細(xì)葉石仙桃黃酮類成分的分離及其抗腫瘤活性

陳小兵，黃麗蕓，許 軍，鄧鼎森*，凌志杰

（1.贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

細(xì)葉石仙桃黃酮類成分的分離及其抗腫瘤活性

陳小兵1，黃麗蕓1，許 軍2，鄧鼎森1*，凌志杰1

（1.贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

采用硅膠柱層析等方法對細(xì)葉石仙桃全草進(jìn)行化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，分離得到3個化合物。根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及其光譜數(shù)據(jù)分析可鑒定為黃酮類化合物，分別為化合物1.7-羥基-3-（4′-羥苯基）異黃酮；2.槲皮素3.7-羥基-3-（4′-甲氧基苯基）色原酮。本試驗采用了MTT方法篩選所得化合物的抗腫瘤生物活性，同時再檢測化合物對H22細(xì)胞周期的影響情況。試驗結(jié)果表明化合物1和3具有較好的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)H22細(xì)胞周期阻滯于GO／G1期。

細(xì)葉石仙桃；黃酮類成分；結(jié)構(gòu)鑒定；抗腫瘤活性

細(xì)葉石仙桃（Pholidota Cantonensis）為蘭科石仙桃屬植物。細(xì)葉石仙桃為蘭科植物石仙桃的全草或假鱗莖，性甘味涼，歸肺、腎經(jīng)，有養(yǎng)陰、清熱、利濕、散瘀之效，主治肺熱咳嗽、吐血、咽喉腫痛、風(fēng)濕疼痛、濕熱浮腫、疳積、跌打損傷[1]。本研究對江西贛州產(chǎn)的細(xì)葉石仙桃中黃酮類成分進(jìn)行研究，分得黃酮類化學(xué)成分。本試驗采用了MTT方法來篩選所得單體化合物的抗腫瘤活性，同時再檢測化合物對H22細(xì)胞周期影響情況。試驗結(jié)果表明化合物1和3具有較好的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)H22細(xì)胞周期阻滯于GO／G1期。

1 材料

1.1 儀器及藥材

Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜儀；Inova 400型核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；制備液相色譜儀為Shimadzu LC-6AD （制備柱，YMC-Pack ODS-A）；大孔吸附樹脂HP-20（日本三菱公司）；ACSCalibur流式細(xì)胞儀：TecanInfinite M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thenllo公司）。葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（美國 Amersham Pharmacia Biotech 公司）。細(xì)葉石仙桃樣品于2015年9月采自江西贛州，性狀特征參照文獻(xiàn)[2]描述，經(jīng)江中藥業(yè)股份有限公司國家二級技師顏干明鑒定為細(xì)葉石仙桃。憑證樣品保存于贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中藥標(biāo)本室。

人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、肝癌細(xì)胞H22、小鼠移植性腫瘤S180和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（美國ATCC）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取細(xì)葉石仙桃全草粉末15 kg，用8倍量水提取3回，2小時每回，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到濃縮提取物1.4 kg。取出水提物1 kg，再用8倍量的95%乙醇溶液回流提取3回，3小時每回，所得提取液再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回流濃縮，所得棕色流浸膏用水?dāng)嚢璺稚?，然后依次用三氯甲烷、甲醇分別萃取，合并萃取液再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回流濃縮，回收溶劑后得浸膏。得到甲醇溶劑萃取浸膏330g棕色物，水溶解后再用Diaion HP-20型大孔吸附樹脂吸附，然后用水、10%、40%和80%乙醇溶液洗脫進(jìn)行層析分離，薄層色譜法鑒定、合并相似流份得到7個不同梯度共100個洗脫流份。經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、結(jié)晶分離、反復(fù)重結(jié)晶得到3個化合物。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

分離提取得到的化合物依據(jù)化合物的理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定。鑒定結(jié)果如下。

化合物I淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C15H10O4，mp328～330℃。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，顯示為黃酮類化合物。IR（KBr）顯示：在3265 cm-1有羥基的最大吸收，在1710 cm-1有C=O的吸收峰。苯環(huán)吸收：1629，1599，1511，1456cm-1。EI-MS：m/z 254.7[M]+。1H-NMR（CD3OD，400MHz）δ：6.75 （d，2H，J=8.2 Hz，H-6，8），6.89（d，2H，J=2.0 Hz，H-3′，-5′），7.41（d，2H，H-2′，-6′），7.9（d，1H，H-5），8.21（s，1H，H-1），10.81（s，1H，OH）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：102.1（C-3′，5′），116.1（C-6，8），122.4（C-4），123.5（C-2），125.7（C-1′），128.2（C-2′，6′），131.1（C-5），153.2（C-1），156.9（C-7，4′），175.3（C-3，C=O）。上述化合物的理化性質(zhì)及其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[3]，可鑒定化合物 I 為：7-羥基-3-（4′-羥苯基）異黃酮。

化合物Ⅱ 淡黃色針狀，分子式為C15H10O7，mp311～313℃。用鹽酸-鎂粉試驗，反應(yīng)呈陽性，此化合物為黃酮類。苯環(huán)吸收：1625，1581，1511，1428cm-1。1H-NMR（CD3OD，400MHz）δ：6.01（d，1H，J=2.3Hz，H-6），6.21（d，1H，J=2.4=0Hz，H-8），6.61（d，1H，J=8Hz，H-5′），6.75（d，1H，J=8.5Hz，H-6′），6.61（d，1H，J=8Hz，H-5′），7.13（d，1H，J=8，2.5Hz，H-2′），9.23（s，1H，3′-OH），9.33（s，1H，4′-OH），9.23（d，1H，4′-OH），10.21（s，1H，7-OH），12.23（s，1H，5-OH），13.02（s，1H，3-OH）.13C-NMR（CD3OD，100MHz）δ：95.5（C-8），98.3（C-6），104.9（C-4），112.8（C-6′），118.1（C-3′），120.8（C-2′），125.8（C-1′），138.2（C-2），146.9（C-4′），147.9（C-5′），160.5（C-1），164.2（C-5），166.2 （C-7），179.1 （C-3，C=O）.上述化合物的理化性質(zhì)及其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[4]，可鑒定為槲皮素。

化合物III黃色顆粒狀，分子式為C16H12O4，mp264～265℃。用鹽酸-鎂粉試驗，反應(yīng)呈陽性，此化合物為黃酮類。薄層色譜以5%FeCl3溶液顯色，呈現(xiàn)藍(lán)黑色，顯示有酚羥基存在。IR （KBr）光譜顯示有羥基的吸收（3400cm-1），1712 cm-1處明顯C=O吸收。苯環(huán)吸收峰：1654，1593，1531，1443 cm-1。EI-MS：m/z 269.1[M+H]+。1H-NMR（CD3OD，400MHz）δ：3.95（s，3H，-CH3），6.81（d，2H，H-6，8），6.91（d，2H，J=2.0Hz，H-3′，-5′），7.39（d，2H，H-2′，-6′），7.92（d，1H，J=8.0Hz，H-5），8.21（s，1H，H-1），10.1（s，1H，OH）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：55.6（-OCH3），102.3（C-8），113.7（C-3′，5′），115.4（C-6，），116.4（C-4），123.7（C-2），124.6（C-1′），127.3（C-5），130.1（C-2′），130.4（C-6′），152.4（C-1），158.1（C-9），165.2（C-7），174.9（C-3，C=O）。上述化合物的理化性質(zhì)及其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的基本一致[5]，故鑒定為7-羥基-3-（4′-甲氧基苯基）色原酮。

2.3 MTT試驗

按照MTT法，將HT-29、H22、S180和MCF-7細(xì)胞（1*108L-1）鋪于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個板上各設(shè)置5個復(fù)孔。再分別將化合物1、2、3、環(huán)磷酰胺試藥，分別制成l mg/mL的母液，將最終濃度為80、40、20、10、5 μg/mL稀釋后加至各給藥組，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培育3天，培育前4 h，每孔加入10 μL的 5mg/mL濃度的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔D，計算IC50值。見表1。

表1 化合物和標(biāo)準(zhǔn)對照物的抗腫瘤活性

表1試驗結(jié)果表明：化合物1能夠明顯地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、小鼠移植性腫瘤和人乳腺癌細(xì)胞的生長，并且H22的IC50值較低?；衔?亦能抑制H22細(xì)胞生長。

2.4 化合物對于H22細(xì)胞周期的影響

將H22細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清，30 μg／mL青霉素，50 μg／mL鏈霉素）。在37℃、5%CO2及飽和濕度下于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3天傳代1次。按每1 mL2×104個細(xì)胞鋪板于96孔培養(yǎng)板中，每組2個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，試驗組加入化合物2（30 μg/mL），同上條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)。以不加藥組作空白對照，同操作。細(xì)胞染色后以流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的分布特征情況，采用ModiFit軟件進(jìn)行凋亡和細(xì)胞周期分布情況分析。見表2。

表2 化合物1作用于H22腫瘤細(xì)胞的周期分布情況（%）

表2結(jié)果表明：化合物1能明顯誘導(dǎo)H22細(xì)胞周期的阻滯，與空白組相比，化合物2能夠使H22細(xì)胞G0／Gl期的比例有較大增加，同時，S期的比例有所下降，G2期的比例保持不變。

3 討 論

細(xì)葉石仙桃全草具有清熱涼血、滋陰潤肺和消腫止痛的功效，常用于治療咳嗽痰喘、肺炎、咽喉腫痛、咳血、跌打損傷和關(guān)節(jié)炎等。本研究專門對細(xì)葉石仙桃的黃酮類成分進(jìn)行了分離提取及鑒定以及抗腫瘤活性實驗，經(jīng)硅膠柱層析等方法分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及其光譜數(shù)據(jù)分析可鑒定為黃酮類化合物。同時采用的MTT法，試驗結(jié)果表明從細(xì)葉石仙桃中分離提取的化合物1和3均具有一定抗腫瘤生物活性，也能夠顯著增加G0/G1期的細(xì)胞比例，使得G1期細(xì)胞不能通過細(xì)胞周期檢測點進(jìn)入S期，從而使得G0／G1期阻滯，阻斷了腫瘤細(xì)胞的DNA合成。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海科技出版社,2006:837.

[2] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:18卷[M].北京:科學(xué)出版社,2009.390-400.

[3] Azadeh Matin,Navnath Gavande,Moon S.et al.7-Hydroxybenzopyran-4-one Derivatives: A Novel Pharmacophore of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor r and -γ (PPARr and γ)Dual AgonistsKim[J].J.Med.Chem,2009,52,6835-6850.

[4] XU Fang-hui,DING Yu-xiang et al.Chemical Constituents of Ethyl Acetate Fraction from Hypericum ascyron[J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2016,39(2):322-325.

[5] Mohammed Hosny ,John P.N.Rosazza,Novel Iso flavone,Cinnamic Acid,and Triterpenoid Glycosides in Soybean Molasses[J],J.Nat.Prod,2009,62,853-858.

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ISSN.2095-8242.2017.055.10822.02

江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研基金資助項目（項目編號：2013A095）

鄧鼎森，男，高級講師，碩士研究生

本文編輯：吳玲麗