黑米米糠游離酚對碘與淀粉結(jié)合及淀粉消化的影響

李歡歡， 吳娜娜， 譚 斌，*， 肖志剛， 翟小童， 田曉紅，劉艷香， 劉 明， 汪麗萍， 高 琨

(1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034； 2.國家糧食局科學(xué)研究院， 北京 100037)

專題研究專欄

編者按：碳水化合物是谷物的重要組成部分，主要包括淀粉多糖和非淀粉多糖。谷物加工過程中淀粉多糖和非淀粉多糖的改變會對谷物產(chǎn)品的品質(zhì)特性及功能特性產(chǎn)生重要影響，因此谷物多糖的研究是食品科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本期選擇以谷物淀粉及β-葡聚糖為研究對象的2篇論文，分別研究了黑米米糠多酚對淀粉消化性的影響以及大麥β-葡聚糖的凝膠特性表征及應(yīng)用。希望此方面的研究能為谷物食品的加工、谷物食品的品質(zhì)評價(jià)及功能性谷物多糖的開發(fā)等方面的工作提供借鑒。

(主持人：王靜教授)

黑米米糠游離酚對碘與淀粉結(jié)合及淀粉消化的影響

李歡歡1,2， 吳娜娜2， 譚 斌2，*， 肖志剛1，*， 翟小童2， 田曉紅2，劉艷香2， 劉 明2， 汪麗萍2， 高 琨2

(1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034； 2.國家糧食局科學(xué)研究院， 北京 100037)

以早秈米、黑米米糠為原料，通過稀堿法提取早秈米中的淀粉，采用有機(jī)溶劑酸化甲醇提取黑米米糠中游離酚，并利用高效液相色譜法測定其多酚含量，將黑米米糠游離酚加入到淀粉-碘復(fù)合溶液中，通過掃描吸收光譜的變化來考察酚濃度對淀粉-碘結(jié)合的影響，進(jìn)一步加入a-淀粉酶，考察黑米米糠游離酚對a-淀粉酶催化淀粉消化的影響。結(jié)果表明，黑米米糠游離酚抑制淀粉和碘的結(jié)合，濃度越大抑制效果越明顯，且隨著酚濃度的增加，最大吸收峰向波長短的方向移動，即發(fā)生藍(lán)移，其原因可能是酚與淀粉結(jié)合，改變了淀粉性質(zhì)，從而改變其吸收峰；黑米米糠游離酚能抑制淀粉的消化，其原因可能是酚與淀粉疏水基團(tuán)結(jié)合。

黑米米糠； 游離酚； 早秈米淀粉； 淀粉-碘； 消化

淀粉消化的快慢對人的健康有重要影響，其他物質(zhì)如脂肪、酚類等對淀粉的消化起到一定的抑制作用。研究表明，許多有機(jī)和無機(jī)的化合物能與淀粉結(jié)合，占據(jù)直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[1-2]。這些復(fù)合物中，例如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等與直鏈淀粉的螺旋內(nèi)部結(jié)合，不僅抑制了淀粉-碘復(fù)合物的結(jié)合，還抑制了淀粉酶對淀粉的催化水解作用[3]。有報(bào)道表明，槲皮素、蘆丁、表兒茶素這些分子中含有疏水基團(tuán)，能夠與淀粉結(jié)合，其影響效果與脂肪酸一樣[4]。另外，異黃酮與直鏈淀粉結(jié)合[5]，原花青素也能與包括淀粉在內(nèi)的多糖結(jié)合[6]。這些結(jié)果表明具有黃酮結(jié)構(gòu)的成分可與包括淀粉在內(nèi)的多糖結(jié)合。很多研究致力于單種酚與淀粉的結(jié)合，但鮮有復(fù)合多酚對淀粉-碘復(fù)合物以及對α-淀粉酶催化淀粉反應(yīng)影響的研究報(bào)道。

淀粉的鏈具有螺旋狀結(jié)構(gòu)，每6個(gè)葡萄糖基構(gòu)成一螺旋圈，且羥基均指向內(nèi)圈。當(dāng)?shù)夥肿舆M(jìn)入內(nèi)圈時(shí)，羥基成為供電子體，形成淀粉-碘復(fù)合物。按鏈的長短不同，直鏈淀粉與碘的復(fù)合物呈藍(lán)色，可使碘的吸收波長向短的方向移動，室溫下最大吸收峰為620 nm；支鏈淀粉與碘的吸附程度不同而呈紫紅色，室溫下最大吸收峰為560 nm[7]。

淀粉在被α-淀粉酶水解后，其螺旋結(jié)構(gòu)消失，淀粉與碘的復(fù)合物不再形成，可通過淀粉與碘復(fù)合物吸光度的變化來考察淀粉的消化程度；也可通過此變化來研究酚對淀粉與碘結(jié)合，以及對淀粉消化作用的影響。本研究以人食用較多的早秈米為淀粉來源，以顏色較深的黑米為游離酚來源，而Ti等[8]的研究表明米糠中的酚比碾白米中含量高很多，所以從酚含量較多的黑米米糠提取游離酚，通過淀粉與碘復(fù)合物吸光度的變化，來研究黑米米糠游離酚對碘與淀粉結(jié)合及淀粉消化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早秈米、黑米，北京市新發(fā)地農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場；豬胰α-淀粉酶，美國Sigma公司；堿性蛋白酶，青島吉寶中新國際貿(mào)易有限公司，兩種酶均為食品級；氫氧化鈉、無水甲醇、氯化鉀、磷酸鈉、碘、碘化鉀、甲酸等，北京化工廠，均為分析純；濃鹽酸，北京化工廠，為優(yōu)級純；甲醇、乙腈，北京化工廠，均為色譜級；沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、矢車菊素，美國Sigma公司，均為色譜級。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-1型大功率電動攪拌器，常州國華電器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋，DGG-9140BD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RJ-LD-IIB型低速大容量多管離心機(jī)，北京天林恒泰科技有限公司；T18 basic高速分散機(jī)，德國艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；IM-25型全自動制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；2690/2695型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Evolution 220型紫外分光光度計(jì)，美國熱電公司；S220型臺式pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1早秈米淀粉的提取

將碾后的早秈米磨粉過100目篩，稱取秈米粉，加入0.4%的氫氧化鈉，料液比為1∶4，在40 ℃水浴下提取2 h，然后4 000 r/min，離心20 min，用蒸餾水洗滌2次，烘干再粉碎，加水將淀粉調(diào)成乳后加堿性蛋白酶，使酶活為0.048 AU/kg，水解1 h，離心(4 000 r/min，20 min)，蒸餾水洗滌，離心洗滌重復(fù)4次，在第3次離心前用2 mol/L的鹽酸調(diào)pH值為7，離心得到沉淀后烘干、粉碎、過篩(100目)，最后得到早秈米淀粉[9]。

1.3.2黑米米糠游離酚提取

將黑米碾米得到黑米米糠，稱取0.5 g脫脂黑米米糠，加入50 mL冷藏的酸化甲醇(95%的甲醇與1 mol/L的酸，體積比為85∶15)[10]，在冰浴條件下使用高速分散器以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌5 min，然后2 500 r/min條件下離心10 min，得到上清液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后用冷藏的酸化甲醇定容到10 mL,-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3黑米米糠中游離酚含量的測定

采用高效液相色譜法測定黑米米糠游離酚的含量，測定目標(biāo)包括主要酚酸和主要花青素，酚酸的測定條件：0.4%的乙酸為流動相A，色譜乙腈為流動相B，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，測定波長為280 nm，采用梯度洗脫的方式，即0～40 min時(shí)，流動相B比例由5%到25%；40～45 min時(shí)，流動相B比例由25%到35%；45～50 min時(shí)，流動相B比例由35%到50%；50～55 min時(shí)，流動相B比例保持在5%。此實(shí)驗(yàn)以沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸為標(biāo)樣[11-13]?；ㄇ嗨氐臏y定條件：6%甲酸為流動相A，色譜甲醇為流動相B，流速、柱溫與酚酸相同，測定波長為525 nm，同樣采用梯度洗脫的方式，0～7 min時(shí)，流動相A比例由82%～80%；7～10 min時(shí)，80%～75%；10～25 min時(shí)，75%～40%；25～26 min時(shí)，40%～82%；26～28 min時(shí)，82%。此實(shí)驗(yàn)以矢車菊素為標(biāo)樣[14-15]。

1.3.4淀粉-碘復(fù)合物的形成及淀粉的消化

1.3.4.1 不同pH值、不同淀粉濃度條件對淀粉吸光度影響的測定

用氯化鉀、濃鹽酸配置成濃度為50 mmol/L，pH值為2的緩沖溶液；用磷酸鈉配置成不同pH值，濃度為20 mmol/L的緩沖溶液(pH值分別為5，7，9)，將早秈米淀粉加入到相應(yīng)的緩沖溶液中，分別配置成質(zhì)量濃度為100，10，1 mg/mL的淀粉溶液，95 ℃水浴30 min，37 ℃平衡10 min。分別取不同pH值緩沖溶液配制的不同濃度的淀粉溶液1 mL,加入1 mL濃度為0.01 mol/L的碘水，然后用相應(yīng)的pH值緩沖溶液定容到10 mL，分別使最終的淀粉質(zhì)量濃度為10，1，0.1 mg/mL，避光反應(yīng)30 min,用紫外分光光度計(jì)全波長掃描(200～900 nm)其混合液的吸光度。

1.3.4.2 不同濃度的黑米米糠游離酚對淀粉吸光度影響的測定

通過高效液相色譜法測定黑米米糠游離酚中主要酚酸和花青素的濃度，將其加和得到黑米米糠游離酚的總濃度，選取通過1.3.4.1試驗(yàn)得到的合適pH條件、合適淀粉濃度，加入不同濃度的黑米米糠游離酚(酚溶液需用相應(yīng)的緩沖溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，在同樣波長條件下測定淀粉的吸收光譜。

1.3.4.3 黑米米糠游離酚對淀粉消化影響的測定

根據(jù)不同濃度黑米米糠游離酚對淀粉吸光度的影響，選取一個(gè)影響最小的酚濃度來考察其對淀粉消化的影響，同樣是通過淀粉的吸光度變化來衡量。首先選擇合適濃度的酚，加入1.5 mL豬胰α-淀粉酶，再加入1 mL 0.01 mol/L的碘水，最后加入合適濃度的淀粉溶液1 mL，最后反應(yīng)液的體積為10 mL，最終α-淀粉酶的酶活為2.5 U/mL，與其形成對照的是，其他條件不變，對照組不加黑米米糠游離酚。避光反應(yīng)，分別測定反應(yīng)時(shí)間為0，5，10 min的淀粉消化液吸光度[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米米糠游離酚中酚酸、花青素含量測定結(jié)果

在280 mm下測得的酚酸如圖1，在525 mm下測得的花青素如圖2。由圖1可知沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、矢車菊素的出峰時(shí)間依次為7，12，18.5，21，22，28，30，15 min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時(shí)間及其含量來計(jì)算對應(yīng)出峰時(shí)間黑米米糠游離酚中的含量如表1。

1，沒食子酸；2，原兒茶酸；3，綠原酸；4，咖啡酸；5，丁香酸；6，香豆酸；7，阿魏酸。圖1 高效液相色譜在280 nm波長下測得的酚酸Fig.1 HPLC chromatogram of phenolic acids at wavelength of 280 nm

圖2 高效液相色譜在525 nm波長下測得的花青素Fig.2 HPLC chromatogram of anthocyanin at wavelength of 525 nm

表1 黑米米糠游離酚中各酚酸及花青素含量

“-”表示沒有檢測到。

由表1可知，黑米米糠游離酚酸不含綠原酸、咖啡酸，原兒茶酸含量較高，沒食子酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸含量相對較低；矢車菊素含量相當(dāng)高，也充分說明了黑米米糠中花青素含量相當(dāng)高。

2.2pH值和淀粉濃度對淀粉吸光度的影響

1，碘；2～4，淀粉終質(zhì)量濃度依次為0.1，1，10 mg/mL。圖3 pH值和淀粉濃度對淀粉-碘復(fù)合物吸光度的影響Fig.3 Effects of different pH values on absorbance of starch-iodine compounds with different starch concentrations

2.3不同濃度的黑米米糠游離酚對淀粉吸光度的影響

根據(jù)高效液相色譜法測得的黑米米糠游離酚含量可知其總質(zhì)量濃度為13 174.90 μg/mL，將此濃度稀釋1 000倍，分別取100，200，300，400，500，600，700，800 μL加入反應(yīng)體系中，使得最終質(zhì)量濃度分別為13，26，39，52，65，78，91，104 μg/mL。

隨著黑米米糠游離酚濃度的增加，淀粉-碘復(fù)合物的吸光度逐漸降低，直至沒有吸收峰的存在(見圖4)，說明黑米米糠游離酚抑制淀粉-碘復(fù)合物的形成，原因可能是酚與碘一樣占據(jù)了淀粉的內(nèi)部螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致與淀粉結(jié)合的碘單質(zhì)減少，進(jìn)而吸光度降低[19]。由圖4還可知，隨著酚濃度的增加，吸收峰發(fā)生藍(lán)移，原因可能是酚與淀粉的疏水基團(tuán)結(jié)合改變了淀粉的結(jié)構(gòu)，從而使其吸收峰發(fā)生改變。在研究黑米米糠游離酚對淀粉消化的影響時(shí)，酚對淀粉本身吸光度的影響應(yīng)降到最低，所以選擇影響較小的酚質(zhì)量濃度13 μg/mL作為淀粉消化時(shí)的酚濃度。

2.4 黑米米糠游離酚對淀粉消化的影響

隨著加入α-淀粉酶(見圖5(a))消化反應(yīng)時(shí)間延長，吸光度降低，這是因?yàn)棣?淀粉酶將淀粉水解葡萄糖等成單糖，減少了淀粉-碘復(fù)合物量，從而吸光度降低；而圖5(b)中，加入黑米游離酚之后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，吸光度降低幅度卻減小，說明黑米游離酚抑制了α-淀粉酶對淀粉的消化作用。

1，碘; 2，淀粉- 碘; 3～10，酚質(zhì)量濃度依次增加，分別為13，26，39，52，65，78，91，104 μg/mL。圖4 不同黑米米糠游離酚濃度對淀粉-碘復(fù)合物吸光度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of free phenol from black rice bran on absorbance of starch-iodine complex

1，碘；2，淀粉-碘；3～5，加α-淀粉酶后分別反應(yīng)1，5，10 min。圖5 黑米米糠游離酚對淀粉消化的影響Fig.5 Effects of free phenol from black rice bran on starch digestion

反應(yīng)體系中加入黑米米糠游離酚后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(見圖6)，在波長為650 nm下，加α-淀粉酶之前與加入α-淀粉酶后不同時(shí)間點(diǎn)的最大吸光度的差值分別為：1 min時(shí)0.042, 5 min時(shí)0.068，10 min時(shí)0.105；而不加黑米米糠游離酚對應(yīng)的差值分別為0.012，0.019，0.035，不加酚比加酚的差值小。由此也充分說明黑米米糠游離酚對淀粉的消化起到了一定的抑制作用，其原因可能是酚與淀粉相結(jié)合，抑制了淀粉的消化。

圖6 不同消化反應(yīng)時(shí)間加酚與不加酚的淀粉-碘復(fù)合物最大吸光度的差值比較Fig.6 Maximal absorbance values of starch-iodine with and without phenol at different reaction times

3 結(jié) 論

pH值環(huán)境相同，不同淀粉濃度與碘結(jié)合時(shí)，吸光度隨著淀粉濃度的升高而增大；淀粉濃度相同pH值環(huán)境不同時(shí)，吸光度隨著pH值的增大而下降；黑米米糠游離酚對淀粉-碘復(fù)合物結(jié)合有抑制作用，且其抑制效果隨著酚濃度升高而加強(qiáng)，黑米米糠游離酚對淀粉的消化起到抑制作用。因此，可利用碘與淀粉的結(jié)合吸光度值變化表征淀粉體外消化變化的過程。

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EffectsofFreePhenolfromBlackRiceBranonCombinationofIodineandStarchandStarchDigestion

LI Huanhuan1,2, WU Nana2, TAN Bin2,*, XIAO Zhigang1,*, ZHAI Xiaotong2, TIAN Xiaohong2, LIU Yanxiang2, LIU Ming2, WANG Liping2, GAO Kun2
(1.CollegeofGrainScienceandTechnology,ShenyangNormalUniversity,Shenyang110034,China; 2.AcademyofStateAdministrationofGrain，Beijing100037,China)

In this study, the alkali method was used to extract starch from early indica and organic solvent was used to extract polyphenol from black rice bran. The polyphenol content was determined by using high performance liquid chromatography (HPLC). The free phenol of black rice bran was added to starch-iodine complex solution to study the effects of free phenol with starch-iodine compounds by scanning the changes of absorption spectra. Furthermore, α-amylase was added to the solution to study the effects of free phenol from black rice bran on the digestion of early indica starch. The results showed that free phenol from black rice bran inhibited the combination of starch and iodine. The inhibition of phenol to starch digestion increased with the increase of phenol concentration. The absorption peak moved to short wavelength with the increase of phenol concentration, which is called blue shift. The reason might be that the combination of phenol and starch changed the nature of the starch, which changed its absorption peak. The free phenol of black rice bran inhibited starch digestion through combination of phenol and starch hydrophobic groups.

black rice bran; free phenol; early indica starch; starch-iodine; digestion

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.05.004

2095-6002(2017)05-0018-07

李歡歡，吳娜娜， 譚斌，等. 黑米米糠游離酚對碘與淀粉結(jié)合及淀粉消化的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(5):18-24.

LI Huanhuan, WU Nana, TAN Bin, et al. Effects of free phenol from black rice bran on combination of iodine and starch and starch digestion[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(5):18-24.

TS201.2； TS210.1

A

2017-09-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31501524); “十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0401103)。

李歡歡，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食增值加工利用；

*譚 斌，男，研究員，主要從事糧食增值加工利用方面的研究，通信作者；

*肖志剛，男，教授，主要從事糧食油脂及植物蛋白工程方面的研究，通信作者。

(責(zé)任編輯：檀彩蓮)