超低溫冷凍保存伯氏鼠瘧原蟲實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

陳劍煌，黃棉桃，邱燦華，朱兆玲，李美玉

（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510080）

超低溫冷凍保存伯氏鼠瘧原蟲實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

陳劍煌，黃棉桃，邱燦華，朱兆玲，李美玉*

（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510080）

本文采用-196℃的液氮冷藏，用含30%DMSO生理鹽水為保護(hù)液，冷凍保存鼠瘧血癥達(dá)35%的瘧原蟲種株，經(jīng)6年的追蹤觀察，感染成功率100%，且原蟲的生物學(xué)特性穩(wěn)定，是較理想的動(dòng)物瘧原蟲的保種方法。

鼠瘧原蟲；冷凍保存；實(shí)驗(yàn)方法

瘧原蟲保種在瘧疾實(shí)驗(yàn)研究中占有重要的地位。構(gòu)建瘧原蟲動(dòng)物模型已成為瘧疾研究的一項(xiàng)基本技術(shù)[1]。開展瘧原蟲的體外培養(yǎng)及研究，蟲種的保存是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。常規(guī)伯氏瘧原蟲保種方法是采用小鼠腹腔接種傳代法或?qū)⒏腥警懺x小鼠直接低溫冷凍保存的方法[2]。我們在教學(xué)和科研中取感染瘧原蟲小鼠的血液，加入含30%DMSO生理鹽水做保護(hù)劑，置液氮冷凍保存，從2010～2016年每年復(fù)蘇1次，追蹤觀察了6年。結(jié)果表明，伯氏鼠瘧原蟲冷凍保存效果穩(wěn)定，冷凍保存保持了寄生蟲的抗原性和生物學(xué)特性，因此可廣泛用于科研、教學(xué)等領(lǐng)域?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法介紹如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小白鼠由中山大學(xué)動(dòng)物中心提供。

蟲株：伯氏瘧原蟲來自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心

冷凍保護(hù)液配制：取3 mLDMSO加入到7 mL生理鹽水中混勻。

凍存介質(zhì)：液氮（-196℃）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 接種方法

選擇體重約25 g的健康昆明小鼠作為保種動(dòng)物。接種前，先取種鼠尾尖血制作薄涂片，將感染度適中的伯氏瘧原蟲作為種源鼠。在1 mL消毒生理鹽水中加0.01 mL肝素，取種源鼠尾尖血2滴，加入到肝素生理鹽水中混合均勻，取0.2 mL經(jīng)腹腔注入健康小鼠體內(nèi)。接種后逐日制作血涂片觀察原蟲密度。

2.2 超低溫保存方法

鼠瘧血癥達(dá)35%左右，并以成熟裂殖體期為主時(shí)取鼠眼球血2滴，加入保護(hù)液10 mL（DMSO 3 mL+生理鹽水7 mL），混勻后分裝到2 mL的冷凍管中，每支0.5～1 mL，旋緊管蓋，貼好標(biāo)簽，置于室溫靜止30min后，沉入液氮中貯存，先置于液氮罐的頸部（約-70℃），30 min后置液氮中（-196℃）凍存。

2.3 解凍復(fù)蘇

從液氮取出冷凍管，迅速投入37～40℃溫水中，置室溫約5分鐘即可取保護(hù)液感染動(dòng)物。

2.4 觀察指標(biāo)

接種后根據(jù)不同時(shí)間感染的蟲株觀察動(dòng)物出蟲比例及出蟲時(shí)間。

3 結(jié) 果

用上述方法，鼠瘧原蟲經(jīng)液氮低溫冷凍保存，6年后對健康動(dòng)物均具有感染的活力。第一代出蟲時(shí)間隨冷凍時(shí)間推遲，從轉(zhuǎn)種第二代開始出蟲時(shí)間與冷凍前一致。說明冷凍對原蟲的毒力基本沒有影響。見表1。

表1 冷凍保存鼠瘧原蟲紅內(nèi)期的感染活力

4 討 論

以前實(shí)驗(yàn)室保種瘧原蟲是將感染瘧原蟲小鼠整體直接低溫冷凍保存的方法，但保存時(shí)間不夠長，最長可達(dá)1年。本實(shí)驗(yàn)用3份DMSO和7份生理鹽水混合做保護(hù)液，加入鼠瘧血癥達(dá)35%時(shí)的鼠眼球血2滴，分別于冷凍后的1年、2年、3年、4年、5年、6年后解凍培養(yǎng)，追蹤觀察了6年。結(jié)果顯示：凍存1～3年后第一代出蟲時(shí)間第六天開始；凍存4～5年后第一代出蟲時(shí)間第7天開始；凍存6年后第一代出蟲時(shí)間第8天開始。當(dāng)?shù)谝淮蟑懷Y達(dá)35%時(shí)，取種源鼠尾尖血2滴，加入到1 mL肝素生理鹽水中混合均勻，取0.2 mL經(jīng)腹腔注入健康小鼠體內(nèi)，做為第二代瘧原蟲種鼠，經(jīng)過二、三代的培養(yǎng)，瘧原蟲很快恢復(fù)生長發(fā)育，原蟲密度逐漸升高與種鼠保持一致。上述結(jié)果表明，低溫冷凍伯氏瘧原蟲是一種簡便可行的方法，保存要求的條件也比較簡單，通過實(shí)驗(yàn)觀察，保存期限可長達(dá)6年。本法優(yōu)點(diǎn)是比起超低溫瘧原蟲動(dòng)物整體保存法保存的蟲種時(shí)間長，所占空間小，而且本方法簡便、易于操作，成功率高，用液氮低溫冷凍保存，瘧原蟲的生物學(xué)特性基本沒有改變，保持了原蟲在紅細(xì)胞內(nèi)生長發(fā)育的原有的環(huán)境條件，血液的各種成分起到了保護(hù)劑的作用[3-4]。凍存原蟲的活力至第二次轉(zhuǎn)種后活力增強(qiáng)，逐漸接近對照組。本實(shí)驗(yàn)方法省時(shí)省力，是較理想的動(dòng)物瘧原蟲的保種方法。

[1] 彭紹蘭,周 升.瘧原蟲感染免疫機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志,2010,37(6):338-339.

[2] 王君薌,等.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,1991,9(2):133.

[3] 夏志貴,楊曼妮,周水森.2011年全國瘧疾疫情分析[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2012,30(6):419-422.

[4] 金立群,駱建民,傅玉才,等.約氏瘧原蟲與伯氏瘧原蟲侵入期抗原的初步研究[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2003,21(5):272-274.

Improvement of experimental method for cryopreservation of Plasmodium berghei

CHEN Jian-huang1, HUANG Jin-tao1, QIU Can-hua1, ZHU Zhao-ling1, LI Mei-yu＊

(Medical experiment teaching center of Zhongshan University, Guangdong Guangzhou 510080,China)

This paper uses liquid nitrogen of -196, refrigerated,with 30%DMSO saline as protective solution,cryopreservation of mouse malaria in 35% strains of Plasmodium species,observed after 6 years of followup,with a success rate of 100%,stable biological characteristics and protozoa,is an ideal method for preservation of animal plasmodium.

Rat Plasmodium; Cryopreservation; Experimental method

R382

B

ISSN.2095-8242.2017.055.10705.02

中山大學(xué)教改基金項(xiàng)目（50000-16320016）、中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)教育分會和中國高等教育學(xué)會醫(yī)學(xué)教育專業(yè)委員會醫(yī)學(xué)教育研究立項(xiàng)課題（2016B-SY027）

李美玉，女，E-mai:limeiyu@mail.susy.edu.cn

本文編輯：吳玲麗