農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法探究

張趙一淳

摘 要：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在研究植物基因功能、改良作物農(nóng)藝性狀等方面發(fā)揮著重要作用。擬南芥作為模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。本文主要介紹農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)基因方法——浸花法。該方法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，易于在中學(xué)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。通過該實(shí)驗(yàn)，可以培養(yǎng)中學(xué)生對(duì)于生物學(xué)科的興趣，提高學(xué)生對(duì)于生物知識(shí)的理解力和創(chuàng)新能力。

關(guān)鍵詞：植物轉(zhuǎn)基因；農(nóng)桿菌；浸花法

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把目的基因通過各種方法轉(zhuǎn)移到植物基因組中，使之穩(wěn)定遺傳。利用該技術(shù)研究基因在植物個(gè)體生長發(fā)育以及生理代謝過程中功能，研究成果可應(yīng)用于農(nóng)藝性狀的改良、植物經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的提高等方面。植物基因轉(zhuǎn)化的方法可分為直接轉(zhuǎn)化和載體介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法?；蛑苯訉?dǎo)入法直接將外源目的基因?qū)胫参锏幕蚪M中，包括基因槍轉(zhuǎn)化法、電激轉(zhuǎn)化法、超聲波法、顯微注射法和激光微束法、PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法、脂質(zhì)體法和花粉管通道法等；載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法需要將目的基因插入到改造后的農(nóng)桿菌質(zhì)粒或病毒的DN分子上，利用農(nóng)桿菌或病毒對(duì)植物的侵染作用將目的基因?qū)氲街参锘蚪M中。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法具有應(yīng)用范圍廣，轉(zhuǎn)化率高，單拷貝比例高，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點(diǎn)，是植物轉(zhuǎn)基因研究中的常用轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌能在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。在農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以插入到植物基因中?？蒲腥藛T經(jīng)過長期的研究，將目的基因插入到經(jīng)過改造T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作時(shí)，根據(jù)植物材料的不同，采用不同的轉(zhuǎn)化方法，如在煙草轉(zhuǎn)化時(shí)常采用葉盤法，而水稻轉(zhuǎn)化則采用愈傷組織轉(zhuǎn)化的方法。

浸花法（floral tip）是擬南芥轉(zhuǎn)化最常用的方法。這種轉(zhuǎn)化方法不需要組織培養(yǎng)和再生植株的過程，操作簡便、轉(zhuǎn)化效率較高，為科研人員提供了極大的便利。鑒于此，將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)基因操作引入高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)，可以增加學(xué)生對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的了解，豐富學(xué)生的知識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)于生物研究的興趣，提高學(xué)生對(duì)于生物知識(shí)的理解力和創(chuàng)新能力。

一、材料和方法

1.植物材料

哥倫比亞野生型擬南芥。

野生型擬南芥種子種植于蛭石中，放在4℃低溫處理24h，然后將培養(yǎng)盒置于22±1℃光照下使其萌發(fā)生長。

2.藥品試劑

（1）含有pBIN-mGFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV1301懸浮液（對(duì)數(shù)生長期）：將植物轉(zhuǎn)基因載體pBIN-mGFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV1301，卡那霉素（50mg/ml）篩選含有pBIN-mGFP質(zhì)粒的菌落。將重組農(nóng)桿菌接種在LB液體培養(yǎng)基（含25mg/L慶大霉素和50mg/L卡那霉素）中，28℃，180r/min條件下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

（2）浸染液：含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的水溶液。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）農(nóng)桿菌侵染液的準(zhǔn)備：①將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入離心管中，室溫條件下，以6000 rpm/min轉(zhuǎn)速，在離心機(jī)中離心10分鐘，然后將上清倒出。②將農(nóng)桿菌沉淀用200 ml浸染液重懸在500 ml燒杯中。

（2）植物材料準(zhǔn)備：擬南芥生長5-6周，此時(shí)最大花序已產(chǎn)生第1個(gè)角果。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)前一天停止?jié)菜?/p>

（3）浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。①選取初果期的健壯擬南芥植株，將花序浸入農(nóng)桿菌懸浮液中約30秒，注意葉片盡量不與浸染液接觸。同一個(gè)燒杯中的農(nóng)桿菌懸浮液可以轉(zhuǎn)化10株或者更多株擬南芥。在此過程中，盡量避免將蛭石倒入農(nóng)桿菌懸浮液中。②將擬南芥培養(yǎng)盒放于溫室暗處，約24小時(shí)。③24小時(shí)后將擬南芥植株放于溫室光照條件下正常生長。④生長約4周時(shí)角果變黃，用紙袋將植株套住。再過1周后剪下植株，收種子，在恒溫培養(yǎng)箱中干燥1周后放到4℃中保存。

（4）擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的篩選。①種子滅菌：將收獲的擬南芥種子置于1.5ml離心管中，加入70%乙醇，處理約1min，然后將乙醇用移液器吸走，離心管中加入5%次氯酸鈉溶液，處理5min，最后用無菌水洗5次，每次2min。②種子在篩選培養(yǎng)基上面萌發(fā)生長：將消毒好的擬南芥種子撒播在含卡那霉素50mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿封口置于4℃冰箱中春化2-3天，然后置于22±1℃光照培養(yǎng)箱中生長。

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