發(fā)酵黃漿水乳酸菌的篩選及其制備工藝的研究

陳大衛(wèi)+陸文琨+黃玉軍+張玉律+蔡潤(rùn)嫻

摘 要：該文以黃漿水作為培養(yǎng)物，研究不同乳酸菌發(fā)酵黃漿水對(duì)致病菌大腸桿菌的抑菌作用，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究具有抑菌功能的發(fā)酵黃漿水的最佳發(fā)酵條件和碳氮源組成。結(jié)果表明：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）TY947-4黃漿水發(fā)酵液的pH較低、酸度和活菌數(shù)較高，分別為3.91、84.66°T及9.21×108CFU/mL，對(duì)大腸桿菌的抑菌能力較強(qiáng)，抑菌圈直徑為18.13mm；S.thermophilus TY947-4發(fā)酵黃漿水的最適發(fā)酵條件為：添加1.5%的葡萄糖，0.5%的魚粉蛋白胨及0.5%的酵母膏，接種量為6%，39℃發(fā)酵48h，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到22mm。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；抑菌；發(fā)酵黃漿水

中圖分類號(hào) S816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）20-0014-05

Screening of Lactic Acid Bacteria of Fermented Yellow Serofluid and its Fermentation Conditions

Chen Dawei et al.

（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The antimicrobial of lactic acid bacteria （LAB） of fermented yellow serofluid were studied，the enteropathogenic Escherichia coli （E.coli） was used as indicate bacteria，and the optimum fermentation conditions of fermented and the composition of carbon and nitrogen sources were researched by single -factortest and orthogonal test.The results showed that the pH of Streptococcus thermophilus TY947-4 fermentation liquid was low，and the acidity and the viable count of LAB was higher than other strains，whcih were 3.91，84.66°T and 9.21×108CFU/mL respectively，and the antibacterial activity of E.coli was also higher，the diameter of inhibition was 18.13mm.The optimized fermentation conditions of S.thermophilus TY947-4 of fermented yellow serofluid were 39 oC，fermented 48h and 6% inoculation amount，and carbon source and nitrogen source were 1.5% glucose，0.5% peptone and 0.5% yeast extract meal ，the diameter of inhibition E.coli was 22mm.

Key words：Lactic acid bacteria；Antibacterial；Fermented yellow serofluid

黃漿水是在豆腐加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，含有可溶性糖類、低聚糖、大豆異黃酮、蛋白質(zhì)、膳食纖維及無(wú)機(jī)鹽等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，由于是富營(yíng)養(yǎng)化物質(zhì)，黃漿水的化學(xué)需氧量較高，直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。目前我國(guó)對(duì)于豆腐黃漿水的綜合利用，主要是回收黃漿水中的營(yíng)養(yǎng)成分[1，2]或以其作為發(fā)酵基質(zhì)，生產(chǎn)蝦青素、維生素、曲酸、核黃素等功能性物質(zhì)[3]。

隨著生物技術(shù)水平的發(fā)展，天然生物抗菌劑已被越來(lái)越多的應(yīng)用于食品中，對(duì)食品中的多種有害微生物均有較強(qiáng)的殺滅作用，能快速抑制其生長(zhǎng)。乳酸菌作為人體腸道中重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善胃腸道功能、增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力及免疫力等功能[4]，被廣泛的應(yīng)用于食品發(fā)酵，除了能夠增強(qiáng)食品的功能性外，還可以改善食品風(fēng)味，并延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期等[5]。研究[6]還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用乳酸菌發(fā)酵黃漿水不僅可以獲得具有功能性的營(yíng)養(yǎng)成分，還可以代謝異黃酮、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從而獲得生產(chǎn)性能優(yōu)越的抗菌劑。有研究[7]表明，不同的乳酸菌發(fā)酵黃漿水的產(chǎn)酸能力不同，不同的發(fā)酵條件、碳源、氮源及其含量也對(duì)發(fā)酵黃漿水的抑菌能力產(chǎn)生了較大的影響。為此，本文以黃漿水為發(fā)酵基質(zhì)，篩選出發(fā)酵黃漿水產(chǎn)生抑菌效果較好的乳酸菌，并研究其發(fā)酵工藝，在豐富了利用黃漿水手段的同時(shí)，也為天然抑菌劑的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料 黃漿水：揚(yáng)州市維揚(yáng)豆制品廠；MRS液體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉、過(guò)氧化氫、磷酸二氫鉀、鹽酸、氯化鈉、無(wú)水乙醇：分析純，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；大腸桿菌（Escherichia coli SDZC07）：揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；試驗(yàn)菌株：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備 JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋：日本TOMY公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；WS2-134-75培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；S-25型數(shù)顯pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Legend mach1.6R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)塞默飛世爾科技有限公司。endprint

2 試驗(yàn)方法

2.1 乳酸菌的活化 將實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌按3%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，4℃冷藏備用。

2.2 大腸桿菌的活化 將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù)，用滅菌的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其活菌濃度，使其活菌數(shù)在108CFU/mL，4℃冷藏備用。

2.3 乳酸菌的篩選 黃漿水于115℃滅菌20min后接入10%的乳酸菌，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定其pH，并參照GB 5009.239-2016[8]的方法測(cè)定其酸度，同時(shí)利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定乳酸菌的活菌數(shù)。采用單層瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌能力，取菌液濃度為108CFU/mL的大腸桿菌菌液0.20mL涂布于LB培養(yǎng)基平板上，待菌液固定在培養(yǎng)基表面后打孔，然后將黃漿水發(fā)酵液注入孔內(nèi)至滿孔，于37℃培養(yǎng)10h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，本試驗(yàn)需重復(fù)3次。判定標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)抑菌圈為不抑菌，10～15mm為低度抑菌，15～20mm為中度抑菌，大于20mm為高度抑菌。

2.4 黃漿水的發(fā)酵條件

2.4.1 發(fā)酵溫度 將乳酸菌以10%的接種量接種于黃漿水中，分別在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃條件下培養(yǎng)24h。測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，確定最適培養(yǎng)溫度。

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間 將乳酸菌以10%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下分別培養(yǎng)24h、36h、48h、60h、72h。測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，確定最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.4.3 乳酸菌接種量 將乳酸菌分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種于黃漿水中，在37℃條件下培養(yǎng)24h。測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，確定最適接種量。

2.4.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量為影響因素，利用SPSS 17.0軟件中的3因素3水平正交設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.5 碳源的確定 在黃漿水中分別添加2%和4%的蔗糖、乳糖、葡萄糖，按上述發(fā)酵條件中確定的發(fā)酵溫度、時(shí)間及接種量來(lái)發(fā)酵黃漿水。測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，進(jìn)而確定最適碳源。

2.6 復(fù)合氮源的確定 將乳清蛋白粉、魚粉蛋白胨及酵母膏分別以0%、0.5%、1%的添加量添加到黃漿水中，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。設(shè)計(jì)三因素三水平正交p試驗(yàn)，確定氮源的最優(yōu)添加組合，選取的因素及水平見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌發(fā)酵黃漿水對(duì)大腸桿菌的抑制作用

3.1.1 發(fā)酵液pH、酸度以及活菌數(shù) 將乳酸菌按10%的接種量接種于滅菌的黃漿水，37℃培養(yǎng)24h后，測(cè)定其pH、酸度以及活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，12株乳酸菌的黃漿水發(fā)酵液的pH值在3.6～4.6，其中菌株978-4的pH值為3.63，顯著低于其他菌株（P<0.05）；菌株TY947-4、MY087-2、LH100-1、978-4及V9的發(fā)酵液酸度均大于80°T，顯著高于其他菌株（P<0.05）；而菌株TY947-4、978-4及V9發(fā)酵液的活菌數(shù)均在9.0×108CFU/ml以上，顯著高于其他菌株（P<0.05）。

3.1.2 發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定 采用單層瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定了12株乳酸菌的黃漿水發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，12株乳酸菌的黃漿水發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌均有一定的抑制作用。其中菌株TY947-4的抑菌圈直徑為18.13mm，為中度抑菌，顯著高于V3、LPRA-1、T2等7株乳酸菌（P<0.05）。結(jié)合3.2 發(fā)酵條件的確定

3.2.1 發(fā)酵溫度、時(shí)間及接種量的確定 將乳酸菌按照不同的接種量接種至黃漿水中進(jìn)行發(fā)酵，以確定接種量、發(fā)酵溫度及時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在39℃時(shí)，TY947-4發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，但在大于39℃后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黃漿水中的最適發(fā)酵溫度為39℃。由圖2B可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，TY947-4發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，但發(fā)酵時(shí)間在大于48h后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黃漿水中的最適發(fā)酵時(shí)間為48h。由圖2C可知，當(dāng)TY947-4接種量為6%時(shí)，TY947-4發(fā)酵液的抑菌能力最強(qiáng)。

3.2.2 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化 在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用L9（34）對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。表3為培養(yǎng)基組成的因素與水平設(shè)計(jì)表，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，發(fā)酵條件中影響抑菌能力的各因素的主次關(guān)系為C（接種量）>A（發(fā)酵溫度）>B（發(fā)酵時(shí)間）。從k值得出發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)條件為A2B3C2，即發(fā)酵溫度為39℃，發(fā)酵時(shí)間為48h，接種量為6%。

3.3 碳源及氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

3.3.1 碳源的確定 分別選擇蔗糖、乳糖、葡萄糖作為唯一碳源，39℃發(fā)酵48h后測(cè)定發(fā)酵液的抑菌能力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，TY947-4在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中抑菌能力顯著強(qiáng)于其他碳源（P<0.05），但在含4%葡萄糖的黃漿水中的抑菌能力與2%葡萄糖無(wú)顯著性差異（P>0.05），由此可見(jiàn)2%的濃度已經(jīng)達(dá)到菌株的生長(zhǎng)需求。因此選擇2%及低于2%的濃度進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中最佳的碳源濃度。

3.3.2 葡萄糖添加量對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 選擇葡萄糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，進(jìn)一步確定最適的添加量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，抑菌圈直徑最大，添加量在1.5%～2%時(shí)，抑菌圈直徑逐漸下降，表明葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，黃漿水發(fā)酵液的抑菌能力最強(qiáng)。

3.3.3 復(fù)合氮源對(duì)菌株抑菌活性的影響 分別將乳清蛋白粉、魚粉蛋白胨、酵母膏作為氮源，以0%、0.5%，1.0%的添加量添加到黃漿水中，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。表5為復(fù)合氮源的因素與水平設(shè)計(jì)表，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，復(fù)合氮源中影響抑菌能力的各因素的主次關(guān)系為A（乳清蛋白粉）>B（魚粉蛋白胨）>C（酵母膏）。從k值得出發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)基配方為A1B2C2，即加入0.5%的酵母膏，0.5%的魚粉蛋白胨。endprint

4 結(jié)論與討論

本文研究表明，以黃漿水作為發(fā)酵基質(zhì)的乳酸菌的產(chǎn)酸能力較好，對(duì)乳酸菌的抑菌能力有一定的促進(jìn)作用，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵黃漿水的酸度上升和pH下降存在著較強(qiáng)的一致性，表明乳酸等代謝產(chǎn)物會(huì)引起pH的下降。試驗(yàn)菌株中，TY947-4的抑菌能力最強(qiáng)，但產(chǎn)酸能力并不是最高，表明除了酸性物質(zhì)外，其他一些代謝物質(zhì)也對(duì)抑菌產(chǎn)生重要的影響；乳酸菌還可以通過(guò)代謝產(chǎn)生CO2造成厭氧環(huán)境來(lái)抑制需氧細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還可以通過(guò)增加環(huán)境中CO2的濃度來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)pH值和酶活性，并通過(guò)減弱細(xì)胞膜的傳遞功能來(lái)抑制一些致病菌的生長(zhǎng)[4]；乳酸菌產(chǎn)生的過(guò)氧化氫能夠激活過(guò)氧化氫酶-硫氰酸系統(tǒng)，抑制和殺滅革蘭陰性菌、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性等細(xì)菌。同時(shí)，黃漿水中的異黃酮及其代謝產(chǎn)物也對(duì)致病菌具有一定的抑菌效果[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及接種量在一定的范圍內(nèi)會(huì)促進(jìn)乳酸菌的抑菌能力，但是當(dāng)溫度、時(shí)間及接種量進(jìn)一步增大時(shí)，反而抑制了乳酸菌的的抑菌能力，表明在發(fā)酵過(guò)程中，過(guò)多的代謝產(chǎn)物使得乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了自限性[10]。試驗(yàn)還研究了蔗糖、乳糖及葡萄糖作為碳源對(duì)TY947-4發(fā)酵黃漿水抑菌能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可以顯著的提高發(fā)酵黃漿水對(duì)大腸桿菌的抑菌能力，表明葡萄糖作為碳源可以增加TY947-4代謝產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。活菌數(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物有較大的影響，有研究表明乳清蛋白粉、蛋白胨及酵母膏等氮源對(duì)嗜熱鏈球菌的促生長(zhǎng)作用具有一定的特異性[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)，0.5%的酵母膏和0.5%的魚粉蛋白胨作為TY947-4的復(fù)合氮源發(fā)酵的黃漿水抑制大腸桿菌的能力較強(qiáng)，表明TY947-4代謝0.5%酵母膏和0.5%魚粉蛋白胨產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)較多。接種6%的S.thermophilus TY947-4至黃漿水中，并添加1.5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏及0.5%的魚粉蛋白胨，在39℃發(fā)酵48h，其對(duì)大腸桿菌的抑菌能力較高。本文在體外篩選并優(yōu)化了乳酸菌發(fā)酵黃漿水抑制大腸桿菌的發(fā)酵條件，其在腸道內(nèi)的抑菌效果還需要在體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]宋春麗，王文俠，曾鳳彩，等.超聲波和微波輔助提取大豆低聚糖的工藝比較[J].食品與機(jī)械，2011，27（2）：47-50.

[2]謝明杰，宋明，鄒翠霞，等.超聲波提取大豆異黃酮[J].大豆科學(xué)，2004，23（1）：75-76.

[3]王欣欣.利用黃漿水制備富含苷元型大豆異黃酮發(fā)酵乳的研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2014.

[4] 陳大衛(wèi).輔助降血脂益生乳酸菌的篩選及其對(duì)高血脂大鼠腸道菌群的影響[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[5]Rhee S J，Lee J E，Lee C H.Importance of lactic acid bacteriain Asian fermented foods[J].Microbial Cell Fact，2011，10（1）：S5.

[6]Wang Q，Wang H，Xie M.Antibacterial mechanism of soybean isoflavone on Staphylococcus aureus[J].Archives of microbiology，2010，192（11）：893-898.

[7]Shimada K，Cheftel J C.Determination of sulfhydryl groups and disulfide bonds in heat-induced gels of soy protein isolate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36（1）：147-153.

[8]GB 5009.239-2016.食品酸度的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[9]Wang Q，Wang H，Xie M.Antibacterial mechanism of soybean isoflavone on Staphylococcus aureus[J].Archives of microbiology，2010，192（11）：893-898

[10]王晶，季海峰，王四新，等.體外法評(píng)定大豆低聚糖對(duì)乳酸菌增殖和抑茵效果的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（12）：98-103.

[11]白鳳翎.蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培養(yǎng)體系研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010. （責(zé)編：張宏民）endprint