)生細(xì)菌中，泛菌屬、腸桿菌屬和根瘤菌屬的菌群數(shù)量變化與接種根癌土壤桿菌相關(guān)。值得指出的是，篩選到的產(chǎn)抑菌圈的菌株大部分都屬于這3類細(xì)菌。以上結(jié)果暗示了桃“西北13-1”對桃根癌病的獲得抗性或許與其內(nèi)生細(xì)菌的菌群有關(guān)。

使用生防菌是防控根癌病的有效方法。通過平板拮抗測定獲得了14株拮抗根癌土壤桿菌的細(xì)菌，進(jìn)一步從中篩選出兩個(gè)有明顯防治效果的菌株10DM4-1和10DI2-2，經(jīng)鑒定分別為泛菌屬和腸桿菌屬。雖然泛菌可防治青霉病、火疫病等[34-35]；腸桿菌對干腐病、青枯病等具有良好的防治效果[36-37]，但目前未見泛菌屬和腸桿菌屬防控根癌病的報(bào)道。本研究結(jié)果表明泛菌屬和腸桿菌屬中存在可用于防控根癌病的生防菌資源，這為生物防治桃根癌病提供了新的思路。

生防菌的防治效果受多種因素影響，其中菌株的定殖能力是重要因素。目前常用的生防菌大多來自植物根際土壤，其生長易受外界環(huán)境影響，難于長期穩(wěn)定定殖，這極大的影響了實(shí)際防病效果[8]。分離于植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌，因受到植物組織的保護(hù)，可穩(wěn)定定殖。因此，來自植物組織內(nèi)的內(nèi)生生防菌相對于根際生防菌，可能具有更穩(wěn)定的防治效果。根內(nèi)定殖試驗(yàn)表明，本研究獲得的兩株拮抗菌在接種番茄30 d后仍可在根細(xì)胞間隙觀察到，并且其數(shù)量保持穩(wěn)定，說明兩株拮抗菌均可穩(wěn)定定殖于寄主植物，具有良好的應(yīng)用前景。

A—C：10DM4-1-gfp的暗場、明場及疊加；D—F：10DI2-2-gfp的暗場、明場及疊加 Fluorescence (GFP) micrographs of tomato roots are taken under dark fields (A, D), bright fields (B, E) and merge fields (C, F) using a Zeiss LSM880 fluorescent microscopy, respectively. A-C: Strain 10DM4-1-gfp; D-F: Strain 10DI2-2-gfp

內(nèi)生菌的生防機(jī)制主要是通過產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和酶類、與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位、誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性及防衛(wèi)信號(hào)等方式，持續(xù)抑制病原菌的生長和入侵[6]。本研究獲得的兩株生防菌可以產(chǎn)生明顯的抑菌圈，這說明它們均產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，但具體成分仍需進(jìn)一步測定。番茄根部定殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)初期生防菌10DM4-1和10DI2-2可大量定殖在番茄根圍；隨后進(jìn)入根部細(xì)胞間隙，將細(xì)胞包裹起來，形成綠色的保護(hù)膜；最后穩(wěn)定存在于細(xì)胞間隙。這說明它們在番茄根組織內(nèi)具有良好的生存和定殖能力，可能通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位來抑制根癌土壤桿菌的入侵。

4 結(jié)論

“西北13-1”內(nèi)生的腸桿菌、泛菌和根瘤菌可能與其對根癌病的抗性有關(guān)。獲得兩株對根癌病的防治具有良好應(yīng)用前景的生防菌株，占據(jù)有利的生態(tài)位和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)是其發(fā)揮生防作用的重要機(jī)制。研究結(jié)果為進(jìn)一步利用內(nèi)生生防菌資源和根癌病的生物防治提供了材料及依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Screening and identification of peach endophytic bacteria with antagonism against

LI YuJia1, LI Qian1,2, ZHANG ZhiXiang1, LI ShiFang1

(1State Key Laboratory for biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193)

The objectives of this study are to identify the population composition of cultivable endophytes in peach twigs of ‘Xibei 13-1’ cultivar, and to screen the new antagonists for biological control of crown gall disease.Peach twigs of ‘Xibei 13-1’ cultivar were inoculated with, and mock inoculation of the control was performed in a similar manner, but sterilized distilled water was used instead of the bacterial suspension. Twigs with different treatments were collected at different time points (before inoculation, 10 and 60 days after inoculation, respectively). Surface sterilization, endophytes isolation and counts, and 16S rDNA sequencing, were conducted to analyze the quantity and diversity of endophytic bacteria among samplesTheir antagonisms against the causal agent of crown gall disease,, were tested by pair co-culturing method, and the efficacy of the antagonists in suppressing crown gall disease was further evaluated in greenhouse using sunflowers as a susceptible plant. The taxonomic status was clarified by physiological and biochemical and molecular methods. In order to reveal the antagonistic mechanism, the plasmid of pBBR1MCS-2 that contains green fluorescent protein gene (GFP) was transformed into the antagonistic strains by electroporation. Antibacterial activities, dynamic analysis and stability of the GFP-labeled strain were tested. The labeled strain suspension was inoculated using root irrigation method, then thesuspension was inoculated at the 2nd day. Their re-colonization on the tomato roots was examined by fluorescence microscope and plate dilution method.A total of 108 endophytic bacterial isolates were obtained from peach twigs of ‘Xibei 13-1’ cultivar. All isolates were identified as 17 genera of the 5 bacterial groups-phylogenetically based on 16S rDNA. The 5 groups are Gammaproteobacteria, Alpharoteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes.This result showed the biodiversity of endophytic bacteria from peach twigs of ‘Xibei 13-1’ cultivar. Among them, genera,,andwere the most abundant and significantly increased following inoculation of. In addition, most of the antagonists belong to these three genera as well (10/14)., strains 10DM4-1 and 10DI2-2 showed good performances in disease control with the efficacy of 86.08% and 89.87%, respectively. Strains 10DM4-1 and 10DI2-2 were then identified asandby their 16S rDNA sequences in combination with their biochemical and physiological characteristics, respectively. The population of transformants 10DM4-1-gfp and 10DI2-2-gfp on tomato roots decreased sharply in the first 10 days, then declined slowly after 10th day and remained constant at lower level (104CFU/g), indicating that they could stably colonize and survive in the intercellular of tomato roots.The resistance of peach ‘Xibei 13-1’ cultivar against crown gall disease may be related to its endogenous,and.10DM4-1 and10DI2-2 can effectively suppress crown gall disease caused by, produce antagonistic substances, colonize the favorable ecological niche and has high potential application value for biological control of crown gall disease.

peach crown gall disease; endophytic bacteria; antagonist; biological control; colonization

2017-03-20；接受日期：2017-04-25

國家桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS30）

李昱佳，E-mail：reinalina@163.com。通信作者李世訪，E-mail：sfli@ippcaas.cn