雙親性羧甲基殼聚糖鈉鹽席夫堿衍生物的合成及其性能研究

郭幼紅，林水森，謝志新，謝娜娜，陳劍雄

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，福建 泉州 362000)

雙親性羧甲基殼聚糖鈉鹽席夫堿衍生物的合成及其性能研究

郭幼紅*，林水森，謝志新，謝娜娜，陳劍雄

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，福建 泉州 362000)

旨在以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與合成具有表面活性和抗菌等特性的多功能高分子，拓寬天然產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域. 首先殼聚糖與一氯乙酸取代反應(yīng)獲得O-羧甲基殼聚糖鈉鹽，然后依次與檸檬醛、對(duì)羥基苯甲醛進(jìn)行席夫堿反應(yīng)，最終制得O-羧甲基殼聚糖鈉鹽縮檸檬醛縮對(duì)羥基苯甲醛，并通過1H-NMR和元素分析對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征. 通過測定終產(chǎn)物的表面張力(γ)、臨界膠束濃度(CMC)、親水親油平衡值(HLB)、乳化能力和抗菌能力等對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：該產(chǎn)物具備表面活性且其水溶液能夠抑制細(xì)菌增長，具有成為功能性高分子表面活性劑的潛力.

殼聚糖；席夫堿；檸檬醛；抑菌劑；高分子表面活性劑

殼聚糖是一種來源廣泛的生物可降解材料，其優(yōu)越的性能使其經(jīng)常被加工應(yīng)用于污水處理、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面[1-3]. 殼聚糖利用其羥基和氨基與活性小分子發(fā)生接枝反應(yīng)，可加強(qiáng)或賦予殼聚糖的多功能輔料特性[4]. 孫萍等[5]認(rèn)為在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入羧甲基，增加了產(chǎn)物的水溶性，從而增大了其使用的范圍. 金曉曉等[6]制備了殼聚糖縮檸檬醛席夫堿，然后對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該產(chǎn)物含有的席夫堿與檸檬醛具備協(xié)同抗菌作用，使其活性高于殼聚糖，但因產(chǎn)物僅溶于酸性溶液，故應(yīng)用受到了限制. 李紅霞等[7]以O(shè)-羧甲基殼聚糖為原料，經(jīng)過與不同醛類衍生物發(fā)生席夫堿反應(yīng)，制得一系列具有良好水溶性和pH敏感性的潛在聚合物膠束材料. 據(jù)此，殼聚糖接枝羧甲基后，再引入活性脂溶性基團(tuán)所獲得的衍生物具有多種潛力.

本研究擬通過殼聚糖接枝羧甲基獲得O-羧甲基殼聚糖鈉鹽，使其具備更強(qiáng)的水溶性，并將該產(chǎn)物先后與檸檬醛、對(duì)羥基苯甲醛反應(yīng)，制得O-羧甲基殼聚糖鈉鹽席夫堿衍生物，然后考察終產(chǎn)物的表面活性和抗菌性能.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

殼聚糖(CS)，相對(duì)分子質(zhì)量5.0×104，去乙?；取?5%，浙江澳興生物；檸檬醛、對(duì)羥基苯甲醛和一氯乙酸均為化學(xué)純，阿拉丁試劑. 其他試劑均為化學(xué)純，購自國藥試劑.

LGJ-18B冷凍干燥機(jī)(北京松源華興)；Bruker Avance III 型(500MHz)核磁共振波譜儀(Bruker)；Vario Micro 元素分析儀(Elementar)；表面張力儀BZY-201(上海方瑞)；NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(上海昌吉).

1.2 合成及表征

1.2.1 O-羧甲基殼聚糖鈉鹽的合成(CMCNa)

參照CHEN等[8]的方法，改動(dòng)如下：1) 反應(yīng)溶劑(V(蒸餾水)∶V(異丙醇)=2∶8)增加至150 mL，減少溶液黏度，防止攪拌不均勻；2) 產(chǎn)物烘干后需研磨過篩用以除掉不能粉碎的凝膠狀顆粒，備用.

1.2.2 CMCNa縮檸檬醛席夫堿的合成(CMCCNa)

參照J(rèn)IN等[6]的方法，改動(dòng)如下：1) 由O-羧甲基殼聚糖鈉鹽和檸檬醛參與反應(yīng)；2) 反應(yīng)在恒溫磁力攪拌器中進(jìn)行；3) 殼聚糖氨基和檸檬醛的物質(zhì)的量比為1∶3，反應(yīng)時(shí)間為4 h，最后獲得淡黃色CMCCNa，合成路線如圖1所示.

圖1 羧甲基殼聚糖鈉鹽席夫堿衍生物合成路線圖Fig.1 Synthesis of carboxymethyl chitosan sodium Schiff’s base

1.2.3 CMCCNa縮對(duì)羥基苯甲醛席夫堿的合成(CMCCPNa)

參照J(rèn)IN等[6]的方法，改動(dòng)如下：1)由CMCCNa和對(duì)羥基苯甲醛參與反應(yīng)；2)采用恒溫磁力攪拌器為反應(yīng)裝置；3)殼聚糖氨基和對(duì)羥基苯甲醛的物質(zhì)的量比為1∶1.5，反應(yīng)時(shí)間依次為1、2、3和4 h，最后獲得黃色CMCCPNa(依次編號(hào)為CMCCPNa-1、2、3、4)，合成反應(yīng)如圖1所示.

1.3 基本性能測試

1.3.1 HLB值測試

準(zhǔn)確稱取一系列產(chǎn)物各0.5 g，分別置于50 mL比色管中，于25 ℃下采用水?dāng)?shù)法[9]進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值.

1.3.2 乳化性能、表面張力(γ)與臨界膠束濃度(CMC)測試

[9]的方法進(jìn)行乳化性能測試，以乳化層占整個(gè)液體的體積分?jǐn)?shù)來衡量產(chǎn)物的乳化能力.

參考文獻(xiàn)[10]將樣品溶解然后稀釋獲得一系列濃度，靜置1 d保證其完全溶解，于(25±0.1) ℃下采用吊片法進(jìn)行CMC和表面張力測試. 反復(fù)沖洗吊片及容器避免干擾.

1.3.3 抗菌能力測試[10-11]

配制一系列產(chǎn)物的母液，濃度為1×104mg/L. 選用LB作為培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基和母液均在121 ℃熱壓滅菌20 min. 選取大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為試驗(yàn)菌株，菌株須進(jìn)行培養(yǎng)活化，活化后菌液濃度需與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘?duì)，使約為108CFU/mL，備用.

采用倍半稀釋法用培養(yǎng)基對(duì)各母液進(jìn)行稀釋，分別加入10 μL濃度為105～106CFU/mL的菌液，37 ℃搖床增殖1 d，以LB培養(yǎng)基(含對(duì)應(yīng)濃度的樣品未加菌液)作參照，測定中性條件下其在600 nm的吸光值. MIC確定依據(jù)：該濃度的吸光值是相鄰低濃度的吸光值的100倍以上并且溶液呈澄清透明. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

CMCNa、CMCCNa和CMCCPNa-1的1H NMR譜圖見圖2，其中δ4.79為D2O峰. 參考文獻(xiàn)[5-6]的數(shù)據(jù)可知，δ1.19～2.2屬于檸檬醛的CH3和CH2的吸收峰，δ2.06屬于殼聚糖單體-COCH3的吸收峰，δ2.73屬于殼聚糖單體上的N-CH2-COONa的吸收峰、δ3.40屬于殼聚糖單體上的N-CH2-COOD的吸收峰，δ3.6～3.9分別是殼聚糖單體上的H3～6的吸收峰，δ3.95～4.58屬于殼聚糖單體上的C-O-CH2-COOD的吸收峰，δ5.20屬于檸檬醛上的CH=C吸收峰，δ8.28～8.46屬于CH=N亞胺鍵的吸收峰，δ6.78～7.79屬于Ar-H的吸收峰. 上述數(shù)據(jù)顯示，羧甲基已經(jīng)接枝到殼聚糖單體的C6羥基上，但也有部分C2氨基發(fā)生了反應(yīng)，未反應(yīng)的氨基分別與檸檬醛、對(duì)羥基苯甲醛繼續(xù)發(fā)生了席夫堿反應(yīng)最終生成O-羧甲基殼聚糖鈉鹽縮檸檬醛縮對(duì)羥基苯甲醛席夫堿CMCCPNa，因此目標(biāo)產(chǎn)物成功合成.

圖2 CMCNa(a)、CMCCNa(b)和CMCCPNa(c)的核磁氫譜Fig.2 1H NMR spectra of CMCNa (a), CMCCNa(b) and CMCCPNa(c) in D2O

2.2 產(chǎn)物的元素分析

通過元素分析獲得化合物中C、N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，接著根據(jù)C/N比值與樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)中的重復(fù)單元，根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法對(duì)合成物的取代度進(jìn)行計(jì)算，分析數(shù)據(jù)如表1所示. 表1數(shù)據(jù)顯示，殼聚糖的去乙酰化度為93.75%，較標(biāo)簽注明的95%小，這大概是測試系統(tǒng)誤差引起的. CMCNa的中羧甲基取代度達(dá)到了64.17%，CMCCNa中檸檬醛的取代程度為18.20%. 此外，因殼聚糖氨基與芳醛的席夫堿反應(yīng)容易進(jìn)行，形成的席夫堿衍生物較為穩(wěn)定. 本研究通過降低投料比和限制反應(yīng)時(shí)間，防止親脂性基團(tuán)大量引入而影響產(chǎn)物水溶性，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，CMCCNa與對(duì)羥基苯甲醛的席夫堿反應(yīng)逐漸增加，CMCCPNa的取代度逐漸增加，由15.00%增至34.67%.

表1 樣品元素分析結(jié)果Table 1 Elemental analysis results of samples

注：DS為取代程度.

2.3 產(chǎn)物的HLB值

通過水?dāng)?shù)法測定CMCCNa和CMCCPNa的HLB值，數(shù)據(jù)如表2所示. 其中CMCCNa的HLB值為14.93，而CMCCPNa隨著取代度的增加，其HLB值不斷減小，這可能是引入的疏水性對(duì)羥基苯甲醛導(dǎo)致的. 但CMCCPNa的HLB值均大于8，在13.83～14.68之間，表現(xiàn)出良好的水溶性，因此該產(chǎn)物的合成將有利于擴(kuò)大殼聚糖使用范圍. 參照文獻(xiàn)[13]可知，HLB值不同則用途也不同，因此CMCCPNa有望作為潤濕劑、乳化劑等附加劑使用.

表2 CMCCNa和CMCCPNa的HLB值Table 2 Hydrophile-lipophile balance of CMCCNa and CMCCPNa

2.4 臨界膠束濃度(CMC)與表面張力(γ)分析

圖3所示為CMCCNa和CMCCPNa水溶液的表面張力隨濃度的變化曲線. 由圖3可知，兩種產(chǎn)物均可使表面張力減小，且濃度增加，與之對(duì)應(yīng)的表面張力則逐漸減小，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后，溶液的γ值出現(xiàn)拐點(diǎn)，此后數(shù)值變化比較平緩，該轉(zhuǎn)折點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度即為CMC，CMCCNa和CMCCPNa-1-4的CMC依次為2.54×10-2、2.27×10-2、2.06×10-2、1.87×10-2和1.69×10-2g/L，該濃度對(duì)應(yīng)的表面張力值分別為64.7、60.8、59.1、58.2、57.0 mN/m. CMCCPNa降低表面張力的程度略大于CMCCNa，表現(xiàn)出較強(qiáng)的表面活性，CMCCPNa的CMC低于CMCCNa，這可能是由于前者引入了更多的脂溶性基團(tuán)，從而具備更強(qiáng)的疏水性，傾向于在較低濃度就可形成膠束.

圖3 CMCCNa和CMCCPNa的表面張力—濃度曲線圖Fig.3 Plot of the surface tension vs the concentration of CMCCNa and CMCCPNa

2.5 乳化能力分析

圖4為CMCCNa和CMCCPNa的乳化能力隨時(shí)間的變化曲線. 圖4所示的五種產(chǎn)物中，乳化層體積在開始時(shí)最高可達(dá)75.4%，一段時(shí)間后乳化層的體積在44%～52%之間保持穩(wěn)定，可見上述產(chǎn)物均具有一定的乳化能力. CMCCPNa的乳化能力較CMCCNa強(qiáng)，這說明對(duì)羥基苯甲醛的引入可以提高產(chǎn)物的乳化能力，其中又以CMCCPNa-4的乳化能力最強(qiáng).

圖4 CMCCNa和CMCCPNa的乳化能力圖Fig.4 Emulsifying ability of CMCCNa和CMCCPNa

2.6 產(chǎn)物的抗菌能力分析

通過常量肉湯稀釋法測定產(chǎn)物的MIC值，數(shù)據(jù)如表3所示. MIC越小，證明該物質(zhì)的抑菌活性越強(qiáng). 因此由表3中可知，CMCCNa的抗菌能力遠(yuǎn)較CMCNa強(qiáng)，這可能是因?yàn)榍罢呓又α藱幟嗜┻@一脂溶性抗菌活性基團(tuán)[6,11]. 而CMCCPNa的抗菌能力又比CMCCNa強(qiáng)，這可能是因?yàn)镃MCCPNa通過席夫堿反應(yīng)，接枝了具有抗菌活性對(duì)羥基苯甲醛[14]，起到對(duì)羥基苯甲醛固載和釋放的作用，這使得產(chǎn)物的抗菌活性增強(qiáng)，并隨著取代程度的增加，對(duì)羥基苯甲醛接枝增加，從而提高了產(chǎn)物的抗菌能力. 此結(jié)果表明，CMCCNa和CMCCPNa均具有作為抑菌劑的潛力.

表3 羧甲基殼聚糖鈉鹽及其席夫堿衍生物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值(mg/L)Table 3 Minimum inhibitory concentration of CMCNa and its Schiff’s base derivatives against Escherichia coli and Staphylococcus aureus (mg/L)

3 結(jié)論

以殼聚糖為原料，先后進(jìn)行取代反應(yīng)和二次席夫堿反應(yīng)制得O-羧甲基殼聚糖鈉鹽縮檸檬醛縮對(duì)羥基苯甲醛席夫堿. HLB值測試表明產(chǎn)物的HLB值在13.83～14.93之間，具有良好水溶性；MIC測試表明CMCCNa和CMCCPNa均具備一定的抗菌能力，并隨取代程度增加抗菌活性增強(qiáng)，其中CMCCPNa-4對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為7.8和3.9 mg/L. 據(jù)此，CMCCPNa同時(shí)具備水溶、表面活性和抗菌等特性，有望成為一種多功能的材料用于日用品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域. 可見，對(duì)殼聚糖進(jìn)行水溶性結(jié)構(gòu)改造，然后根據(jù)用途，采用席夫堿反應(yīng)引入不同特性的醛類化合物是一種簡便可行的設(shè)計(jì)思路.

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PreparationandperformanceofSchiffbasesfromO-carboxymethylchitosansodium,citralandp-hydroxybenzaldehyde

GUO Youhong*, LIN Shuisen, XIE Zhixin, XIE Nana, CHEN Jianxiong

(DepartmentofPharmacy,QuanzhouMedicalCollege,QuanZhou362000,Fujian,China)

Schiff’s base of carboxymethyl chitosan sodium was synthesized by the reaction of carboxymethyl chitosan sodium with citral andp-hydroxy benzaldehyde successively. The structure of these Schiff’s base derivatives were characterized by1H NMR and EA. It showed that the amino groups in carboxymethyl chitosan were reacted with citral andp-hydroxy benzaldehyde to form the Schiff’s base derivatives. The HLB value, surface tension, emulsifying ability and antibacterial properties of the products were also investigated. The results showed that these water-soluble products have potential as polymeric surfactant with macromolecular antimicrobial.

chitosan; Schiff’s base; citral; bacteriostat; polymeric surfactant

O636.9

A

1008-1011(2017)05-0628-05

2017-07-19.

泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Z58), 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?！皣夜歉稍盒＝ㄔO(shè)”重點(diǎn)資助科研項(xiàng)目(XJ1303).

郭幼紅(1966-), 女, 副教授, 研究方向?yàn)榇蠓肿踊瘜W(xué)改性與應(yīng)用.*

, E-mail:93864575@qq.com.

[責(zé)任編輯：吳文鵬]