番茄育種種質(zhì)對南方根結(jié)線蟲抗性評價(jià)及Mi—1基因檢測

賈正民

摘 要：本文就廣東珠海地區(qū)以及國內(nèi)和國外各地區(qū)的番茄育種基地中的“仙客1號”進(jìn)行對比分析，將南方根結(jié)線蟲具有抗性的番茄及南方根結(jié)線蟲為實(shí)驗(yàn)材料。通過對多代篩選出來并且具有明顯抗性的番茄種質(zhì)，利用病土盤栽自然發(fā)病以及人工接種二期幼蟲的方法進(jìn)行鑒定，全面分析番茄育種種質(zhì)的抗性。同時(shí)運(yùn)用了合理的方法對番茄中的Mi-1基因進(jìn)行檢驗(yàn)，希望能為關(guān)注這一領(lǐng)域的人士提供一些參考意見。

關(guān)鍵詞：番茄育種種質(zhì)；南方根結(jié)線蟲；Mi-1基因檢測；仙客1號

在近幾年的實(shí)驗(yàn)成果中得出Mi系列的1至9號抗性基因中Mi-1基因的抗蟲性效果最突出，且已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到美國、荷蘭等國家的番茄育種當(dāng)中。我國在此領(lǐng)域中起步較晚，但也取得了一些具有研究價(jià)值的成果。通過對番茄后代植株中是否含有Mi系列基因進(jìn)行監(jiān)測，能幫助我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新的突破。

一、“仙客1號”番茄育種種質(zhì)對南方根結(jié)線蟲抗性測評

1.實(shí)驗(yàn)方法

（1）病土盤栽引病法。將分別來自亞洲地區(qū)、國內(nèi)其他地區(qū)以及廣東省珠海市地區(qū)育種中心的實(shí)驗(yàn)用“仙客1號”番茄不同種質(zhì)同時(shí)進(jìn)行播種，模擬番茄自然生長的環(huán)境、雨水和光照等因素對其進(jìn)行培育?？刂品巡シN土壤為變量，番茄生長的土壤控制為含有大量南方根結(jié)線蟲幼蟲的病土，將病土、肥料和礱糠灰按照7：1：2的比例進(jìn)行混合。由于珠海市地區(qū)的土質(zhì)松軟并且砂性較強(qiáng)，適合南方根結(jié)線蟲繁殖生長，因此培育番茄的病土中數(shù)量會(huì)達(dá)到800條以上。將影響番茄生長的溫度、濕度等其他因素作為定量，把盤栽的番茄幼苗生長環(huán)境調(diào)整適宜，并且不對其進(jìn)行殺蟲劑和其他農(nóng)藥噴灑，使其自然發(fā)病。

（2）引入二期病蟲幼蟲方法。對“仙客1號”番茄種質(zhì)使用濃度為5%的氯酸鈉溶液進(jìn)行殺毒清洗十分鐘之后，再用清水洗凈種子上的溶液殘留物質(zhì)。之后將種子分別放在含有雙層濾紙的培養(yǎng)器皿當(dāng)中，控制溫度和濕度等作為定量，對種子催生發(fā)芽。待種子根部生長至5毫米時(shí)，再將其移植到無菌土壤當(dāng)中。相同基因的番茄種子種植十份，置于恒溫恒氧的培育室當(dāng)中。因?yàn)橥寥罏闊o菌培養(yǎng)土，因此種子前期可以健康生長，當(dāng)幼苗根部平均生長至10厘米以上時(shí)，在實(shí)驗(yàn)對象根部周圍2厘米處鉆孔，并且植入事前配置好的根結(jié)線蟲二期幼蟲溶液，控制定量保持不變，觀察番茄后期生長變化。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

筆者選取了我國廣東省珠海市某番茄育種研究基地中用于番茄育種實(shí)驗(yàn)的南方根結(jié)線蟲幼卵進(jìn)行培養(yǎng)，通過活體繁殖方法，培育出適合番茄育種實(shí)驗(yàn)研究的南方根結(jié)線蟲幼蟲。此外，筆者還將廣東省珠海市果蔬培育中心的“仙客1號”的不同種質(zhì)進(jìn)行對比分析試驗(yàn)。其中，將廣東省珠海市果蔬培育中心含有Mi-1基因的“仙客1號”番茄種質(zhì)作為試驗(yàn)對象，其他來自國家育種中心以及亞洲研究中心的同種番茄不同育種種質(zhì)作為對照組，以方便獲得更加直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，“仙客1號”人工接種鑒定能表現(xiàn)出較高的抗病性。例如，2號～6號、8號～15號、18號～21號、23號、25～28號等二十二份育種種質(zhì)同實(shí)驗(yàn)對象為1號的抗病性育種種質(zhì)“仙客1號”進(jìn)行對比，發(fā)病率分別為6.7%至63.3%，根結(jié)指數(shù)為0.1至1.1，均具有較高的抗蟲能力。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示出，其中17份高抗性育種種質(zhì)和實(shí)驗(yàn)對象“仙客1號”相比，具有十分顯著的水平，其余五份和“仙客1號”差異并不明顯。其中根結(jié)指數(shù)為3.2～4.2的番茄育種種質(zhì)表現(xiàn)出感病性和高感染性，同其他對照組相比具有明顯的差異性，且無免疫材料。

二、“仙客1號”番茄育種種質(zhì)抗病性實(shí)驗(yàn)結(jié)論分析

1.番茄育種種質(zhì)對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定

通過實(shí)驗(yàn)分析得出，含有Mi系列基因的番茄種質(zhì)通常具有抗根結(jié)線蟲的能力，其中Mi-1基因的抗根結(jié)線蟲能力最優(yōu)。Mi-1基因?qū)τ诙喾N根結(jié)線蟲的預(yù)防和抵抗功能只在某一種群中最具優(yōu)勢，并且根結(jié)線蟲群體和與之相對應(yīng)的抗性基因之間具有轉(zhuǎn)化特性。因此，在番茄種質(zhì)育種的過程中，需要在番茄種質(zhì)中利用Mi-1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因培育。因?yàn)镸i-1基因?qū)τ谧畛Ｒ姷腗.arenaria、M.incognita以及M.javanica等三種根結(jié)線蟲都具有良好的抗性，所以可以利用三種根結(jié)線蟲的基因進(jìn)一步提高番茄中Mi-1基因?qū)τ谄渌N類根結(jié)線蟲的抗性。。

2.番茄種質(zhì)抗性材料Mi-1基因鑒定

（1）番茄基因的提取和檢測。在廣東省珠海地區(qū)育種基地的“仙客1號”番茄品種進(jìn)行取樣和DNA基因提取，引入物質(zhì)Mi-1F以及Mi-1R對番茄中的Mi-1基因進(jìn)行鑒定。通過對在培育基地采集的新鮮番茄葉片組織進(jìn)行取樣，在一百毫克的番茄葉片組織中加入過量液態(tài)氮并且將二者充分研磨混合，再利用CTAB法提取出樣本中的DNA基因，最后將DNA存儲于零下二十?dāng)z氏度的冰柜之中，等待進(jìn)一步分析和研究。

經(jīng)過一段時(shí)間，將冰柜中的番茄DNA基因調(diào)取，并且加入檢測用反應(yīng)試劑，利用PCR反應(yīng)測試對番茄DNA基因進(jìn)行分析檢測。PCR的反應(yīng)程序?yàn)閷⒎袲NA基因在94攝氏度中進(jìn)行變形反應(yīng)2分鐘，之后再進(jìn)行90攝氏度反應(yīng)45秒、52攝氏度反應(yīng)45秒、72度反應(yīng)1分鐘。一共四次變性反應(yīng)共進(jìn)行八組三十二次循環(huán)反應(yīng)。最后將產(chǎn)物放置于溫度為16攝氏度的恒溫箱中，進(jìn)行持續(xù)觀察。

（2）番茄基因鑒定。經(jīng)過長期的觀察和分析，在我國廣東省珠海市地區(qū)番茄育種中心所培育的番茄育種種質(zhì)中含有Mi-1基因，因此相對于國家果蔬中心以及亞洲果蔬研究中心所培育出的番茄種質(zhì)具有較好的抗根結(jié)線蟲能力。能有效抵抗南方根結(jié)線蟲的Mi-1基因目前已在我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛推廣，并且在我國南方省市地區(qū)大面積種植。在保證番茄品質(zhì)的基礎(chǔ)上，提高抗病番茄的產(chǎn)量。

三、結(jié)語

綜上所述，通過對廣東珠海地區(qū)“仙客1號”番茄育種材料進(jìn)行病土培植的防治有利于發(fā)現(xiàn)對南方根結(jié)線蟲病具有良好抗性的番茄種質(zhì)。并且，在實(shí)驗(yàn)中得出相對于二期幼蟲接種法而言，病土直栽不僅操作簡單而且更加貼近番茄自然的生長環(huán)境，得出的結(jié)果相對來說更加準(zhǔn)確并且可信度更高。并且，國內(nèi)在利用Mi-1基因?qū)Ψ堰M(jìn)行轉(zhuǎn)基因培植時(shí)，需要對Mi-1基因熱穩(wěn)定不足方面進(jìn)行合理控制，以加快優(yōu)質(zhì)番茄種質(zhì)的培育進(jìn)程。

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